常見(jiàn)的生化與分子生物學(xué)技術(shù)課件

常見(jiàn)的生化與分子生物學(xué)技術(shù)1完整版課件ppt常見(jiàn)的生化與分子生物學(xué)技術(shù)1完整版課件ppt生物大分子的提取和純化電泳技術(shù)PCR技術(shù)核酸序列的測(cè)定蛋白質(zhì)相互作用AgrosePAGE雙向電泳雜交技術(shù)酶聯(lián)免疫技術(shù)層析技術(shù)、超濾技術(shù)、膜技術(shù)

檢測(cè)和純化2完整版課件ppt生物大分子的提取和純化電泳技術(shù)PCR技術(shù)核酸序列的測(cè)定蛋白質(zhì)分離生命現(xiàn)象生化組分分析1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)2、功能3、代謝及其細(xì)胞調(diào)控改造利用生物化學(xué)研究技術(shù)方法經(jīng)典的研究步驟：分離生化組分（細(xì)胞器和生物分子）；分析生化組分的結(jié)構(gòu)；分析生化組分的功能和代謝（合成與分解）及其相互作用。2022/12/133完整版課件ppt分離生命現(xiàn)象生化組分分析1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)改造利用生物化學(xué)研究技生物化學(xué)研究技術(shù)方法生物化學(xué)研究技術(shù)：分離技術(shù)：沉淀、吸附、膜分離（過(guò)濾、透析等）、離心、層析、電泳等；分析檢測(cè)技術(shù)：電泳、層析、光譜、質(zhì)譜、電化學(xué)技術(shù)、分子標(biāo)記等。分子生物學(xué)研究技術(shù)：基因重組、分子雜交、PCR與反轉(zhuǎn)錄、核酸測(cè)序、免疫技術(shù)、生物芯片等等。2022/12/144完整版課件ppt生物化學(xué)研究技術(shù)方法生物化學(xué)研究技術(shù)：2022/11/304生物大分子分離純化的一般步驟和原則

層析法電泳法超離心法透析和超濾鹽析（硫酸銨鹽析）等點(diǎn)電沉淀有機(jī)溶劑沉淀離心│←前處理→│←粗分級(jí)→│←細(xì)分級(jí)→│材料選擇與處理細(xì)胞破碎（機(jī)械破碎、溶賬和自溶、酶解、化學(xué)處理）生物組織→→提取液→

→粗產(chǎn)品→→結(jié)晶分子大小溶解度電荷性質(zhì)吸附性質(zhì)生物親和力依據(jù)原理5完整版課件ppt生物大分子分離純化的一般步驟和原則

層析法鹽析（硫酸銨要了解的生物大分子的物理、化學(xué)性質(zhì)主要有：在水和各種有機(jī)溶劑中的溶解性。在不同溫度、pH值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性。固態(tài)時(shí)對(duì)溫度、含水量和凍干時(shí)的穩(wěn)定性。各種物理性質(zhì)：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場(chǎng)中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹(shù)脂等填料中的分配系數(shù)。其他化學(xué)性質(zhì)：如對(duì)各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對(duì)各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性。對(duì)其他生物分子的特殊親和力。6完整版課件ppt要了解的生物大分子的物理、化學(xué)性質(zhì)主要有：6完整版課件ppt分離純化的一般程序

1、材料的選擇和預(yù)處理

2、破碎細(xì)胞及提?。ㄓ袝r(shí)還需要進(jìn)行細(xì)胞器的分離）

3、分離純化：包括粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離其中前兩個(gè)階段為生物大分子分離純化的前處理。7完整版課件ppt分離純化的一般程序1、材料的選擇和預(yù)處理7完整版課件ppt生物大分子的濃縮沉淀法:在提取液中加入適量的中性鹽或有機(jī)溶劑，使有效的成分變?yōu)槌恋?，?jīng)過(guò)離心或過(guò)濾收集的沉淀物，加少量緩沖液溶解后，在經(jīng)離心出去不溶物，獲得的上清液通過(guò)透析或凝膠過(guò)濾脫鹽。鹽析法：有機(jī)溶劑沉淀法；等電點(diǎn)沉淀法；非離子多聚體沉淀法；生成鹽復(fù)合物沉淀法；熱變性沉淀法；酸堿變性沉淀法等。

吸附法：將干葡聚糖凝膠加入提取液中，由于凝膠吸水，提取液的體積可縮小三倍左右。8完整版課件ppt生物大分子的濃縮沉淀法:在提取液中加入適量的中性鹽或有機(jī)溶劑超過(guò)濾法：把提取液裝入過(guò)濾裝置，在空氣或氮?dú)獾膲毫ο拢剐》肿游镔|(zhì)通過(guò)半透膜，大分子物質(zhì)留在膜內(nèi)。透析濃縮法減壓蒸餾濃縮法：將提取液裝入減壓蒸餾裝置中，在減壓真空狀態(tài)下進(jìn)行蒸餾。冰凍干燥法9完整版課件ppt超過(guò)濾法：把提取液裝入過(guò)濾裝置，在空氣或氮?dú)獾膲毫ο拢剐〖兌辱b定生物大分子經(jīng)過(guò)分離提純，最后還要鑒定制品的純度。蛋白質(zhì)和酶制品純度鑒定通常采用的方法有：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、超速離心沉降分析法等。純的蛋白質(zhì)在一定條件下進(jìn)行電泳，將以單一的速度移動(dòng)，它的電泳圖譜只出現(xiàn)一條帶。同樣純的蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中，應(yīng)以單一的沉降速度移動(dòng)。選用任何單獨(dú)一種鑒定方法都不能最后確定蛋白質(zhì)的純度，必須同時(shí)采用2-3種不同的方法才能確定。10完整版課件ppt純度鑒定生物大分子經(jīng)過(guò)分離提純，最后還要鑒定制品的純度。10蛋白質(zhì)、核酸的定性定量檢測(cè)1、蛋白質(zhì)的測(cè)定凱氏定氮法（含N量

6.

25）雙縮脲法、Folin-酚法紫外光度法（max=280nm）離心法、電泳法、層析法2、酶活力的測(cè)定終點(diǎn)法、動(dòng)力學(xué)法3、氨基酸的測(cè)定茚三酮法

Sangerf法、Edmam法、DNS法4、核酸的測(cè)定紫外光度法（max=260nm）分子雜交法離心法、電泳法11完整版課件ppt蛋白質(zhì)、核酸的定性定量檢測(cè)1、蛋白質(zhì)的測(cè)定凱氏定氮核酸的純度鑒定一般采用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280）等方法。同蛋白質(zhì)一樣，核酸純度鑒定也必須采用2-3種方法才能確定。12完整版課件ppt核酸的純度鑒定一般采用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳，沉降分電泳基本原理電泳是不同的物質(zhì)顆粒在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，由于所帶電荷及顆粒大小形狀等不同，因此向相反電極泳動(dòng)速度不同進(jìn)而達(dá)到分離目的一種方法。在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類(lèi)和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。13完整版課件ppt電泳基本原理電泳是不同的物質(zhì)顆粒在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，由于所帶電泳帶電粒子或分子的大小、形狀、所帶的凈電荷多少等都會(huì)影響它們的電泳速度。待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等存在的差異，使得帶電分子的“泳動(dòng)”速度不同，因而可以利用電泳技術(shù)對(duì)生物分子進(jìn)行分離、鑒定或純化。電泳技術(shù)有多種方式，但一般根據(jù)有無(wú)支持物將其分為無(wú)支持物的自由電泳和有支持物的區(qū)帶電泳兩大類(lèi)。區(qū)帶電泳包括以濾紙作為支持物的紙電泳、以醋酸纖維素等薄膜為支持物的薄層電泳，以及與凝膠（例如瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠）為支持物的凝膠電泳。等電聚焦凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、二維電泳、脈沖場(chǎng)凝膠電泳。14完整版課件ppt電泳帶電粒子或分子的大小、形狀、所帶的凈電荷多少等都會(huì)影響它影響泳動(dòng)度的因素：1.電場(chǎng)強(qiáng)度：電場(chǎng)強(qiáng)度是指每厘米的電位降，也稱電位梯度(電勢(shì)梯度)。電場(chǎng)強(qiáng)度越高，則帶電顆粒泳動(dòng)越快。2.溶液pH為使電泳時(shí)pH值恒定，必須采用緩沖液作為電極液，溶液的pH值決定帶電顆粒的解離程度，亦即決定其所帶電荷的多少。3.離子強(qiáng)度（I）溶液的I越高，質(zhì)點(diǎn)的泳動(dòng)速度越慢，但區(qū)帶分離度卻較清晰。15完整版課件ppt影響泳動(dòng)度的因素：15完整版課件ppt4.電滲電泳緩沖液相對(duì)于固體支持物的移動(dòng)稱電滲。如紙電泳時(shí)，濾紙吸附OH-離子帶負(fù)電荷，與紙接觸的緩沖液帶正電荷向負(fù)極移動(dòng)，會(huì)對(duì)顆粒的移動(dòng)造成不良影響，故電泳時(shí)，電滲小些為好5.溫度電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生焦耳熱，使介質(zhì)粘度下降，分子運(yùn)動(dòng)加快，遷移率增加，同時(shí)溫度過(guò)高會(huì)使樣品中的生物大分子變性失活，因此電泳時(shí)，要控制電壓或電流，也可安裝冷卻散熱裝置。6.支持物現(xiàn)代電泳多在固體支持物上進(jìn)行，使樣品中的不同組分形成不同的區(qū)帶，稱區(qū)帶電泳。電泳結(jié)束后，支持物可以方便地進(jìn)行染色等后續(xù)處理。16完整版課件ppt4.電滲16完整版課件ppt電泳技術(shù)分類(lèi)按電泳的原理來(lái)分，可分為四種：區(qū)帶電泳：電泳過(guò)程中，不同的離子成分在均一的緩沖液體系中分離成獨(dú)立的區(qū)帶，這是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的電泳技術(shù)。移界電泳：是Tiselius最早建立的電泳，它是在U形管中進(jìn)行的，由于分離效果較差，已為其他電泳技術(shù)所取代。等速電泳：需專用電泳儀，當(dāng)電泳達(dá)到平衡后，各組分的區(qū)帶相隨并形成清晰的界面，并以等速移動(dòng)。等電聚焦：具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)中自動(dòng)形成pH梯度，使被分離物移動(dòng)至各自等電點(diǎn)pH處聚集成很窄的區(qū)帶，且分辨率較高。（表面看與區(qū)帶電泳相似，但原理不同）17完整版課件ppt電泳技術(shù)分類(lèi)按電泳的原理來(lái)分，可分為四種：17完整版課件ppDNA的瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳對(duì)核酸的分離作用主要依據(jù)它們的相對(duì)分子質(zhì)量及分子構(gòu)型，同時(shí)與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系DNA分子的大?。涸谀z中，DNA片段遷移距離(遷移率)與堿基對(duì)的對(duì)數(shù)成反比，因此通過(guò)已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離進(jìn)行比較，便可測(cè)出未知片段的大小。但是當(dāng)DNA分子大小超過(guò)20kb時(shí)，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開(kāi)。此時(shí)電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時(shí)，分子大小不宜超過(guò)此值。瓊脂糖的濃度：不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。18完整版課件pptDNA的瓊脂糖凝膠電泳：18完整版課件ppt2.瓊脂糖凝膠電泳核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗矁r(jià)閉環(huán)DNA（cccDNA）＞直線DNA＞開(kāi)環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA當(dāng)瓊脂糖濃度太高時(shí)，環(huán)狀DNA（一般為球形）不能進(jìn)入膠中，相對(duì)遷移率為0（Rf=0），而同等大小的直線雙鏈DNA(剛性棒狀)則可以長(zhǎng)軸方向前進(jìn)（Rf＞0），由此可見(jiàn)，這3種構(gòu)型的相對(duì)遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時(shí)，也受到電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度等的影響。

19完整版課件ppt2.瓊脂糖凝膠電泳核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系19完聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱Bis）在加速劑和催化劑的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡(jiǎn)稱PAGE）。20完整版課件ppt聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱Acr聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點(diǎn)：在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好?；瘜W(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定。幾乎無(wú)電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好。樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g。凝膠孔徑可通過(guò)選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)。分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。21完整版課件ppt聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點(diǎn)：21完整版課件ppt聚丙烯酰胺凝膠于瓊脂糖凝膠的不同之處：分離范圍不同

瓊脂糖凝膠電泳分離分子量比較大的物質(zhì)，尤其是核酸；聚丙烯酰胺凝膠分離分子量較小的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)，氨基酸等。凝膠配置程序不同瓊脂糖凝膠在緩沖液中加熱融化，在凝固前到入槽中即可；聚丙烯酰胺凝膠在配置時(shí)還要加多種成分，并且對(duì)聚合溫度也有一定的要求，否則會(huì)影響凝膠孔徑的大小。凝膠的厚度不同瓊脂糖凝膠最薄只能達(dá)到３ｍｍ；聚丙烯酰胺凝膠可以制成０.２ｍｍ，分辨率高。成本不同。瓊脂糖價(jià)格便宜；聚丙烯酰胺凝膠價(jià)格較高安全性不同。瓊脂糖沒(méi)有毒性；聚丙烯酰胺凝膠有毒性22完整版課件ppt聚丙烯酰胺凝膠于瓊脂糖凝膠的不同之處：22完整版課件ppt凝膠聚合的原理及有關(guān)特性催化系統(tǒng)常用有兩種：過(guò)硫酸氨—TEMED化學(xué)催化聚合系統(tǒng)此系統(tǒng)中，四甲基乙二胺（TEMED）稱為加速劑，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使過(guò)硫酸氨（APS，引發(fā)劑）形成自由基。這些自由基的產(chǎn)生可以引發(fā)丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的交聯(lián)反應(yīng)，形成具有一定孔徑的聚丙烯酰胺凝膠。核黃素—TEMED光聚合催化系統(tǒng)此系統(tǒng)中，核黃素經(jīng)紫外線光解形成無(wú)色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系統(tǒng)主要用用于大孔濃縮膠的配置。23完整版課件ppt凝膠聚合的原理及有關(guān)特性23完整版課件ppt凝膠聚合的原理及有關(guān)特性影響凝膠聚合的因素AP、核黃素、TEMED：是凝膠聚合不可缺少的試劑，AP應(yīng)在干燥、避光的條件下保存，其水溶液應(yīng)置棕色瓶中，4℃冰箱貯存，一般僅能存放一周。TEMED（液狀）應(yīng)密閉貯于4℃冰箱中。增加AP和TEMED可加快聚合速率，但過(guò)量的AP和TEMED會(huì)引起電泳時(shí)燒膠和譜帶變形。應(yīng)選擇合適的配方使聚合在40-60min內(nèi)完成。pH：堿性條件下聚合快，但堿性過(guò)強(qiáng)時(shí)膠硬而脆，需高pH時(shí)應(yīng)減少AP和TEMED用量，制酸性膠可加AgNO3等促進(jìn)聚合。溫度：溫度高聚合快，但高濃度凝膠聚合時(shí)易產(chǎn)生小氣泡，低溫(5℃)聚合凝膠會(huì)變得脆而混濁，一般25-35℃聚合較好。氧分子：氧分子阻礙凝膠聚合，故不含SDS的凝膠最好先抽真空脫氣，再加引發(fā)劑。24完整版課件ppt凝膠聚合的原理及有關(guān)特性24完整版課件pptPAGE原理PAGE據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類(lèi)。連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷及分子篩效應(yīng)；不連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，故分離效果更好。不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)，利用凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子的不連續(xù)性、PH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性，使樣品在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮成很薄的起始區(qū)帶，然后進(jìn)行分離。25完整版課件pptPAGE原理25完整版課件ppt聚丙烯酰胺凝膠分為非變性凝膠和變性凝膠兩種。所謂變性凝膠，即在凝膠中加入變性劑，如尿素、SDS(十二烷基磺酸鈉)、巰基乙醇、DTT等。這些變性劑可以破壞或改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，把絕大部分蛋白質(zhì)分離成組成它們的亞基。同時(shí)在蛋白質(zhì)分子周?chē)鼑舜罅控?fù)電荷。這種電荷基本上掩蓋了無(wú)變性劑存在時(shí)正常就有的任何電荷。由于SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負(fù)電荷，因而可利用Mr差異將各種蛋白質(zhì)分開(kāi)。在蛋白質(zhì)溶解液中，加入SDS和疏基乙醇，巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，使多肽分成單個(gè)亞單位。26完整版課件ppt聚丙烯酰胺凝膠分為非變性凝膠和變性凝膠兩種。26完整版課件p膜分離基本技術(shù)

膜分離與常規(guī)的分離技術(shù)相比具有無(wú)相變化、能耗低、過(guò)程簡(jiǎn)單、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)特別適用于生物物質(zhì)、酶制劑及同分異構(gòu)體等的分離。2022/12/127膜縱切面模式圖27完整版課件ppt膜分離基本技術(shù)膜分離與常規(guī)的分離技術(shù)相比2022/11/3以分離應(yīng)用領(lǐng)域過(guò)程分類(lèi)

微濾(micro-filtration,MF)

超濾(untra-filtration,UF)

反滲透(reverseosmosis,RO)

透析(Dialysis,DS)

電透析(electro-dialysis,ED)

納米膜分離(NF)

親和過(guò)濾(affinityfiltration,AF)

滲透氣化(pervaporation,PV28完整版課件ppt以分離應(yīng)用領(lǐng)域過(guò)程分類(lèi)28完整版課件ppt

膜分離基本技術(shù)膜分離過(guò)程的推動(dòng)力是靜壓差、濃度差或者電位差，有的分離過(guò)程可能是幾種推動(dòng)力都兼而有之。膜在分離過(guò)程中有三種功能：物質(zhì)的識(shí)別與透過(guò)，這是使混合物各組分之間實(shí)現(xiàn)分離的內(nèi)在因素界面作用，以膜為界面將透過(guò)液和保留液分為互不混合的兩相反應(yīng)場(chǎng)作用，膜表面及孔內(nèi)表面含有與特性溶質(zhì)有相互作用能力的官能團(tuán)，通過(guò)物理作用、化學(xué)反應(yīng)或生化反應(yīng)提高膜分離的選擇性和分離速度。2022/12/1生命科學(xué)學(xué)院292022/12/129生命科學(xué)學(xué)院29完整版課件ppt膜分離基本技術(shù)膜分離過(guò)程的推動(dòng)力是靜壓差、濃度差或者電位分離膜分離膜應(yīng)具備的基本條件為：好的選擇透過(guò)性；良好的分離性能（即截留率高，透過(guò)率大）；理化性能良好；污染小，使用壽命長(zhǎng)；價(jià)廉易得。各種分離膜按所使用的材質(zhì)不同可分為無(wú)機(jī)材料膜和有機(jī)材料膜。無(wú)機(jī)材料膜有陶瓷膜和不銹鋼膜，有機(jī)膜多為合成高分子材料膜，主要有纖維素類(lèi)、聚礬類(lèi)、聚烯烴類(lèi)、聚酞胺類(lèi)和芳香雜環(huán)類(lèi)等。2022/12/1生命科學(xué)學(xué)院302022/12/130生命科學(xué)學(xué)院30完整版課件ppt分離膜2022/11/30生命科學(xué)學(xué)院302022/11/3膜分離基本技術(shù)分離膜分離膜的性能參數(shù)主要有：孔道特征、滲透通量、截留率和截留相對(duì)分子質(zhì)量等?？椎捞卣靼讖酱笮?，孔徑大小用最大孔徑和平均孔徑來(lái)描述孔徑分布，孔徑分布指各種孔徑的孔占全部孔的體積分?jǐn)?shù)?？紫堵?，孔隙率是指孔體積占膜總體積的百分?jǐn)?shù)。2022/12/1生命科學(xué)學(xué)院312022/12/131生命科學(xué)學(xué)院31完整版課件ppt膜分離基本技術(shù)分離膜2022/11/30生命科學(xué)學(xué)院3120透析和超濾

透析是利用蛋白質(zhì)等生物大分子不能透過(guò)半透膜，但小分子物質(zhì)和離子能夠通過(guò)而進(jìn)行純化的一種方法。這種方法經(jīng)常被用于去除大分子溶液中的小分子物質(zhì)。超濾對(duì)透析原理進(jìn)行了改進(jìn)，它利用具有一定大小孔徑的微孔濾膜，在常壓、加壓或減壓條件下對(duì)生物大分子溶液進(jìn)行過(guò)濾，使大分子保留在超濾膜上面的溶液中，小分子物質(zhì)及水過(guò)濾出去，從而達(dá)到脫鹽、濃縮或更換緩沖液的目的。32完整版課件ppt透析和超濾透析是利用蛋白質(zhì)等生物大分子不能透過(guò)半透膜，但小33完整版課件ppt33完整版課件ppt透析方法示意圖34完整版課件ppt透析方法示意圖34完整版課件ppt沉淀與離心沉淀是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在特定條件下溶解性不同而對(duì)它們進(jìn)行選擇性沉淀從而達(dá)到分離目的的一種粗純化方法。它通常用于將目的蛋白從大體積的粗抽取物中沉淀出來(lái)。這種方法既能除去許多雜質(zhì)，又有濃縮之效。實(shí)現(xiàn)選擇性沉淀的方法有改變pH或改變離子強(qiáng)度或者加入特殊的化合物。無(wú)論是哪一種沉淀方法，產(chǎn)生的沉淀物都需要借助于離心的手段與上清分開(kāi)。離心方法是根據(jù)分子的特征密度來(lái)分離大分子。如果一種顆粒的密度大于其介質(zhì)溶液的密度，那么這種顆粒有可能通過(guò)溶液發(fā)生沉降。顆粒沉降的速度與顆粒與介質(zhì)溶液之間的密度之差成正比。任何一種顆粒在離心力作用下通過(guò)溶液發(fā)生沉降。差速離心和密度梯度離心35完整版課件ppt沉淀與離心沉淀是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在特定條件下溶解性不同而對(duì)它們36完整版課件ppt36完整版課件ppt離心機(jī)的使用高速與超速離心機(jī)因其轉(zhuǎn)速高，產(chǎn)生的離心力大，使用不當(dāng)或缺乏定期的檢修和保養(yǎng)，都可能發(fā)生嚴(yán)重事故，因此使用離心機(jī)時(shí)都必須嚴(yán)格遵守操作規(guī)程：使用各種離心機(jī)時(shí)，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，平衡時(shí)重量之差不得超過(guò)各離心機(jī)說(shuō)明書(shū)所規(guī)定的范圍。裝載溶液時(shí)，要根據(jù)各種離心機(jī)的具體操作說(shuō)明進(jìn)行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，嚴(yán)禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。每次使用后，必須仔細(xì)檢查轉(zhuǎn)頭，及時(shí)清洗、擦干，轉(zhuǎn)頭是離心機(jī)中須重點(diǎn)保護(hù)的部件，搬動(dòng)時(shí)要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉(zhuǎn)頭長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)，要涂上一層上光臘保護(hù)。2022/12/1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3737完整版課件ppt離心機(jī)的使用高速與超速離心機(jī)因其轉(zhuǎn)速高，產(chǎn)生的離心力大，層析技術(shù)是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)(分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等)的不同，使各組分以不同程度分布在固定相和流動(dòng)相中，當(dāng)流動(dòng)相流過(guò)固定相時(shí)，各組分以不同的速度移動(dòng)，而達(dá)到分離的技術(shù)。層析技術(shù)操作簡(jiǎn)便，樣品可多可少，既可用于實(shí)驗(yàn)室的研究工作，又可用于工業(yè)生產(chǎn)，還可與其他分析儀器配合，組成各種自動(dòng)分析儀器。

38完整版課件ppt層析技術(shù)是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)(分子的形層析層析法又被稱為色譜。所有的層析系統(tǒng)都由兩相組成：一個(gè)是固定相，它可以是固體物質(zhì)，也可以是固定在固體物質(zhì)上的成分；另一個(gè)是由可以流動(dòng)的物質(zhì)組成的流動(dòng)相，如水和各種溶劑。當(dāng)待分離樣品隨著流動(dòng)相通過(guò)固定相時(shí)，各組份在理化性質(zhì)上的差別使得各自與兩相發(fā)生相互作用（如吸附、溶解或結(jié)合等）的能力不同，最終導(dǎo)致它們?cè)趦上嘀械姆峙洳煌?，而且隨著流動(dòng)相向前移動(dòng)，各組份會(huì)不斷地在兩相中進(jìn)行再分配。與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)受到的阻力就越小，向前移動(dòng)的速度越快；反之，與固定相相互作用越強(qiáng)的組份，向前移動(dòng)速度越慢。經(jīng)過(guò)分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組份，從而達(dá)到分離各組份的目的。39完整版課件ppt層析層析法又被稱為色譜。所有的層析系統(tǒng)都由兩相組成：一個(gè)是固表1主要的層析方法及其原理名稱分離原理吸附層析各組份在作為固定相的固體吸附劑表面的吸附能力不同分配層析各組份在流動(dòng)相和靜止液相（固定相）中的分配系數(shù)不同離子交換層析固定相是離子交換樹(shù)脂，各組份因所帶電荷狀況不同與離子交換樹(shù)脂的親和力不同凝膠層析固定相為多孔凝膠，各組份的分子大小不同，因而在通過(guò)凝膠時(shí)受阻滯的程度不同疏水層析固定相為帶有強(qiáng)疏水基團(tuán)的樹(shù)脂，各組分的疏水性不同，導(dǎo)致其與樹(shù)脂的結(jié)合能力不同親和層析固定相只能與一種待分離組份專一結(jié)合，以此達(dá)到和無(wú)親和力的其它組份分離的目的40完整版課件ppt表1主要的層析方法及其原理名稱分離原理吸附層析各組份在作層析基本操作過(guò)程

裝置選擇上樣和洗脫結(jié)果檢測(cè)

上樣均一性洗脫裝置目的不同檢測(cè)方法不同活性檢測(cè)基質(zhì)均勻性柱層析的L/d比值41完整版課件ppt層析基本操作過(guò)程裝置選擇上樣和洗脫結(jié)果檢測(cè)上樣均一性洗脫裝置

不改變?nèi)軇w系

依靠液面的水位差產(chǎn)生的靜壓力致使洗脫液不斷流經(jīng)層析柱缺點(diǎn)：隨著溶液的流去，水位差也逐漸減小，流速也在變小。改善：蠕動(dòng)泵或恒流泵42完整版課件ppt洗脫裝置不改變?nèi)軇w系42完整版課件ppt

改變?nèi)軇┫到y(tǒng)

分級(jí)洗脫

在一個(gè)溶劑系統(tǒng)洗滌后，改用另一溶劑系統(tǒng)。缺點(diǎn)：蛋白質(zhì)和層析基質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度相差并不很大，溶劑系統(tǒng)的改變又不可能過(guò)細(xì)過(guò)密同一個(gè)洗脫級(jí)分中就可能含有兩種或兩種以上的蛋白質(zhì)，達(dá)不到分離純化的目的。遞減遞增pH陰離子交換樹(shù)脂陽(yáng)離子交換樹(shù)脂離子強(qiáng)度疏水層析離子交換層析43完整版課件ppt改變?nèi)軇┫到y(tǒng)分級(jí)洗脫遞減遞增pH陰離子交換樹(shù)脂陽(yáng)離子交

改變?nèi)軇┫到y(tǒng)

梯度洗脫

一種溶液以恒定的速度連續(xù)地進(jìn)入處于溫和攪拌的盛有另一種溶液的容器中，經(jīng)混合后的液體以同速度沉入層析柱作為洗脫液，在這樣所得到的洗脫液中一種溶液的濃度以線性梯度方式連續(xù)地發(fā)生改變。注意：梯度洗脫呈現(xiàn)一個(gè)峰，但有可能存在兩個(gè)性質(zhì)接近的蛋白質(zhì)。

性能未知樣品的蛋白質(zhì)分離：改變緩慢的梯度洗脫→若為單峰：分級(jí)洗脫44完整版課件ppt改變?nèi)軇┫到y(tǒng)梯度洗脫性能未知樣品的蛋白質(zhì)分離：44離子交換層析

45完整版課件ppt離子交換層析

45完整版課件ppt原理離子交換層析技術(shù)是以離子交換纖維素或以離子交換葡聚糖凝膠為固定相，以蛋白質(zhì)等樣品為移動(dòng)相，分離和提純蛋白質(zhì)、核酸、酶、激素和多糖等的一項(xiàng)技術(shù)。原理：利用物質(zhì)的電荷和層析載體的電荷間的相互作用，進(jìn)而達(dá)到分離純化的目的。46完整版課件ppt原理離子交換層析技術(shù)是以離子交換纖維素或以離子交換葡聚糖凝選擇離子交換劑的一般原則：根據(jù)所帶的電荷性質(zhì)。如帶正電荷，應(yīng)選擇陽(yáng)離子交換劑；如帶負(fù)電荷，應(yīng)選擇陰離子交換劑；如為兩性離子，根據(jù)其在穩(wěn)定pH范圍內(nèi)所帶電荷的性質(zhì)選擇。在分離生命大分子物質(zhì)時(shí)，選用親水性基質(zhì)的交換劑較為合適，它們對(duì)被分離物質(zhì)的吸附和洗脫都比較溫和，活性不易破壞。47完整版課件ppt選擇離子交換劑的一般原則：根據(jù)所帶的電荷性質(zhì)。如帶正電荷，應(yīng)離子交換樹(shù)脂的處理，再生等概念離子交換層析技術(shù)的應(yīng)用48完整版課件ppt離子交換樹(shù)脂的處理，再生等概念48完整版課件ppt離子交換樹(shù)脂分離氨基酸49完整版課件ppt離子交換樹(shù)脂分離氨基酸49完整版課件ppt分子篩示意圖50完整版課件ppt分子篩示意圖50完整版課件ppt親和層析示意圖51完整版課件ppt親和層析示意圖51完整版課件ppt親和層析

親和層析是利用生物分子間所具有的專一而又可逆的親和力而使生物分子分離純化的層析技術(shù)。具有專一而又可逆的親和力的生物分子是成對(duì)互配的。主要的有：酶和底物、酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、酶和輔酶、抗原與抗體、DNA和RNA、激素和其受體、DNA與結(jié)合蛋白等。在成對(duì)互配的生物分子中，可把任何一方作為固定相，而對(duì)樣品溶液中的另一方分子進(jìn)行親和層析，達(dá)到分離純化目的。例如，酶與其輔酶是成對(duì)互配的，既可把輔酶作為固定相，使樣品中的酶分離純化，也可把酶作為固定相，使樣品中的輔酶分離純化。

52完整版課件ppt親和層析52完整版課件ppt配基與偶聯(lián)凝膠的選擇與處理

在親和層析中，作為固定相的一方稱為配基(ligand)。配基必須偶聯(lián)于不溶性母體(matrix)(又稱載體或擔(dān)體)上，常用的載體主要有：瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、纖維素等。當(dāng)用小分子作為配基時(shí)，由于空間位阻不易與載體偶聯(lián)，或不易與配對(duì)分子載體結(jié)合。為此通常在載體和配基之間接入不同長(zhǎng)度的連接臂(spacearm)。偶聯(lián)時(shí)，必須首先使載體活化。即通過(guò)某種方法(如溴化氰法、疊氮法等)為載體引入某一活潑的基團(tuán)。53完整版課件ppt配基與偶聯(lián)凝膠的選擇與處理53完整版課件ppt親和層析的操作條件

親和柱層析裝柱方法與凝膠層析相同，層析操作與離子交換層析相似。但由于親和層析的對(duì)象都是生物分子，為防止生物大分子變性，常在低溫(4℃)下進(jìn)行。親和層析柱所用的平衡緩沖液應(yīng)與樣品緩沖液一致，pH一般在近乎中性的范圍內(nèi)。上柱時(shí)流速應(yīng)盡可能緩慢。上柱后，用大量平衡緩沖液洗去雜質(zhì)，然后用洗脫液洗脫親和物。洗脫結(jié)束后，繼續(xù)用洗脫液洗滌，直至無(wú)親和物為止。最后用平衡緩沖液使親和層析柱平衡，即可重復(fù)使用。暫時(shí)不用時(shí)，親和層析柱應(yīng)置于4℃低溫保存。

54完整版課件ppt親和層析的操作條件54完整版課件ppt蛋白質(zhì)研究方法假定你發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)X1.如何得到這種蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)的分離、純化技術(shù)2.這種蛋白質(zhì)的大?。浚⊿DS）3.它的pI是多少？（等電聚焦）4.其他細(xì)胞或其他生物體內(nèi)是否存在？

（Western印跡）5.其一級(jí)結(jié)構(gòu)如何？

（序列分析）6.其三維結(jié)構(gòu)又如何？

X-射線衍射和核磁共振55完整版課件ppt蛋白質(zhì)研究方法假定你發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)X55完整版課蛋白質(zhì)純化一、準(zhǔn)備工作：要解決三個(gè)問(wèn)題：（1）純化蛋白質(zhì)的目的；（2）目標(biāo)蛋白的測(cè)活方法；（3）純化蛋白質(zhì)的原料。二、純化步驟：（1）破碎細(xì)胞或組織（混合和勻漿）；（2）去除殘?jiān)x心）；（3）沉淀/濃縮（硫酸銨或聚乙二醇）；（4）純化（層析）；（5）鑒定56完整版課件ppt蛋白質(zhì)純化一、準(zhǔn)備工作：要解決三個(gè)問(wèn)題：56完整版課件ppt蛋白質(zhì)和酶純化的

常見(jiàn)方法和方案設(shè)計(jì)分離純化蛋白質(zhì)的各種方法都是利用蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，例如溶解性、質(zhì)量和形狀、表面電荷、表面疏水性、與特定配體結(jié)合的性質(zhì)等。常用的方法有：沉淀（溶解性）；離子交換（電荷）；聚焦層析（電荷）；凝膠過(guò)濾（大小和形狀）；疏水作用層析（疏水性）；親和層析（與特定配體的特異性結(jié)合）。蛋白質(zhì)純化的準(zhǔn)備工作。在進(jìn)行蛋白質(zhì)純化之前首先要解決三個(gè)問(wèn)題：（1）純化蛋白質(zhì)的目的；（2）目標(biāo)蛋白的測(cè)活方法；（3）純化蛋白質(zhì)的原料。一個(gè)典型的蛋白質(zhì)純化方案開(kāi)始于完整的組織，一般經(jīng)過(guò)四個(gè)階段：（1）破碎細(xì)胞或組織（混合和勻漿）；（2）去除殘?jiān)x心）；（3）沉淀/濃縮（硫酸銨或聚乙二醇）；（4）純化（層析）；（4）鑒定，包括純度、大小或pI的測(cè)定。57完整版課件ppt蛋白質(zhì)和酶純化的

常見(jiàn)方法和方案設(shè)計(jì)分離純化蛋白質(zhì)的各種方法58完整版課件ppt58完整版課件ppt蛋白質(zhì)純度的鑒定（1）電泳法：如聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦和毛細(xì)管電泳等，純凈的蛋白質(zhì)電泳的結(jié)果應(yīng)該是一條帶。如果使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，則應(yīng)該特別小心，因?yàn)镾DS能夠破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)，如果一種蛋白質(zhì)由不同的亞基組成，則會(huì)出現(xiàn)幾條帶。此外，電泳法檢測(cè)蛋白質(zhì)的純度時(shí)，應(yīng)取分布在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)兩側(cè)的兩個(gè)不同的pH值分別進(jìn)行檢測(cè)，這樣得出的結(jié)論才更可靠；（2）化學(xué)法：N-端測(cè)定，C-端測(cè)定。純品蛋白質(zhì)應(yīng)該具有恒定的N-端或C-端組成。如果一種蛋白質(zhì)只有一條鏈組成，則只會(huì)檢測(cè)到一種N-端或C-端氨基酸；（3）儀器法：HPLC或質(zhì)譜。如果一種蛋白質(zhì)樣品在HPLC上只表現(xiàn)單一的峰，則可視為其為純品；如果純化的是一種已知蛋白，經(jīng)質(zhì)譜分析測(cè)定出來(lái)的相對(duì)分子量與實(shí)際的值一致，那么也可認(rèn)為它是純品。59完整版課件ppt蛋白質(zhì)純度的鑒定（1）電泳法：如聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦60完整版課件ppt60完整版課件ppt61完整版課件ppt61完整版課件ppt等電聚焦需要在凝膠中加入兩性電解質(zhì)，以在陽(yáng)極和陰極之間建立遞增的pH梯度，處在其中的蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)的作用下遷移，最后各自移動(dòng)到并聚焦于與其pI相當(dāng)?shù)膒H位置上。于是通過(guò)等電聚焦，不僅可以實(shí)現(xiàn)pI不同的蛋白質(zhì)之間的分離，而且還可以測(cè)定出各種蛋白質(zhì)的pI62完整版課件ppt等電聚焦需要在凝膠中加入兩性電解質(zhì)，以在陽(yáng)極和陰極之間建立遞蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定直接測(cè)定法間接測(cè)定法：先得到某一種蛋白質(zhì)基因的核苷酸序列，然后根據(jù)通用的遺傳密碼表間接推導(dǎo)出由其決定的氨基酸序列。63完整版課件ppt蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定直接測(cè)定法63完整版課件pptWestern印跡64完整版課件pptWestern印跡64完整版課件ppt蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳圖像分析轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測(cè)序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索新的或已知蛋白蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定65完整版課件ppt蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳圖像分析轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)

指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門(mén)新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。

66完整版課件ppt蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)指應(yīng)用各種技術(shù)蛋白質(zhì)的雙向電泳67完整版課件ppt蛋白質(zhì)的雙向電泳67完整版課件ppt雙向凝膠電泳（2－DE）原理:

先根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同在pH梯度介質(zhì)中進(jìn)行第一次分離，即等電聚焦（isoelectricfocusing,IEF），然后根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同進(jìn)行第二次分離，即SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳完整的實(shí)驗(yàn)步驟包括：樣品分離、等電聚焦、平衡、第二向分離、染色、成像、軟件分析、蛋白質(zhì)鑒定68完整版課件ppt雙向凝膠電泳（2－DE）原理:68完整版課件pp1.樣品制備樣品的制備是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，需根據(jù)不同的研究目的來(lái)決定具體的實(shí)驗(yàn)方法。蛋白樣品的有效溶解是成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵的因素之一。可以根據(jù)樣品性質(zhì)的不同，選用具有單一的增溶作用的溶液，還可用含多種變性劑、去垢劑、還原劑的復(fù)雜混合溶液，以使樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚集體完全破壞。69完整版課件ppt1.樣品制備69完整版課件ppt制備樣品的原則樣品制備步驟越簡(jiǎn)單越好，避免目的蛋白的損失或丟失。裂解細(xì)胞或組織要防止蛋白降解。裂解細(xì)胞應(yīng)在低溫下進(jìn)行(冰水浴或4℃)，最好用加有蛋白酶抑制劑的裂解液直接裂解。樣品裂解液應(yīng)新鮮配制，或分裝凍存，而且要采用高純度的去離子尿素70完整版課件ppt制備樣品的原則樣品制備步驟越簡(jiǎn)單越好，避免目的蛋白的損失或丟蛋白樣品應(yīng)在等電聚焦前新鮮配制，或-80℃分裝凍存，絕對(duì)避免將樣品反復(fù)凍融。通過(guò)超離心去除所有顆粒性物質(zhì)，因?yàn)轭w粒性物質(zhì)或脂會(huì)阻塞凝膠孔路。71完整版課件ppt蛋白樣品應(yīng)在等電聚焦前新鮮配制，或-80℃分裝凍存，絕對(duì)避免為了防止蛋白質(zhì)被修飾，加入尿素后，不要加熱蛋白樣品。當(dāng)樣品中含有尿素時(shí)，加熱絕對(duì)不要超過(guò)37℃.升高溫度會(huì)使尿素水解成異氰酸鹽(isocyanate),使蛋白發(fā)生氨甲?；?carbamylation)修飾。最好用強(qiáng)烈變性劑直接裂解樣品，這樣可以使蛋白水解酶立即變性失活。72完整版課件ppt為了防止蛋白質(zhì)被修飾，加入尿素后，不要加熱蛋白樣品。當(dāng)樣品中

雙向電泳分析中的樣品制備應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過(guò)程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無(wú)關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測(cè)性。73完整版課件ppt雙向電泳分析中的樣品制備應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶提高2DE分辨率的策略首先采用寬pH范圍的膠條，確定蛋白的分布范圍，通常采用pH3-10的膠條如果pH線性分布的膠條分離效果不好，可采用非線性膠條加大蛋白上樣量，提高局部蛋白的分辨率采用窄pH范圍的膠條，提高某pH范圍蛋白的分辨率第二向采用梯度膠進(jìn)行分離去除高豐度蛋白，進(jìn)行蛋白的fractionation處理,富集低豐度蛋白74完整版課件ppt提高2DE分辨率的策略首先采用寬pH范圍的膠條，確定蛋白的分分子雜交技術(shù)分子生物學(xué)中用于檢測(cè)生物樣本中是否含有特定的生物分子的一門(mén)技術(shù)。樣品制備電泳雜交轉(zhuǎn)膜結(jié)果顯示探針制備分子雜交原理及流程圖75完整版課件ppt分子雜交技術(shù)分子生物學(xué)中用于檢測(cè)生物樣本中是否含有特定的生物表2各種印跡技術(shù)印跡類(lèi)型轉(zhuǎn)移到膜上的分子探針獲得的信息SouthernDNA片段放射性標(biāo)記的互補(bǔ)RNA或DNA基因結(jié)構(gòu)等NorthernRNA放射性標(biāo)記的互補(bǔ)RNA或DNA特定RNA的大小、分布和含量Western蛋白質(zhì)一級(jí)抗體和與酶偶聯(lián)的二級(jí)抗體特定蛋白質(zhì)的大小、分布和含量76完整版課件ppt表2各種印跡技術(shù)印跡類(lèi)型轉(zhuǎn)移到膜探針獲得的信息Sout

核酸分子雜交的基本原理

具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈的過(guò)程。雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。雜交有固一液相雜交和液相雜交。77完整版課件ppt

核酸分子雜交的基本原理

具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在影響雜交的因素

1、核酸分子的濃度和長(zhǎng)度：濃度越大，復(fù)性速度越快分子越大，復(fù)性速度越慢單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加雙鏈探針，濃度控制在0.1~0.5μg,濃度過(guò)高影響雜交效率78完整版課件ppt影響雜交的因素78完整版課件ppt2、溫度：（1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低20~25℃

（2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低

Tm值（3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低5℃79完整版課件ppt2、溫度：79完整版課件ppt3、離子強(qiáng)度：（1）低鹽濃度時(shí)雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加（2）高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度

80完整版課件ppt3、離子強(qiáng)度：80完整版課件ppt4、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時(shí)探針與待測(cè)核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測(cè)核酸與探針同源性不高時(shí)，加50%甲酰胺溶液在35~42℃雜交（2）如待測(cè)核酸序列與探針同源性高時(shí)，則用水溶液在68℃雜交

81完整版課件ppt4、甲酰胺：81完整版課件ppt5、核酸分子的復(fù)雜性：（1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長(zhǎng)度（2）Cot?與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成正比（3）兩個(gè)DNA樣品濃度絕對(duì)一致時(shí)，變性后的相對(duì)雜交率取決于DNA的相對(duì)復(fù)雜性82完整版課件ppt5、核酸分子的復(fù)雜性：82完整版課件ppt6、非特異性雜交反應(yīng)：（1）雜交前封閉非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對(duì)探針的非特異性吸附（2）常用的封閉物有兩類(lèi)：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉

83完整版課件ppt6、非特異性雜交反應(yīng)：83完整版課件ppt一個(gè)理想的標(biāo)記物應(yīng)滿足：(1)標(biāo)記前后探針基本結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)相同;(2)特異性強(qiáng)、本底低、重復(fù)性好；(3)操作簡(jiǎn)單、節(jié)時(shí)；(4)安全、無(wú)環(huán)境污染。84完整版課件ppt一個(gè)理想的標(biāo)記物應(yīng)滿足：84完整版課件pptNorthern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)

1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性

2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern印跡時(shí)，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理

3、靶核酸為RNA85完整版課件pptNorthern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)85完整探針的標(biāo)記

一、探針的種類(lèi)基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針寡核苷酸探針86完整版課件ppt探針的標(biāo)記

一、探針的種類(lèi)基因組DNA探針86完整版課件核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化探針的選擇在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針在檢測(cè)單鏈靶序列時(shí)應(yīng)選用與其互補(bǔ)的DNA單鏈探針或RNA探針長(zhǎng)的雙鏈DNA探針特異性較強(qiáng)，適宜檢測(cè)復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交87完整版課件ppt核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化探針的選擇87完整版課件ppt探針的標(biāo)記方法選擇什么標(biāo)記方法主要視個(gè)人的習(xí)慣和可利用條件而定；但還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)的要求，如靈敏度和顯示方法等

一般認(rèn)為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高在對(duì)靈敏要求不高時(shí)，可采用保存時(shí)間長(zhǎng)的生物素探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)五、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化88完整版課件ppt探針的標(biāo)記方法五、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化88完整版課件p探針的濃度總的來(lái)說(shuō)，隨探針濃度增加，雜交率也增加在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加膜雜交中32P標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為5～10ng/ml和25～1000ng/ml，而原位雜交中，無(wú)論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml

受不同類(lèi)型標(biāo)記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響五、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化89完整版課件ppt探針的濃度五、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化89完整版課件ppt雜交率現(xiàn)代雜交實(shí)驗(yàn)無(wú)論在液相雜交還是固相雜交均在探針過(guò)剩的條件下進(jìn)行在探針過(guò)量的條件下，雜交率主要依賴于探針長(zhǎng)度（復(fù)雜度）和探針濃度。下面列出的公式適用于過(guò)剩單鏈探針對(duì)靶序列雜交的情形

t1/2=ln2/kct1/2半數(shù)探針與固定靶序列雜交所需的時(shí)間（s）k=形成雜交體的速率常數(shù)[mol/(Lxntxs)]決定于探針長(zhǎng)度（L）、探針復(fù)雜度（N）、溫度、離子強(qiáng)度、粘度和pHc=溶液中的探針濃度（mol/L）五、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化90完整版課件ppt雜交率五、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化90完整版課件ppt雜交最適溫度——雜交技術(shù)最重要的因素之一反應(yīng)溫度低于Tm10～15℃，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30℃），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱最適復(fù)性溫度（Optimunmrenaturationtemperature,TOR）：Tor=Tm–25℃苛刻復(fù)性溫度：Ts=Tm–(10或15℃)非苛刻復(fù)性溫度：Tns=Tm–(30或35℃)

五、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化91完整版課件ppt雜交最適溫度——雜交技術(shù)最重要的因素之一五、核酸分子雜交實(shí)雜交的嚴(yán)格性影響雜交體穩(wěn)定性的因素決定著雜交條件的嚴(yán)格性。一般認(rèn)為在低于雜交體Tm值25℃時(shí)雜交最佳通過(guò)調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來(lái)控制所需的嚴(yán)格性在實(shí)際應(yīng)用中，寡核苷酸探針的最佳雜交溫度必須精確確定。最方便的一種方法是制備一張含不同稀釋度靶DNA和非特異靶DNA（如魚(yú)精或大腸桿菌DNA）的膜。在不同溫度下使膜與探針雜交，特異靶序列結(jié)合探針信號(hào)很強(qiáng)，而非特異靶序列與探針無(wú)任何反應(yīng)的溫度就是最適溫度五、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化92完整版課件ppt雜交的嚴(yán)格性五、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化92完整版課件p雜交反應(yīng)時(shí)間

在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間

一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行20h左右推薦用Cot=值來(lái)計(jì)算雜交反應(yīng)時(shí)間

Cot值實(shí)際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和反應(yīng)時(shí)間（t）的乘積，實(shí)驗(yàn)表明Cot=100時(shí)，雜交反應(yīng)基本完成五、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化93完整版課件ppt雜交反應(yīng)時(shí)間五、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化93完整版課件pp雜交促進(jìn)劑惰性多聚體可用來(lái)促進(jìn)250個(gè)堿基以上的探針的雜交率，對(duì)單鏈探針可增加3倍，而對(duì)雙鏈探針、隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá)100倍硫酸葡聚糖、聚乙二醇（PEG）、聚丙烯酸小分子化學(xué)試劑酚和硫氰酸胍也能促進(jìn)雜交五、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化94完整版課件ppt雜交促進(jìn)劑五、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化94完整版課件ppWesternBlot一般流程蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色95完整版課件pptWesternBlot一般流程蛋白樣品的制備轉(zhuǎn)膜95完整版蛋白質(zhì)的印跡技術(shù)(免疫印跡)首先將混合蛋白質(zhì)用PAGE按分子大小分開(kāi)，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜上，蛋白質(zhì)的位置可保持在膠中的原位上。與DNA和RNA印跡相似之處96完整版課件ppt蛋白質(zhì)的印跡技術(shù)(免疫印跡)首先將混合蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移只有靠電轉(zhuǎn)移。蛋白質(zhì)的檢測(cè)以抗體作探針。用堿性磷酸酶（ALP）、辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記第二抗體，底物顯色來(lái)檢測(cè)蛋白區(qū)帶的信號(hào)，底物亦可與化學(xué)發(fā)光劑結(jié)合以提高敏感度?；蛴猛凰貥?biāo)記第二抗體，放射自顯影法檢測(cè)蛋白區(qū)帶的信號(hào)。與DNA和RNA印跡不同之處97完整版課件ppt蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移只有靠電轉(zhuǎn)移。與DNA和RNA印跡不同之處97完Westernblotting應(yīng)用檢測(cè)樣品中的特異蛋白質(zhì)的存在。細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的定量分析。蛋白質(zhì)分子的相互作用研究。98完整版課件pptWesternblotting應(yīng)用檢測(cè)樣品中的特異蛋白質(zhì)定義：PCR技術(shù)又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction)，是通過(guò)模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地將DNA某個(gè)特殊區(qū)域擴(kuò)增出來(lái)的技術(shù)。

PCR技術(shù):99完整版課件pptPCR技術(shù):99完整版課件ppt加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性加熱或強(qiáng)酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為DNA的變性。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結(jié)合起來(lái),形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù),這稱DNA復(fù)性,也叫退火。

100完整版課件ppt加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性加熱或強(qiáng)酸、堿性作用可以PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別：1.PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要；2.PCR需要耐熱的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時(shí)會(huì)變性；3.PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要生物體自身的復(fù)制。101完整版課件pptPCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別：1.PCR不需要解旋酶；對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測(cè)PCR技術(shù)的特點(diǎn)102完整版課件ppt對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制簡(jiǎn)便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2~4小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣

PCR技術(shù)的特點(diǎn)103完整版課件ppt簡(jiǎn)便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌PCR技術(shù)的特點(diǎn)104完整版課件ppt靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(PCR原理5’5’3’3’d.NTPs耐熱DNA聚合酶引物5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’添加反應(yīng)混合液及樣本變性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’退火加入試管中105完整版課件pptPCR原理5’5’3’3’d.NTPs耐熱DNA聚合酶引物5延伸5’3’5’3’5’3’5’3’繼續(xù)延伸5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’循環(huán)PCR原理106完整版課件ppt延伸5’3’5’3’5’3’5’3’繼續(xù)延伸5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’第二個(gè)循環(huán)4個(gè)拷貝第三個(gè)循環(huán)8個(gè)拷貝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第n個(gè)循環(huán)2n個(gè)拷貝PCR原理107完整版課件ppt5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’指數(shù)增長(zhǎng)期線形增長(zhǎng)期平臺(tái)期循環(huán)數(shù)#

理論值

實(shí)際值Log產(chǎn)物DNAPCR過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)108完整版課件ppt指數(shù)增長(zhǎng)期循環(huán)數(shù)#理論值實(shí)際值Log產(chǎn)物DN72℃94℃55℃PCR循環(huán)109完整版課件ppt72℃94℃55℃PCR循環(huán)109完整版課件pptPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L110完整版課件pptPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系110完整PCR反應(yīng)五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）

dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）111完整版課件pptPCR反應(yīng)五要素引物（primer）111完整版課件pptPCR技術(shù)的基本過(guò)程(1)模板DNAdNTP引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2基本過(guò)程112完整版課件pptPCR技術(shù)的基本過(guò)程(1)模板DNA預(yù)變性模板DNATaPCR技術(shù)的基本過(guò)程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循環(huán)儀94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循環(huán)25～35次113完整版課件pptPCR技術(shù)的基本過(guò)程(2)Taq酶循環(huán)儀94℃Taq酶7PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA114完整版課件pptPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件靈敏度高114完整版課件ppt引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增115完整版課件ppt引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵115完整版課件ppt引物設(shè)計(jì)：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源序列。（2）引物長(zhǎng)度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布，G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無(wú)嚴(yán)格限制。116完整版課件ppt引物設(shè)計(jì)：116完整版課件ppt標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10×擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul117完整版課件ppt標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10×擴(kuò)增緩沖液2）循環(huán)參數(shù)變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈

95oC20-30秒(2)退火溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。118完整版課件ppt2）循環(huán)參數(shù)118完整版課件ppt（3）延伸

70-75oC，延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過(guò)多：擴(kuò)增效率降低錯(cuò)誤摻入率增加119完整版課件ppt（3）延伸119完整版課件pptPCR的主要類(lèi)型不對(duì)稱PCR

反向PCR(reversePCR)

多重PCRLP-PCR

錨式PCRPCR固相分析法實(shí)時(shí)PCR技術(shù)120完整版課件pptPCR的主要類(lèi)型不對(duì)稱PCR120完整版課件ppt思考題

什么是PCR？簡(jiǎn)述PCR的主要過(guò)程。PCR的主要組成成分，以及每個(gè)成分的主要作用和注意事項(xiàng)。舉例說(shuō)明PCR技術(shù)主要包括哪些？簡(jiǎn)述PCR技術(shù)主要應(yīng)用于哪些方面？121完整版課件ppt思考題

什么是PCR？121完整版課件ppt酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)

(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)

122完整版課件ppt酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)

(Enzyme-linkedImmuno免疫標(biāo)記技術(shù)放射物標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)技術(shù)免疫熒光技術(shù)其他標(biāo)記技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)酶免疫組化技術(shù)雙抗體夾心法競(jìng)爭(zhēng)法雙抗原夾心法間接法雙位一點(diǎn)法123完整版課件ppt免疫標(biāo)記技術(shù)放射物標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)技術(shù)免疫熒光技術(shù)其他標(biāo)記技術(shù)酶基本原理

是利用抗原抗體進(jìn)行的檢測(cè)技術(shù)。即利用制備好的特異抗原或抗體作為試劑，以檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）124完整版課件ppt基本原理在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：124完整版課件pELISA原理使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)125完整版課件pptELISA原理使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免一：靈敏性

該測(cè)定法的靈敏度來(lái)自作為報(bào)告集團(tuán)的酶。眾所周知,酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。

ELISA實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對(duì)其進(jìn)行定量。

ELISA的特點(diǎn)126完整版課件ppt一：靈敏性ELISA的特點(diǎn)126完整版課件ppt二：特異性其特異性來(lái)自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。

127完整版課件ppt二：特異性127完整版課件pptELISA的試劑(A、B、C三部分)ELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液128完整版課件pptELISA的試劑(A、B、C三部分)ELISA中有三個(gè)必要的DNA的體外合成DNA的化學(xué)合成DNA的化學(xué)合成廣泛用于合成寡核苷酸探針和引物，有時(shí)也用于人工合成基因和反義寡核苷酸。目前寡核苷酸均是用DNA合成儀合成的，大多數(shù)DNA合成儀是以固相磷酰亞胺法為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)制造的。129129完整版課件pptDNA的體外合成DNA的化學(xué)合成129129完整版課件ppt1.合成的原理核酸固相合成的基本原理是將所要合成的核酸鏈的末端核苷酸先固定在一種不溶性高分子固相載體上，然后再?gòu)拇四┒碎_(kāi)始將其他核苷酸按順序逐一接長(zhǎng)。每接長(zhǎng)一個(gè)核苷酸殘基則經(jīng)歷一輪相同的操作，由于接長(zhǎng)的核酸鏈?zhǔn)冀K被固定在固相載體上，所以過(guò)量的未反應(yīng)物或反應(yīng)副產(chǎn)物可通過(guò)過(guò)濾或洗滌的方法除去。合成至所需長(zhǎng)度后的核酸鏈可從固相載體上切割下來(lái)并脫去各種保護(hù)基，再經(jīng)純化即可得到最終產(chǎn)物。130完整版課件ppt1.合成的原理130完整版課件ppt核酸序列測(cè)定DNA測(cè)序是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是核苷酸排列方式。RNA測(cè)序則通常將RNA提取后，反轉(zhuǎn)錄為DNA后使用DNA測(cè)序的方法進(jìn)行測(cè)序。在分子生物學(xué)研究中，DNA的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。目前應(yīng)用最廣泛的是：Sanger雙脫氧鏈終止法。Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法。新技術(shù)：雜交測(cè)序法，質(zhì)譜法，單分子測(cè)序法，原子探針顯微鏡測(cè)序法，DNA芯片法。2022/12/1131131完整版課件ppt核酸序列測(cè)定DNA測(cè)序是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就核酸序列測(cè)定Sanger雙脫氧鏈終止法基本原理：在模板指導(dǎo)下，DNA聚合酶不斷將dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延長(zhǎng)，合成出新的互補(bǔ)的DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于雙脫氧核糖的3’位置上缺少一個(gè)羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同5’-引物端和以ddNMP殘基為3’端結(jié)尾的一系列長(zhǎng)短不一片段的混合物。由于雙脫氧核苷酸在每個(gè)DNA分子中摻入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長(zhǎng)度差一個(gè)核苷酸單鏈DNA，從而讀取DNA核苷酸序列。2022/12/1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院132132完整版課件ppt核酸序列測(cè)定Sanger雙脫氧鏈終止法2022/11/30南化學(xué)降解法與雙脫氧法的比較Maxam-Gilber化學(xué)降解法所能測(cè)定DNA序列的長(zhǎng)度要比Sanger法短一些，通常說(shuō)來(lái)，化學(xué)降解法對(duì)放射性標(biāo)記末端250個(gè)核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果最佳。如今雙脫氧核苷酸末端終止法遠(yuǎn)比Maxam-Gilbert化學(xué)降解法應(yīng)用得更為廣泛。但是，化學(xué)降解法具有一個(gè)Sanger法所不具備的明顯優(yōu)點(diǎn)：即所測(cè)核酸序列來(lái)自原DNA分子而不是酶促合成反應(yīng)所產(chǎn)生的拷貝，因此，利用Maxam-Gilbert法可以對(duì)合成的寡核苷酸進(jìn)行測(cè)序，分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，也可以通過(guò)化學(xué)保護(hù)及修飾干擾實(shí)驗(yàn)來(lái)研究DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。然而，由于Sanger法的簡(jiǎn)便快速，仍不失為現(xiàn)今DNA測(cè)序的最佳選擇方案。2022/12/1133133完整版課件ppt化學(xué)降解法與雙脫氧法的比較2022/11/30133133完“測(cè)序”思考回答問(wèn)題1、Sanger雙脫氧鏈終止法原理是什么2、Maxam－Gilbert化學(xué)修飾法的原理是什么3、DNA雜交測(cè)序原理是什么4、什么是寡核苷酸矩陣芯片5、雜交測(cè)序有什么應(yīng)用134完整版課件ppt“測(cè)序”思考回答問(wèn)題1、Sanger雙脫氧鏈終止法原理是什么組與組學(xué)基因組與基因組學(xué)蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)轉(zhuǎn)錄組與轉(zhuǎn)錄組學(xué)代謝組與代謝組學(xué)135完整版課件ppt組與組學(xué)基因組與基因組學(xué)135完整版課件ppt常見(jiàn)的生化與分子生物學(xué)技術(shù)136完整版課件ppt常見(jiàn)的生化與分子生物學(xué)技術(shù)1完整版課件ppt生物大分子的提取和純化電泳技術(shù)PCR技術(shù)核酸序列的測(cè)定蛋白質(zhì)相互作用AgrosePAGE雙向電泳雜交技術(shù)酶聯(lián)免疫技術(shù)層析技術(shù)、超濾技術(shù)、膜技術(shù)

檢測(cè)和純化137完整版課件ppt生物大分子的提取和純化電泳技術(shù)PCR技術(shù)核酸序列的測(cè)定蛋白質(zhì)分離生命現(xiàn)象生化組分分析1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)2、功能3、代謝及其細(xì)胞調(diào)控改造利用生物化學(xué)研究技術(shù)方法經(jīng)典的研究步驟：分離生化組分（細(xì)胞器和生物分子）；