植物內(nèi)生木霉的鑒定及其抑菌活性

植物內(nèi)生木霉的鑒定及其抑菌活性收稿日期：2014-04-11基金項(xiàng)目：江蘇省徐州師范大學(xué)?；穑ň幪枺?0XLA20）。通信作者：蔣繼宏，教授。E-mail：。植物內(nèi)生菌是一定階段或全部階段生活于健康植物組織和器官內(nèi)部的真菌或細(xì)菌，目前已成為生物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥、增產(chǎn)菌或作為潛在生防載體菌而加以利用[1]。木霉屬（Trichoderma）屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目黏孢菌類[2]，分布比較廣泛，是典型的土壤和木材腐生真菌。木霉菌是有效的生物農(nóng)藥資源，適應(yīng)性廣，生存能力強(qiáng)，對植物病原菌拮抗作用廣譜，在防病的同時(shí)還能產(chǎn)生多種酶分解土壤中的植物殘?bào)w、降解大分子化合物以便吸收利用，能與土壤中其他益菌協(xié)調(diào)生長、不污染環(huán)境等[3-5]。筆者在分離植物內(nèi)生菌的過程中獲得了幾株植物內(nèi)生木霉菌，鑒于木霉菌的生防特性，對分離到的內(nèi)生木霉菌進(jìn)行了分類鑒定和抗植物病原菌活性分析，為植物內(nèi)生木霉菌的利用提供依據(jù)。1材料與方法供試材料材料來源6株木霉供試真菌（DBs0-13、DBs57、DBs66、40、171、292）分離自健康植物組織中，為徐州師范大學(xué)藥用植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。抑菌試驗(yàn)用的病原真菌小麥赤霉病菌（FusariumgramineaumSchwabe）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeriaberengrianaf.sp.piricola）、油菜菌核病菌[Sclerotiniasclerotiorum（Lib.）deBary]、可可球二孢菌（B.theobromaePat.），均為徐州師范大學(xué)藥用植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉20g，水1000mL,pH值自然；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（發(fā)酵用的培養(yǎng)基）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，pH值自然。方法木霉菌的活化將冷藏菌種取出，在無菌條件下用接種環(huán)挑取供試菌的少量菌絲（或0.5cmx0.5cm的菌落）至含PDA培養(yǎng)基的平板中，于28C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。木霉菌株生長速度的測定將活化過的木霉菌落用打孔器打孔，獲得的菌餅接于新培養(yǎng)基中，于28C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d,采用十字交叉法測定菌落直徑，計(jì)算出生長速度，同時(shí)觀察菌落顏色、形狀等。1.2.3載玻片的培養(yǎng)將滅過菌的PDA培養(yǎng)基于微波爐中融化，待培養(yǎng)基溫度降到40?45C時(shí)于超凈工作臺中倒平皿，要倒得盡量?。?.1?0.2cm厚），待冷卻。在上述培養(yǎng)皿中挑取大約0.5cmx0.5cm的培養(yǎng)基于滅過菌的載玻片上，然后挑取培養(yǎng)皿中菌種的菌絲于瓊脂塊的3個(gè)角上，再蓋上滅過菌的蓋玻片，用記號筆輕輕敲1下，以免蓋玻片移動，在玻片上做好標(biāo)記，于28C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d左右（整個(gè)過程都要保證無菌狀態(tài)）。顯微特征觀察取出培養(yǎng)3d后的玻片，置于顯微分析儀的操作臺上，用針尖輕輕挑起蓋玻片的一側(cè)，慢慢地拿起蓋玻片，并輕輕地挑掉周圍的培養(yǎng)基，在新的載玻片中央滴1滴甲基藍(lán)，蓋玻片的一側(cè)先接觸液體，然后慢慢地放下蓋玻片，用濾紙吸取周圍多余液體，置于顯微鏡下觀察，觀察菌絲以及孢子并進(jìn)行拍攝，同時(shí)使用測微尺測量孢子的大?。ㄩL和寬都要測）。每個(gè)菌株的孢子各測30個(gè)，記錄數(shù)據(jù)。木霉菌發(fā)酵液（相當(dāng)于稀釋10倍）的制備于500mL三角瓶中加入100mL的PDA夜體培養(yǎng)基，包扎，于高壓滅菌鍋中121C滅菌25min，無菌條件下用接種針挑取適量活化木霉菌株的菌絲，接種于三角瓶中的培養(yǎng)基中，置于 28C的搖床上150r/min培養(yǎng)7d，獲得各菌株的發(fā)酵液，發(fā)酵液4000r/min離心5min，取上清液，再在無菌狀態(tài)下用 022^m濾膜過濾除菌，濾液分別裝于滅菌錐形瓶中。1.2.6抑菌效果的測定將PDA固體培養(yǎng)基加熱至熔化，室溫靜置，待培養(yǎng)基溫度降到60C左右時(shí)，將木霉菌發(fā)酵液與培養(yǎng)基按照體積比1：9充分混勻，混勻后立刻倒平板，在無菌操作臺上室溫放置至凝固，即制成含發(fā)酵液的平板，以不加發(fā)酵液的PDA平板為對照。從培養(yǎng)好的4種病原真菌菌落上，用滅過菌的打孔器沿邊緣打出直徑為0.4cm的圓形菌塊，將菌塊分別轉(zhuǎn)接至已凝固的培養(yǎng)基平板表面，并設(shè)3個(gè)重復(fù)，以無發(fā)酵液平板為對照，置于25C培養(yǎng)箱下培養(yǎng)3d。用十字交叉法測定菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)以下公式計(jì)算抑菌率：抑菌率 =(對照菌落直徑-發(fā)酵液處理后的菌落直徑)/對照菌落直徑X100%2結(jié)果與分析木霉菌菌落形態(tài)和顯微形態(tài)描述供試木霉菌得菌落形態(tài)和孢子等特征見圖 1、表1，根據(jù)這些特征初步鑒定，DBs0-13為多孢木霉(T.polysporum)、DBs57為里氏木霉(T.reesei)、DBs66為長抱木霉(T.Iongipile)、40號為綠色木霉(T.viride)、171為康氏木霉(T.koningii)、292為哈茨木霉(T.harizianum)。表1木霉菌相關(guān)形態(tài)特征供試木霉對病原真菌的抑制作用由表2可知，多抱木霉菌DBs0-13和171康氏木霉對4種病原真菌都有抑菌作用；其他4種木霉菌(DBs57DBs6640、292)除對小麥赤霉病菌沒有抑制作用外，對其他病原菌也有較強(qiáng)的抑制作用。對小麥赤霉病菌抑制作用最強(qiáng)的是171；對蘋果輪紋病菌抑制作用最強(qiáng)的是40，抑菌率為4885%；對油菜菌核病菌、可可球二抱菌抑制作用最強(qiáng)的是 DBS0-13，抑菌率分別為62.89%、41.12%。綜合抑菌結(jié)果可知，在所有供試木霉中DBS0-13的抑菌效果最好，是值得開發(fā)的生防菌。3結(jié)論6種內(nèi)生木霉菌對蘋果輪紋菌、油菜菌核菌和可可球二抱菌都有不同程度的抑制作用，而對小麥