植物昆蟲和哺乳動(dòng)物中存在的小RNA分子長度為18-26個(gè)核苷酸nt課件

生物芯片檢測細(xì)胞中microRNA的表達(dá)MicroRNAExpressioninCellsDetectedbyOligonucleotideMicroarray07生技1生物芯片檢測細(xì)胞中microRNA的表達(dá)MicroRNA1

microRNA(miRNA)是一類在線蟲、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物中存在的小RNA分子,長度為18-26個(gè)核苷酸(nt)的小非編碼RNA，類似于siRNA的分子

。

miRNA通過調(diào)節(jié)基因表達(dá),參與調(diào)控細(xì)胞的眾多生物學(xué)功能,如生物發(fā)育、脂肪代謝,及細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等。它們通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)互補(bǔ),將mRNA剪切或是抑制其翻譯。

人類基因組中已發(fā)現(xiàn)300多種miRNA,而且預(yù)測實(shí)際數(shù)目會(huì)更多,它們可能會(huì)對(duì)人類基因組中近30%的基因發(fā)揮調(diào)控作用。但關(guān)于miRNA的表達(dá)模式、生物學(xué)功能、作用機(jī)制等,目前的認(rèn)識(shí)還不很清楚。在此,我們設(shè)計(jì)并制備了miRNA表達(dá)譜的寡核苷酸芯片,利用其快速、平行、高通量的檢測特點(diǎn),分析了6種不同細(xì)胞系中206個(gè)miRNA的表達(dá)水平特點(diǎn),為miRNA的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

microRNA(miRNA)是一類在線蟲、植21材料和方法1.1材料

實(shí)驗(yàn)所用6種人類腫瘤細(xì)胞系均為本實(shí)驗(yàn)室保存,分別HeLa(人宮頸癌上皮細(xì)胞)、K562(人慢性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞)、ES-2(人卵巢透明細(xì)胞癌)、MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞)、HT-29(人結(jié)腸腺癌細(xì)胞)和A549細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)。所有細(xì)胞系均在5%CO2條件下,用含有10%胎牛血清的適合培養(yǎng)基培養(yǎng)。1.2miRNA芯片的制備

所用的210個(gè)寡核苷酸探針為mirVanaTMmiRNAProbeSet試劑盒(Ambion),其中206個(gè)與已知的人類和小鼠miRNA序列互補(bǔ),4個(gè)為陽性對(duì)照。3×SSC點(diǎn)樣緩沖液溶解探針至50μmol/L,用SpotArrayTM24基因芯片點(diǎn)樣儀(PerkinElmer)印制于SuperChipTMⅠ(PerkinElmer)玻片表面,制成miRNA寡核苷酸芯片。每次雜交前進(jìn)行水合、干燥等點(diǎn)樣后處理。1材料和方法1.1材料31.3miRNA的準(zhǔn)備、標(biāo)記與雜交

依m(xù)irVanaTMmiRNAIsolationKit(Ambion)說明書提取腫瘤細(xì)胞的富集miRNA。用UniversalMicroplateSpectrophotometer(Bio-tek)紫外分析儀測定miRNA濃度和純度,8mol/L尿素變性的15%聚丙烯酰胺凝膠檢測質(zhì)量。依m(xù)irVanaTMmiRNALabelingKit(Ambion)說明書對(duì)富集miRNA進(jìn)行熒光標(biāo)記,方法簡單描述如下:先在miRNA末端添加20-50個(gè)經(jīng)過氨基修飾的核苷酸尾,然后與帶有N-羥基琥珀酰亞胺酯類(Nhydroxysuccinimidylester,NHS-ester)的熒光染料Cy3(AmershamBiosciences)反應(yīng)。標(biāo)記后的樣本與3×miRNAHybridizationBuffer(Ambion)混合并將其均勻鋪于miRNA寡核苷酸芯片表面,小心加蓋玻片封片,置于密封濕潤的雜交倉中,42℃雜交16h。最后進(jìn)行雜交后清洗。1.3miRNA的準(zhǔn)備、標(biāo)記與雜交41.4芯片圖像的采集與數(shù)據(jù)處理采用ScanArrayTMExpress1.0(PerkinElmer)掃描儀進(jìn)行掃描,掃描強(qiáng)度為100%,光電倍增管增益為80%,掃描精度為10μm。掃描所得圖ScanArray3.0(PerkinElmer)軟件進(jìn)行處理,得到雜交信號(hào)和與之相應(yīng)背景的平均強(qiáng)度值,從雜交信號(hào)值中減去背景值得到校正信號(hào)強(qiáng)度值。6種細(xì)胞檢測所得數(shù)據(jù)經(jīng)陽性對(duì)照均衡后比較。判斷表達(dá)存在差異的標(biāo)準(zhǔn)是:①相互比較的miRNA信號(hào)熒光強(qiáng)度值相差至少大于1000;②若其中有信號(hào)強(qiáng)度值小于100,則同一種miRNA在不同細(xì)胞的熒光值差異需大于500。數(shù)據(jù)經(jīng)總體歸一化和對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后,Cluster3.0(StanfordUniversity)進(jìn)行聚類分析。

1.4芯片圖像的采集與數(shù)據(jù)處理51.5RT-PCR驗(yàn)證miRNA分別取6種細(xì)胞總RNA各5μg,用與miR-17-5p、miR-21前體互補(bǔ)的特異性引物和逆轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptⅢ(Invitrogen)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),分別取1μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)中的miRNA序列設(shè)計(jì)特異性引物,有關(guān)參數(shù)見表1。用15%非變性聚丙烯酰胺凝膠驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物大小;用LabWorks4.0ImageAcquisitionandAnalysis軟件進(jìn)行定量及數(shù)據(jù)處理。取PCR產(chǎn)物連入pGEM-T-easy載體(Promega),送交測序,測序結(jié)果與提供的miRNA序列一致。1.5RT-PCR驗(yàn)證miRNA6植物昆蟲和哺乳動(dòng)物中存在的小RNA分子長度為18-26個(gè)核苷酸nt課件72結(jié)果2.1miRNA的抽提和純化6種細(xì)胞系富集miRNA的D260nm/D280nm值均為1.8～2.1,符合miRNA芯片的檢測要求。2.2芯片雜交結(jié)果標(biāo)記、純化后的miRNA與芯片雜交,用掃描儀在543nm通道處對(duì)芯片進(jìn)行掃描,得到圖像,用Scanarray3.0軟件分析miRNA在6種細(xì)胞中的表達(dá)水平。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn),91個(gè)miRNA在6種細(xì)胞間沒有明顯差異,115個(gè)miRNA存在差異。miR-21在6種細(xì)胞中校正信號(hào)強(qiáng)度/背景強(qiáng)度均大于2倍,表達(dá)水平均較高;miR-17-5p和miR-20a在6種細(xì)胞中的表達(dá)情況相似,在ES-2細(xì)胞中校正信號(hào)強(qiáng)度/背景強(qiáng)度大于10倍,表達(dá)較高;miR-126與miR-128a和miR-151,miR-145與miR-297-1在HeLa和MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)水平類似。見表2。2結(jié)果2.1miRNA的抽提和純化8植物昆蟲和哺乳動(dòng)物中存在的小RNA分子長度為18-26個(gè)核苷酸nt課件92.3數(shù)據(jù)聚類分析將掃描得到的雜交后圖像用ScanArray3.0軟件進(jìn)行處理,所得數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化和對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后,用Cluster3.0進(jìn)行聚類分析。結(jié)果,MCF-7和HeLa細(xì)胞miRNA的表達(dá)譜聚為一類。2.4RT-PCR檢測用特異性引物對(duì)miR-17-5p、miR-21前體進(jìn)行擴(kuò)增,同時(shí)以U6作為內(nèi)參。各細(xì)胞中miRNA前體的表達(dá)水平經(jīng)內(nèi)參校正后,發(fā)現(xiàn)miR-17-5p前體在K562細(xì)胞中的表達(dá)水平最高,在ES-2細(xì)胞中的表達(dá)量次之;miR-21在6種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平均較高,與芯片檢測結(jié)果基本一致(圖1)。2.3數(shù)據(jù)聚類分析10圖一圖一113討論

microRNA是一類在線蟲、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物中存在的小RNA分子,它們通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)互補(bǔ),將mRNA剪切或是抑制其翻譯。已很明確,miRNA在調(diào)控基因表達(dá)過程中發(fā)揮非常重要的作用,而理解miRNA在生物體內(nèi)如何發(fā)揮作用的關(guān)鍵是要知道m(xù)iRNA的表達(dá)模式。但是因?yàn)閙iRNA的長度非常短(只有18-26nt),檢測miRNA的方法受到很大的限制。我們利用生物芯片的高通量、高敏感性的特點(diǎn),為在組織和細(xì)胞中檢測多種miRNA提供了理想的手段。

3討論microRNA是一類在線蟲、植物、昆12

實(shí)驗(yàn)中用熒光標(biāo)記的miRNA直接與miRNA檢測芯片雜交,檢測發(fā)現(xiàn)6種細(xì)胞系有各自不同的miRNA表達(dá)譜。實(shí)驗(yàn)檢測到miR-21在6種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平均較高,這與文獻(xiàn)報(bào)道的miR-21在70%的肺癌和70%的結(jié)直腸癌患者中表達(dá)上調(diào)一致[6]。Iorio等[7]也發(fā)現(xiàn),miR-21在乳腺癌中表達(dá)明顯上調(diào),而且在一定程度上可以顯示腫瘤的惡性程度。miRNA集簇存在是其一個(gè)顯著特征,我們檢測到miR-17-5p與miR-20a的表達(dá)水平類似,而也有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-17-5p與miR-20a及其他4種miRNA成集簇存在于人類第13號(hào)染色體上[8]。O'Donnell等[9]通過染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)c-Myc可直接與miR-17-5p集簇位點(diǎn)結(jié)合,激活其表達(dá),提示這一miRNA的表達(dá)可能和腫瘤的發(fā)生存在某種關(guān)聯(lián)。MCF-7和HeLa分別來源于人類乳腺和宮頸,它們發(fā)育起源類似,共同起源于胚胎內(nèi)胚層。我們檢測到MCF-7和HeLa細(xì)胞miRNA的表達(dá)譜聚為一類。提示在哺乳動(dòng)物體內(nèi)特殊的miRNA有可能參與維持胚胎早期發(fā)生過程中的多潛能細(xì)胞狀態(tài)[10],在器官和組織的發(fā)育、形成中發(fā)揮重要調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)中用熒光標(biāo)記的miRNA直接與miRNA13總RNA中miRNA所占的比例極少(約為0.01%)[11],為了驗(yàn)證芯片檢測結(jié)果是否可以反映miRNA在總RNA中的量,我們用RT-PCR的方法對(duì)芯片檢測結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明微陣列和PCR方法檢測的miRNA的表達(dá)基本一致,但也有些差異。用RT-PCR方法檢測到K562細(xì)胞中miR-17-5p的高表達(dá),而在微陣列中卻顯示其在K562細(xì)胞中表達(dá)水平較低。這可能是由于:①K562細(xì)胞中的前體miRNA和成熟miRNA表達(dá)量都非常高,雖然標(biāo)記反應(yīng)沒有對(duì)pre-miRNA進(jìn)行熒光標(biāo)記,但在雜交過程中大量的pre-miRNA仍可能和相對(duì)較少的成熟miRNA競爭,影響了熒光標(biāo)記的成熟miRNA與探針的結(jié)合,掩蓋了K562中miR-17-5p信號(hào);②或是實(shí)驗(yàn)過程中的系統(tǒng)誤差,這種情況在普通的生物芯片技術(shù)中也存在。因此,除了要在芯片實(shí)驗(yàn)過程中盡量減少人為干擾,進(jìn)一步改進(jìn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)減少系統(tǒng)誤差外,在對(duì)某一miRNA進(jìn)行深入研究之前,用其他方法確定基因芯片結(jié)果是有必要的。本實(shí)驗(yàn)方法具有快速、平行、高通量的特點(diǎn)。通過監(jiān)控細(xì)胞miRNA的表達(dá),可以幫助我們更好地了解這類小核酸分子的功能及作用機(jī)制。miRNA表達(dá)的比較性研究將可能發(fā)現(xiàn)新的診斷性標(biāo)志分子或治療性靶分子。總RNA中miRNA所占的比例極少(14謝謝觀看！謝謝觀看！15生物芯片檢測細(xì)胞中microRNA的表達(dá)MicroRNAExpressioninCellsDetectedbyOligonucleotideMicroarray07生技1生物芯片檢測細(xì)胞中microRNA的表達(dá)MicroRNA16

microRNA(miRNA)是一類在線蟲、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物中存在的小RNA分子,長度為18-26個(gè)核苷酸(nt)的小非編碼RNA，類似于siRNA的分子

。

miRNA通過調(diào)節(jié)基因表達(dá),參與調(diào)控細(xì)胞的眾多生物學(xué)功能,如生物發(fā)育、脂肪代謝,及細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等。它們通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)互補(bǔ),將mRNA剪切或是抑制其翻譯。

人類基因組中已發(fā)現(xiàn)300多種miRNA,而且預(yù)測實(shí)際數(shù)目會(huì)更多,它們可能會(huì)對(duì)人類基因組中近30%的基因發(fā)揮調(diào)控作用。但關(guān)于miRNA的表達(dá)模式、生物學(xué)功能、作用機(jī)制等,目前的認(rèn)識(shí)還不很清楚。在此,我們設(shè)計(jì)并制備了miRNA表達(dá)譜的寡核苷酸芯片,利用其快速、平行、高通量的檢測特點(diǎn),分析了6種不同細(xì)胞系中206個(gè)miRNA的表達(dá)水平特點(diǎn),為miRNA的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

microRNA(miRNA)是一類在線蟲、植171材料和方法1.1材料

實(shí)驗(yàn)所用6種人類腫瘤細(xì)胞系均為本實(shí)驗(yàn)室保存,分別HeLa(人宮頸癌上皮細(xì)胞)、K562(人慢性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞)、ES-2(人卵巢透明細(xì)胞癌)、MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞)、HT-29(人結(jié)腸腺癌細(xì)胞)和A549細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)。所有細(xì)胞系均在5%CO2條件下,用含有10%胎牛血清的適合培養(yǎng)基培養(yǎng)。1.2miRNA芯片的制備

所用的210個(gè)寡核苷酸探針為mirVanaTMmiRNAProbeSet試劑盒(Ambion),其中206個(gè)與已知的人類和小鼠miRNA序列互補(bǔ),4個(gè)為陽性對(duì)照。3×SSC點(diǎn)樣緩沖液溶解探針至50μmol/L,用SpotArrayTM24基因芯片點(diǎn)樣儀(PerkinElmer)印制于SuperChipTMⅠ(PerkinElmer)玻片表面,制成miRNA寡核苷酸芯片。每次雜交前進(jìn)行水合、干燥等點(diǎn)樣后處理。1材料和方法1.1材料181.3miRNA的準(zhǔn)備、標(biāo)記與雜交

依m(xù)irVanaTMmiRNAIsolationKit(Ambion)說明書提取腫瘤細(xì)胞的富集miRNA。用UniversalMicroplateSpectrophotometer(Bio-tek)紫外分析儀測定miRNA濃度和純度,8mol/L尿素變性的15%聚丙烯酰胺凝膠檢測質(zhì)量。依m(xù)irVanaTMmiRNALabelingKit(Ambion)說明書對(duì)富集miRNA進(jìn)行熒光標(biāo)記,方法簡單描述如下:先在miRNA末端添加20-50個(gè)經(jīng)過氨基修飾的核苷酸尾,然后與帶有N-羥基琥珀酰亞胺酯類(Nhydroxysuccinimidylester,NHS-ester)的熒光染料Cy3(AmershamBiosciences)反應(yīng)。標(biāo)記后的樣本與3×miRNAHybridizationBuffer(Ambion)混合并將其均勻鋪于miRNA寡核苷酸芯片表面,小心加蓋玻片封片,置于密封濕潤的雜交倉中,42℃雜交16h。最后進(jìn)行雜交后清洗。1.3miRNA的準(zhǔn)備、標(biāo)記與雜交191.4芯片圖像的采集與數(shù)據(jù)處理采用ScanArrayTMExpress1.0(PerkinElmer)掃描儀進(jìn)行掃描,掃描強(qiáng)度為100%,光電倍增管增益為80%,掃描精度為10μm。掃描所得圖ScanArray3.0(PerkinElmer)軟件進(jìn)行處理,得到雜交信號(hào)和與之相應(yīng)背景的平均強(qiáng)度值,從雜交信號(hào)值中減去背景值得到校正信號(hào)強(qiáng)度值。6種細(xì)胞檢測所得數(shù)據(jù)經(jīng)陽性對(duì)照均衡后比較。判斷表達(dá)存在差異的標(biāo)準(zhǔn)是:①相互比較的miRNA信號(hào)熒光強(qiáng)度值相差至少大于1000;②若其中有信號(hào)強(qiáng)度值小于100,則同一種miRNA在不同細(xì)胞的熒光值差異需大于500。數(shù)據(jù)經(jīng)總體歸一化和對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后,Cluster3.0(StanfordUniversity)進(jìn)行聚類分析。

1.4芯片圖像的采集與數(shù)據(jù)處理201.5RT-PCR驗(yàn)證miRNA分別取6種細(xì)胞總RNA各5μg,用與miR-17-5p、miR-21前體互補(bǔ)的特異性引物和逆轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptⅢ(Invitrogen)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),分別取1μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)中的miRNA序列設(shè)計(jì)特異性引物,有關(guān)參數(shù)見表1。用15%非變性聚丙烯酰胺凝膠驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物大小;用LabWorks4.0ImageAcquisitionandAnalysis軟件進(jìn)行定量及數(shù)據(jù)處理。取PCR產(chǎn)物連入pGEM-T-easy載體(Promega),送交測序,測序結(jié)果與提供的miRNA序列一致。1.5RT-PCR驗(yàn)證miRNA21植物昆蟲和哺乳動(dòng)物中存在的小RNA分子長度為18-26個(gè)核苷酸nt課件222結(jié)果2.1miRNA的抽提和純化6種細(xì)胞系富集miRNA的D260nm/D280nm值均為1.8～2.1,符合miRNA芯片的檢測要求。2.2芯片雜交結(jié)果標(biāo)記、純化后的miRNA與芯片雜交,用掃描儀在543nm通道處對(duì)芯片進(jìn)行掃描,得到圖像,用Scanarray3.0軟件分析miRNA在6種細(xì)胞中的表達(dá)水平。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn),91個(gè)miRNA在6種細(xì)胞間沒有明顯差異,115個(gè)miRNA存在差異。miR-21在6種細(xì)胞中校正信號(hào)強(qiáng)度/背景強(qiáng)度均大于2倍,表達(dá)水平均較高;miR-17-5p和miR-20a在6種細(xì)胞中的表達(dá)情況相似,在ES-2細(xì)胞中校正信號(hào)強(qiáng)度/背景強(qiáng)度大于10倍,表達(dá)較高;miR-126與miR-128a和miR-151,miR-145與miR-297-1在HeLa和MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)水平類似。見表2。2結(jié)果2.1miRNA的抽提和純化23植物昆蟲和哺乳動(dòng)物中存在的小RNA分子長度為18-26個(gè)核苷酸nt課件242.3數(shù)據(jù)聚類分析將掃描得到的雜交后圖像用ScanArray3.0軟件進(jìn)行處理,所得數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化和對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后,用Cluster3.0進(jìn)行聚類分析。結(jié)果,MCF-7和HeLa細(xì)胞miRNA的表達(dá)譜聚為一類。2.4RT-PCR檢測用特異性引物對(duì)miR-17-5p、miR-21前體進(jìn)行擴(kuò)增,同時(shí)以U6作為內(nèi)參。各細(xì)胞中miRNA前體的表達(dá)水平經(jīng)內(nèi)參校正后,發(fā)現(xiàn)miR-17-5p前體在K562細(xì)胞中的表達(dá)水平最高,在ES-2細(xì)胞中的表達(dá)量次之;miR-21在6種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平均較高,與芯片檢測結(jié)果基本一致(圖1)。2.3數(shù)據(jù)聚類分析25圖一圖一263討論

microRNA是一類在線蟲、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物中存在的小RNA分子,它們通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)互補(bǔ),將mRNA剪切或是抑制其翻譯。已很明確,miRNA在調(diào)控基因表達(dá)過程中發(fā)揮非常重要的作用,而理解miRNA在生物體內(nèi)如何發(fā)揮作用的關(guān)鍵是要知道m(xù)iRNA的表達(dá)模式。但是因?yàn)閙iRNA的長度非常短(只有18-26nt),檢測miRNA的方法受到很大的限制。我們利用生物芯片的高通量、高敏感性的特點(diǎn),為在組織和細(xì)胞中檢測多種miRNA提供了理想的手段。

3討論microRNA是一類在線蟲、植物、昆27

實(shí)驗(yàn)中用熒光標(biāo)記的miRNA直接與miRNA檢測芯片雜交,檢測發(fā)現(xiàn)6種細(xì)胞系有各自不同的miRNA表達(dá)譜。實(shí)驗(yàn)檢測到miR-21在6種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平均較高,這與文獻(xiàn)報(bào)道的miR-21在70%的肺癌和70%的結(jié)直腸癌患者中表達(dá)上調(diào)一致[6]。Iorio等[7]也發(fā)現(xiàn),miR-21在乳腺癌中表達(dá)明顯上調(diào),而且在一定程度上可以顯示腫瘤的惡性程度。miRNA集簇存在是其一個(gè)顯著特征,我們檢測到miR-17-5p與miR-20a的表達(dá)水平類似,而也有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-17-5p與miR-20a及其他4種miRNA成集簇存在于