石蠟切片法課件

一、

取材二、

固定三、

浸洗（沖洗）四、

脫水五、

透明六、

浸蠟（透蠟）七、

包埋

八、

切片九、

展片和貼片（裱片）十、

烤片十一、

染色十二、

封固（封片）十三、

貼標簽

一、取材1、用銳利刀、剪剪切組織塊，不可來回切割和用力擠、壓，以免損傷組織。2、組織塊大小一般為5×5×2mm。3、切好的組織塊經生理鹽水清洗后可用牙簽挑起放入固定液，不可用鑷子夾以防組織塊被損傷。4、軟組織不易切小或易變形組織不宜切小，可先取稍大的組織塊固定2~3小時，待組織塊稍變硬后再修切成薄的小塊繼續(xù)固定。

三、浸洗（沖洗）1、目的：洗去過剩的固定液，防沉漬。2、Bouin’s液固定的材料直接用70%的酒精洗數(shù)次，以洗去黃色；千萬不能用水洗，防膠原纖維膨脹而使組織疏離。

四、

脫水1、目的：浸洗后的組織塊含有部分水分，而水與透明劑不能相混合，故必須徹底脫水以利于組織透明與浸蠟。2、過程：酒精逐級脫水(45~60min)以避免組織過度收縮。70%→80%→90%→95%Ⅰ→95%Ⅱ→100%Ⅰ→100%Ⅱ(1)95%與100%二級中<2hr，以防組織變硬、脆化；（2）盛純酒精的缸子的蓋子邊緣可涂一層凡士林以防吸收空氣中的水分；（3）純酒精中如有水分用灰白無水CuSO4(濾紙包卷)吸去。（4）脫水過程如需過夜應停留于70%酒精中。

五、

透明1、二甲苯作脫水劑和石蠟的媒介，取代酒精，便于石蠟滲入組織，利于包埋、切片且能與封片樹膠相混合。2、透明時間≤30~45min，以防組織強烈收縮、變硬和變脆。3、過程：酒精：二甲苯（1：1）10~20min→二甲苯Ⅰ10~15min→二甲苯Ⅱ10~15min→二甲苯Ⅲ10~15min→透明為止4、脫水兼透明：叔丁醇或正丁醇防組織收縮、脆硬，適用于較成熟的卵巢組織。

六、

浸蠟（透蠟）1、目的：以石蠟取代透明劑二甲苯，使組織中的一切空隙為石蠟透入而填滿。2、過程：二甲苯：石蠟（1：1或分級25%、50%、70%石蠟）20~30min→石蠟Ⅰ45~60min→石蠟Ⅱ45~60min→石蠟Ⅲ45~60min3、溫度要恒定，一般比石蠟熔點高2~3℃4、石蠟：（1）舊蠟比新蠟好；（2）新蠟要長時間煎煉以除去雜質氣體，直至呈黃色、質地細膩而柔和；（3）舊蠟中含二甲苯要加熱使其蒸發(fā)干凈；（4）必要時添加5~10%蜂蠟以增加石蠟韌度。5、軟蠟（42~50℃）和硬蠟（52~58℃）：組織硬、切片薄、室溫高→用硬蠟組織軟、切片厚、室溫低→用軟蠟

八、切片1、單面刀片修整蠟塊，長：寬約3：2，長邊與刀刃平行。2、木塊上先熔上一點蠟，再用燙蠟鏟將蠟塊牢固地粘在木塊上；之后沿蠟塊四周用燒熱的解剖針燙幾下，使蠟塊粘牢。3、安裝，刀口與蠟塊的角度<100。4、切片：5~8m；左手用毛筆托住蠟帶，右手不斷搖動切片機，獲連續(xù)切片。5、切片前，將蠟塊置冰箱冷藏一下；較硬、難切的材料，可將蠟塊在甘油：50%酒精=1：1液中半浸泡數(shù)天再進行切片。

四、切片發(fā)生嚴重皺紋：（1）蠟太軟、室溫過高→用冰塊冰一下再切；（2）切片刀不鋒利→磨刀；（3）刀的切削角過小→切刀片僅能在蠟塊切削面上浮切→改變切削角五、蠟片裂紋：（1）切片刀口缺口刀紋；（2）刀刃不干凈→干布擦；（3）蠟塊中具有堅硬雜質或塵埃：石蠟過濾及修塊時用刀削去各個方面的表面蠟（紙屑）。六、切片厚薄不勻：（1）

加滑油；（2）螺絲要檸緊；（3）切削角不適宜。七、切片中組織與蠟分離：透蠟不足，從新浸蠟、包埋。十、

烤片

1、展片時是利用水使切片展平，但載玻片與蠟片之間尚留有部分水分，烤干便是將水分通過溫箱加熱后除去，使組織在脫蠟后依然能夠粘貼在載玻片上。若水分未烤干，則脫蠟時組織會脫落。2、烤干時的溫度<60℃，一般以50℃較為適當；也可置37℃溫箱內烤干（約12~24hr，烤干后蠟片在玻片上呈透明狀）。烤干的時間，以底烤去水分為原則。

十一、

染色1、原理：（1）

物理作用即滲透和吸附等；（2）化學作用：細胞核呈酸性，易于為堿性染料（氧化蘇木精）著色；細胞質呈堿性，易于為酸性染料（伊紅）著色；核仁一般呈堿性（大量組蛋白和少量RNA），為酸性染料（伊紅）著色。2、染色液：（1）氧化蘇木精：已配（2）伊紅：0.1~1%的酒精溶液，95%酒精配制3、染色過程：二甲苯Ⅰ2~5min→二甲苯Ⅱ2~5min→酒精：二甲苯（1：1）5min→100%酒精2min→95%酒精2min→90%酒精2min→80%酒精2min→70%酒精2min→50%酒精2min→DW2min→蘇木精染色8~15min→自來水沖洗15min，防脫落→50%酒精2min→70%酒精2min→80%酒精2min→90%酒精2min→0.5%的伊紅溶液（95%酒精配制）數(shù)秒~1min→95%酒精Ⅰ2min→95%酒精Ⅱ2min→100%酒精Ⅰ2min→100%酒精Ⅱ2min→酒精：二甲苯（1：1）2min→二甲苯Ⅰ2min→二甲苯Ⅱ2min4、酒精和二甲苯使用時間過久，濃度會下降，應更換新液。更換各級酒精時，無須全部更換?？蓪⒏骷壘凭蚨妆揭来谓狄患壥褂?，如將第一缸95%酒精降為90%酒精、第二缸無水酒精降為第一缸無水酒精，那么只要將第二缸無水酒精更換成新液即可。5、操作要快防切片在空氣中停留過長。

十二、

封固（封片）把切片由二甲苯中取出，用布或紙把組織四周多余的二甲苯擦去。滴一滴樹膠在組織上，加蓋蓋玻片。樹膠濃度要合適，多少也要恰當。如果樹膠滴得太多，不僅浪費，封固后也不美觀；滴得太少，會在蓋玻片與載玻片之間留有