乳酸脫氫酶(LDH)比色法測試盒

乳酸脫氫酶(LDH)比色法測試盒乳酸脫氫酶(LDH)比色法測試盒乳酸脫氫酶(LDH)比色法測試盒FocusonyourresearchServiceforlifescience乳酸脫氫酶〔ＬＤＨ〕比色法測試盒貨號：Ｅ－ＢＣ－Ｋ０４６－Ｍ方儀器：酶標(biāo)儀〔４４０－４６０ｎｍ〕規(guī)格：９６Ｔ〔４０ｓFocusonyourresearchServiceforlifescience根本信息用途本試劑盒合用于檢測血清、血漿、胸水、組織、細(xì)胞等樣本中LDH活力。檢測范圍及敏捷度檢測范圍：6-1000U/L敏捷度：6U/L背景介紹乳酸脫氫酶〔EC，LDH〕是一種氧化還原酶，它催化丙酮酸和乳酸的互相轉(zhuǎn)變，同時將NADH氧化成NAD+[1]。LDH是一種四聚體分子，由兩個亞基構(gòu)成，分別為H亞基和M亞基[2]。在組織損害或紅細(xì)胞溶血后，細(xì)胞將LDH開釋到血液中。細(xì)胞外的LDH活性用于檢測細(xì)胞損害或細(xì)胞死亡[3]。檢測原理以輔酶I為遞氫體，LDH催化乳酸產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸與2,4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，后者在堿性溶液中呈棕紅色，顏色的深淺與丙酮酸的濃度呈正比，經(jīng)過測定OD值，可計算LDH的活力。本試劑盒測組織和細(xì)胞樣本時，需測定總蛋白濃度，介紹使用BCA法〔貨號：E-BC-K318-M〕。供給試劑和物件編號名稱規(guī)格(size)保留方式〔96T〕(Storage)試劑一基質(zhì)液5mL×1瓶2-8℃保留6個月(Reagent1)(SubstrateBuffer)試劑二輔酶I粉劑×1支2-8℃保留6個月(Reagent2)(CoenzymeI)試劑三顯色劑5mL×1瓶2-8℃避光保留6(Reagent3)(ChromogenicAgent)個月試劑四堿溶液5mL×1瓶2-8℃保留6個月(Reagent4)(AlkaliReagent)試劑五2μmol/mL丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品1mL×1支2-8℃保留6個月(Reagent5)(2μmol/mLPyruvicAcidStandard)96孔酶標(biāo)板1板96孔覆膜2張樣本地點標(biāo)志表1張注：試劑嚴(yán)格按上表中的保留條件保留，不一樣試劑盒中的試劑不可以混用。所需自備物件儀器：酶標(biāo)儀〔440-460nm〕、37℃恒溫箱、微量移液器〔1000μL，200μL，100μL，10μL〕、多道移液器〔300μL〕。耗材：槍頭〔1000μL，200μL，10μ〕L。試劑：雙蒸水、生理鹽水〔0.9%NaCl〕或PBS〔M，pH〕。FocusonyourresearchServiceforlifescience安全提示配制試劑以前，請穿著好防備裝備。試劑盒中局部試劑含有危險性物質(zhì)。嚴(yán)禁食入，吸入，直接接觸眼睛、皮膚和衣物。使用完后的試劑瓶經(jīng)完全沖洗后再辦理。實驗準(zhǔn)備實驗重點點①加試劑二應(yīng)用液時，將槍頭伸入反應(yīng)液中頻頻吸打幾次，并注意改換槍頭。②參加試劑四后，用多道移液器進(jìn)行混勻。③加樣時要盡量防備產(chǎn)生氣泡。假定有氣泡，用槍頭破裂后再進(jìn)行測定。試劑準(zhǔn)備①試劑盒中試劑均衡至室溫〔試劑二除外〕。②試劑二應(yīng)用液的配制：取試劑二置于冰盒上，一支粉劑加１．３３雙ｍ蒸Ｌ水溶解，混勻，２－８℃１可５天保。存如需頻頻檢測，可分裝后－２０℃保留１個月。③試劑四應(yīng)用液的配制：按試劑四：雙蒸水為１：的９體積比混勻即可，現(xiàn)用現(xiàn)配，２－８℃可保留７天。樣本準(zhǔn)備樣本辦理詳細(xì)操作請拜見附錄2。樣本的稀釋在正式檢測前，需選擇2-3例預(yù)期差別大的樣本稀釋成不一樣濃度進(jìn)行預(yù)實驗，依據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，聯(lián)合本試劑盒的檢測范圍〔6-1000U/L〕，請參照下表稀釋：LDH活力〔U/L〕樣本與稀釋液的體積比稀釋倍數(shù)<1000不稀釋11000-100001:910注：稀釋液為雙蒸水或生理鹽水〔0.9%NaCl〕或PBS〔M，pH〕。FocusonyourresearchServiceforlifescience操作過程檢測環(huán)境室內(nèi)溫度２５－３０℃，最正確檢測波４長５０ｎｍ，最后反應(yīng)３體２積５μＬ。微量移液器的本卷須知①移液器取試劑前，請用該試劑均衡槍頭〔遲緩吸液，頻頻吹打三次〕。②不可以將槍頭外壁上的液體參加到反應(yīng)系統(tǒng)。酶標(biāo)板設(shè)置注：A-H：標(biāo)準(zhǔn)孔；S1-S40：測定孔；S1'-S40'：比較孔。標(biāo)曲濃度稀釋表編號2μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品(μL)雙蒸水(μL)標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL)A04000B10390C20380D40360E80320F120280G160240H200200標(biāo)準(zhǔn)品濃度〔μｍｏｌ／ｍＬ：〕參加到反應(yīng)系統(tǒng)以前的標(biāo)準(zhǔn)品濃度。操作步驟①標(biāo)準(zhǔn)孔：取５μＬ雙蒸水參加到標(biāo)準(zhǔn)孔中，再?。競€不一樣濃度的標(biāo)準(zhǔn)２品０各μＬ，分別參加對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)孔中；測定孔：２加０入μ待Ｌ測樣本；比較孔：５參加μ雙Ｌ蒸水、２０μＬ待測樣本。②向步驟①中的各孔參加２５μ試Ｌ劑一。③向步驟②中的測定孔參加５μ試Ｌ劑二應(yīng)用液。④混勻，３７℃孵育１５ｍｉｎ。⑤向步驟④中的各孔參加２５μ試Ｌ劑三，混勻，３７℃孵育１５ｍｉｎ。⑥向步驟⑤中的各孔參加２５０μＬ試劑四應(yīng)用液，混勻，室溫靜置５ｍｉｎ。⑦波長４５０ｎｍ，測Ｏ定Ｄ值。FocusonyourresearchServiceforlifescience操作表標(biāo)準(zhǔn)孔測定孔比較孔雙蒸水〔μL〕5--5不一樣濃度標(biāo)準(zhǔn)品〔μL〕20----待測樣本〔μL〕--2020試劑一〔μL〕252525試劑二應(yīng)用液〔μL〕--5--混勻，37℃孵育15min。試劑三〔μL〕252525混勻，37℃孵育15min。試劑四應(yīng)用液〔μL〕250250250混勻，室溫靜置5min，波長450nm，測定OD值。結(jié)果計算標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=ax+b血清、血漿、澆灌液、細(xì)胞培育液樣本：定義：每升樣本37℃與基質(zhì)作用15min，在反應(yīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生1μmol丙酮酸為1個LDH活力單位〔U〕。計算公式：*LDH活力〔U/L〕=(ΔA-b)÷a×f×1000450動物組織、細(xì)胞樣本：定義：每克組織蛋白37℃與基質(zhì)作用15min，在反應(yīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生1μmol丙酮酸為1個LDH活力單位〔U〕。計算公式：*LDH活力〔U/gprot〕=(ΔA450-b)÷a×÷fCpr×1000注：y：標(biāo)準(zhǔn)品在450nm波優(yōu)點的絕對OD值x：標(biāo)準(zhǔn)品的濃度a：標(biāo)曲的斜率b：標(biāo)曲的截距ΔA450：測定孔OD值-比較孔OD值f：待測樣本參加檢測系統(tǒng)以前的稀釋倍數(shù)Cpr：待測樣本的蛋白濃度〔gprot/L〕1000*：1L=1000mLFocusonyourresearchServiceforlifescience實例剖析比如檢測人血清：用PBS〔M，pH〕將人血清稀釋10倍，取mL稀釋后的人血清，按操作表操作，結(jié)果以下：標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=x，測定孔均勻OD值為，比較孔均勻OD值為，計算結(jié)果為：÷×10×1000LDH活力〔U/gprot〕=--0.00789)=U/gprot依據(jù)說明書操作，測定人血清〔稀釋10倍，加樣量20μL〕、豬血漿〔稀釋50倍，加樣量20μL〕、大鼠肺組織〔10%組織勻漿的蛋白含量g/L，稀釋500倍，加樣量20μL〕、HepG2細(xì)胞〔蛋白含量g/L，稀釋200倍，加樣量20μL〕中乳酸脫氫酶的活力〔以以下圖〕。參照文件HolbrookJJ,LiljasA,SteindelSJ,etal.4LactateDehydrogenase[J].Enzymes,1975,11(8):191-292.MaekawaM.Lactatedehydrogenaseisoenzymes[J].JournalofChromatographyBBiomedicalSciences&Applications,1988,429(429):373-398.DrentM,CobbenNA,HendersonRF,etal.Usefulnessoflactatedehydrogenaseanditsisoenzymesasindicatorsoflungdamageorinflammation[J].EuropeanRespiratoryJournal,1996,9(8):1736-1742.FocusonyourresearchServiceforlifescience附錄１重點數(shù)據(jù)技術(shù)參數(shù)檢測范圍6-1000U/L均勻批間差2.4%敏捷度6U/L均勻批內(nèi)差1.8%均勻回收率98%批間差用三個不一樣生產(chǎn)批號的試劑盒，檢測在檢測范圍內(nèi)的高濃度樣本、中濃度樣本和低濃度樣本，每個批號每個濃度的樣本重復(fù)檢測3次〔n=3〕，分別計算每個批號各濃度樣本的均值，并按公式計算出各濃度樣本的相對誤差，最后得出均勻批間差2.4%批內(nèi)差用一個試劑盒，檢測在檢測范圍內(nèi)的高濃度樣本、中濃度樣本和低濃度樣本，各個濃度的樣本重復(fù)檢測6次(n=6)，計算出均勻批內(nèi)差1.8%CV=s×100%s---Standarddeviationx敏捷度依據(jù)試劑盒操作規(guī)程以丙酮酸做標(biāo)準(zhǔn)品測定標(biāo)曲和20個空白的OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出空白OD值的標(biāo)準(zhǔn)差。依據(jù)IUPAC公認(rèn)的公式3倍的標(biāo)準(zhǔn)差除以標(biāo)曲斜率計算出敏捷度mmol/L。依據(jù)乳酸脫氫酶的定義，換算成LDH活力為6U/L回收率向樣本中增添高、中、低三個濃度的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度樣本重復(fù)測3次〔n=3〕，做回收率實驗，得出均勻回收率98%標(biāo)準(zhǔn)曲線〔數(shù)據(jù)僅供參照〕用丙酮酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)曲〔以以下圖〕：FocusonyourresearchServiceforlifescience用乳酸脫氫酶〔ＳＩＧＭＡ，Ｌ２６２５－５０ＫＵ，６３５０Ｕ／ｍＬ〕作為標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：將乳酸脫氫酶用PBS〔M，pH〕配制成5KU/mL，再用PBS〔M，pH〕稀釋至以下的濃度：濃度〔KU/mL〕123410KU/mL標(biāo)準(zhǔn)品(μL)51050100200300400PBS(μL)495490450400300200100依據(jù)以下操作表進(jìn)行操作，讀取數(shù)據(jù)：空白孔標(biāo)準(zhǔn)孔雙蒸水〔μL〕25乳酸脫氫酶標(biāo)準(zhǔn)品〔μL〕20試劑一〔μL〕2525試劑二應(yīng)用液〔μL〕5混勻，37℃孵育15min。試劑三〔μL〕2525混勻，37℃孵育15min。試劑四應(yīng)用液〔μL〕250250混勻，室溫靜置5min，波長450nm，測定OD值。讀取數(shù)據(jù)〔以以下圖〕：FocusonyourresearchServiceforlifescience附錄２樣本制備樣本要求①在測試以前選擇2-3個預(yù)期差別大的樣本進(jìn)行預(yù)實驗。②血清樣本中不可以有溶血，由于紅細(xì)胞內(nèi)的LDH活力較血清內(nèi)高約100倍。樣本中不可以含有SDS、Tween20、NP-40、TritonX-100等去污劑。④不可以使用草酸鹽抗凝。〔草酸鹽會克制LDH活力〕⑤參照稀釋倍數(shù)見常有樣本稀釋倍數(shù)表。以下樣本辦理方法僅供參照。血清樣本取新鮮血液，在25℃條件下靜置30min使血液凝固。4℃，2000×g離心15min，取上層淡黃色澄清液體即為血清。血清置于冰上待測，假定不可以當(dāng)日檢測，于-80℃保留，可儲藏一個月。血漿樣本取新鮮血液參加到盛有抗凝劑的管中〔肝素作為抗凝劑，肝素濃度為：IU/mL血液〕，顛倒混勻，4℃，700-1000×g離心10min，取上層淡黃色透明液體即為血漿，不可以汲取中間白色擾亂層〔白細(xì)胞和血小板〕。將血漿置于冰上待測，假定不可以當(dāng)日檢測，于-80℃保留，可儲藏一個月。胸水樣本取新鮮胸水參加到盛有抗凝劑的管中〔肝素作為抗凝劑，肝素濃度為：IU/mL胸水〕，顛倒混勻，4℃，10000×g離心10min，取上清于冰上待測，假定不可以當(dāng)日檢測，于-80℃保留，可保留一個月。１０％組織勻漿取g新鮮組織塊，用2-8℃的PBS〔M，pH〕漂洗，去除血液，濾紙吸干，稱重，放入勻漿容器中，依據(jù)重量〔g〕:體積〔mL〕=1:9的比率參加2-8℃的勻漿介質(zhì)，進(jìn)行勻漿，4℃，10000×g離心10min，取上清置于冰上待測，假定不可以當(dāng)日檢測，于-80℃保留，可保留一個月。細(xì)胞樣本懸浮細(xì)胞：4℃，1000×g離心10min采集細(xì)胞，依據(jù)106個細(xì)胞參加300-500μL勻漿介質(zhì)的比率參加勻漿介質(zhì)，進(jìn)行機(jī)械勻漿，充分破裂〔無顯然的細(xì)胞積淀，可在顯微鏡下察看〕，4℃，10000×g離心10min，取上清置于冰上待測，假定不可以當(dāng)日檢測，于-80℃保留，可保留一個月。貼壁細(xì)胞：吸棄培育液，用PBS〔M，pH〕將細(xì)胞洗一遍。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞〔不可以用胰酶辦理〕，參加2-5mLPBS〔M，pH〕，采集細(xì)胞懸液，后辦理方法見懸液細(xì)胞辦理方法。FocusonyourresearchServiceforlifescience注：勻漿介質(zhì)：生理鹽水〔0.9%NaCl〕或PBS〔M，pH〕。勻漿方式：a.手工勻漿b.機(jī)械勻漿c.超聲破裂ａ．手工勻漿：3將組織稱重，剪碎呈1cm大小，倒入玻璃勻漿管中，參加勻漿介質(zhì)，左手持勻漿管將下端置于冰浴中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次〔6～8min〕，組織充分勻漿；或許倒入研缽中，參加液氮進(jìn)行研磨，充分研磨后，參加勻漿介質(zhì)，再將制好的勻漿汲取到EP管中備用。ｂ．機(jī)械勻漿：將已稱重的組織裝入EP管，參加勻漿介質(zhì)，用組織勻漿機(jī)，在冰水浴條件下，60Hz，90s研磨制成組織勻漿，皮膚、肌肉組織及植物組織等可適合延伸勻漿時間。ｃ．超聲破裂：在冰水浴條件下，用超聲波發(fā)生器以振幅14μm超聲辦理60s，破裂細(xì)胞；或許用超聲波破裂儀，200W，2s/次，空隙3s，總時間5min。常有樣本的稀釋倍數(shù)表：樣本稀釋倍數(shù)人血清10倍稀釋人血漿15-30倍稀釋豬血清10-20倍稀釋人胸水5