分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)復(fù)習(xí)題

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)復(fù)習(xí)題實(shí)驗(yàn)中為什么選用RNA而非DNA作為模板調(diào)取目的基因？因?yàn)檎婧松?，DNA出了含有編碼序列外還含有非編碼序列（內(nèi)含子），而我們只需目的基因這段序列。RNA是經(jīng)過加工的，沒有內(nèi)含子，通過提取高質(zhì)量的RNA再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄即可得到不含內(nèi)含子的cDNA，即所需的目的基因。RNA提取過程中的注意事項(xiàng)有哪些？（1）所有玻璃器皿均應(yīng)于使用前180℃干烤3h或更長時(shí)間，塑料器皿可用0.1％DEPC浸泡或用氯仿洗滌。（2）全部實(shí)驗(yàn)過程最好戴一次性手套，接觸可能污染了RNA酶的物品后，應(yīng)更換手套。（3）配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1％DEPC在37℃處理12h以上，然后高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，用經(jīng)DEPC處理過的無菌蒸餾水配制，然后用0.22um濾膜過濾除菌。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，有哪幾種引物可用？如何進(jìn)行選擇？（1）引物：OligodT：①長度適宜，一般為15~30個(gè)堿基；G+C含量，一般為40%~60%；②4種堿基應(yīng)隨機(jī)分布；③引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列；④2個(gè)引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)堿基的互補(bǔ)；⑤引物3′端不應(yīng)有任何修飾；⑥引物5′端可以修飾簡述用氯化鈣方法制備感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化原理？（1）正在生長的大腸桿菌在0℃下加入到低滲的CaCl2溶液中，便會造成細(xì)胞膨脹成球（感受態(tài)細(xì)胞）。（2）感受態(tài)細(xì)胞與外源質(zhì)粒DNA形成一種粘著在細(xì)胞表面上的隊(duì)DNAase抗性的羧基鈣磷酸復(fù)合物。（3）42℃下作短暫的熱刺激期間，這種復(fù)合物便會被細(xì)胞吸收。（4）進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。（5）將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化過程中要注意哪些因素細(xì)胞生長狀態(tài)和密度、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度、試劑的質(zhì)量、防止雜菌和雜DNA的污染簡述質(zhì)粒DNA提取原理在pH12.0~12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性，但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，二質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可去除大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。請列舉4種陽性克隆的篩選方法和鑒定方法（一）采用遺傳學(xué)方法可篩選特定的重組體DNA1.利用抗性標(biāo)記可篩選出帶有載體的細(xì)菌克隆2.利用不同標(biāo)記可篩選出帶有重組體的細(xì)菌克隆①插入滅活法利用特定抗性基因的失活進(jìn)行篩選②α-互補(bǔ)篩選是利用功能互補(bǔ)的基因片段（二）核酸雜交法適合從文庫中篩選特定的DNA（三）PCR技術(shù)可對特定的DNA進(jìn)行直接鑒定（四）酶切鑒定是利用限制酶酶切圖譜鑒定特定的DNA簡單談一下如何選定酶切鑒定時(shí)所用的酶限制性內(nèi)切酶的選用必須根據(jù)載體和插入片段上酶切微點(diǎn)來確定。酶切鑒定是必須的，基于下述：限制性圖譜個(gè)體特異性，不同的載體或DNA分子物理圖譜不同，酶切后片段大小不一樣，電泳圖譜一樣。統(tǒng)一載體連接不同的DNA片段，不同的載體連接統(tǒng)一片段（片段上也有位點(diǎn)）酶切圖譜是不同的。插入法（單酶單切點(diǎn)）或替代法（雙酶雙位點(diǎn)）酶切，一般來說用3種限制酶切：可鑒定載體及插入片段的大小、方向、切后并電泳分析，以確定是否得到預(yù)期的rDNA。簡述克隆大鼠的GAPDH基因的主要步驟①TRlzol試劑提取小鼠肝臟總RNA②核酸的定量③電泳檢測④PCR產(chǎn)物4℃保存或瓊脂糖凝膠電泳檢測⑤從瓊脂糖凝膠中分離回收PCR產(chǎn)物⑥6GAPDH基因的TA克隆、連接、轉(zhuǎn)化Trizo:是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍，酚等物質(zhì)，異硫氰酸胍能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。核酸由于核蛋白二級結(jié)構(gòu)的破壞而解離下來。異硫氰酸胍同時(shí)抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶，保持RNA的完整性。熒光定量PCR中，請說明閾、基線、Ct值的概念。Baseline（基線）：在PCR開始幾個(gè)循環(huán)內(nèi)所發(fā)散的熒光信號，這段時(shí)間內(nèi)定量PCR儀器還未能檢測到PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增，缺省設(shè)置為3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號（背景熒光信號）。Threshold（閾值）：用來確定Ct的熒光強(qiáng)度。是在熒光擴(kuò)增曲線上認(rèn)為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段在任意位置上，一般熒光閾值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。Ct值：到達(dá)閾值熒光信號所需要的循環(huán)數(shù)。在做熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意些什么？(1)在操作中，應(yīng)使用不含熒光物質(zhì)的一次性手套（經(jīng)常替換）、一次性轉(zhuǎn)移器吸頭（帶濾嘴自卸式），不能用手直接接觸毛細(xì)管、離心管的底部。(2)操作臺、移液器、離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀等儀器設(shè)備應(yīng)經(jīng)常用10%次氯酸或75%乙醇擦拭消毒。每次實(shí)驗(yàn)前后用10%次氯酸和70%乙醇擦拭移液器、操作臺。(3)配制反應(yīng)體系時(shí)，應(yīng)注意移液器的使用方法，所有的液體都要緩慢加至管底，不要加至管壁，所有液體的混勻要用振蕩器進(jìn)行，不能用移液器吹打，反映體系配制完畢后低速離心數(shù)秒，避免產(chǎn)生氣泡。影響質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的因素有哪些？轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化效率/細(xì)胞總數(shù)影響因素：（1）載體：載體的性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)、分子大小等（2）受體細(xì)胞（3）轉(zhuǎn)化過程獲得高轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵：感受態(tài)細(xì)菌的制備。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，請說明脂質(zhì)體接到轉(zhuǎn)染的原理脂質(zhì)體也稱人工細(xì)胞膜，是由脂質(zhì)雙分子層組成的，在水中可以自動生成閉合的雙層膜，最初，人們只是運(yùn)用脂質(zhì)體模擬生物膜，研究膜的構(gòu)造及功能，從而發(fā)現(xiàn)了膜的融合及內(nèi)吞作用，因而可用作外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的載體。現(xiàn)商品化的脂質(zhì)體通常是陽離子脂類和中性脂類的復(fù)合體。其中以陽離子脂類起主要作用，陽離子脂質(zhì)體既能與DNA可以通過靜電作用形成脂-DNA復(fù)合物，也能被表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜媳婦，從而引導(dǎo)DNA進(jìn)入細(xì)胞。中性脂類可促進(jìn)胞內(nèi)釋放DNA。請簡述熒光素酶報(bào)告基因簡單的實(shí)驗(yàn)流程。（1）構(gòu)建載體：把調(diào)控序列插入到含有螢火蟲熒光素酶（Lue）或海參熒光素酶（Rlue）的載體中。（2）轉(zhuǎn)染（3）提供刺激（4）檢測熒光16.RT-PCRRNA的多聚酶反應(yīng)（RT-PCR）是以mRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（reversetranscription，RT）與PCR，可用于檢測單個(gè)細(xì)胞或少數(shù)細(xì)胞中少于10個(gè)拷貝的RNA模板。RNA擴(kuò)增包括兩個(gè)步驟：在單引物的介導(dǎo)下和逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成RNA的互補(bǔ)cDNA，加熱后cDNA與RNA鏈解離，然后與另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成雙鏈靶DNA，最后擴(kuò)增靶DNA.用途:獲得所需cDNA片段；檢測基因表達(dá)注意問題：（1）PCR效率差異，重復(fù)性（2）內(nèi)參選定（3）mRNA豐度逆轉(zhuǎn)錄：RNA、緩沖液、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物（隨機(jī)引物:OligodT)PCR:cDNA、緩沖液、dNTP、rTaq、引物（特異引物)、Mg2+17.膠回收原理：回收柱（硅膠膜）在高鹽、低PH值的情況下吸附DNA，在低鹽、高PH值的情況下釋放DNA。影響膠回收的幾個(gè)影響因素，PH值、高鹽試劑、低鹽洗脫試劑。18.轉(zhuǎn)化(Transformation)：是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R-,M-)，它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)與熒光素酶活性檢測一、什么是報(bào)告基因？所謂的報(bào)告基因（reportergene）,是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。該基因的表達(dá)與插入基因的表達(dá)有關(guān)。該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是高靈敏度、可信性及檢測方便且適合大規(guī)模檢測。二、理想的報(bào)告基因：1.內(nèi)源性低2.細(xì)胞內(nèi)其它的基因產(chǎn)物不會干擾報(bào)告基因的檢測3.報(bào)告基因編碼產(chǎn)物的檢測應(yīng)該快速、簡便、靈敏度高并且重復(fù)性好三、熒光素酶報(bào)告基因載體常用的螢光素酶報(bào)告基因載體：螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因載體、海腎螢光素酶報(bào)告基因載體、pGL2,pGL3,pGL4螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因：螢火蟲luc以其高度的靈敏性和很寬的線性范圍而成為哺乳動物細(xì)胞中使用最多的報(bào)告基因。本次所用載體：promega公司的pGL3-promoter所用質(zhì)粒：pGL3-promoter-ERE(雌激素應(yīng)答元件）與配體結(jié)合的ER發(fā)生構(gòu)型改變，被激活形成二聚體，激活的ER二聚體與雌激素應(yīng)答元件(estrogenresponseelement,ERE)結(jié)合，ER-ERE復(fù)合物促使轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物形成并誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。四、熒光素酶報(bào)告基因簡單實(shí)驗(yàn)流程：1、構(gòu)建載體把調(diào)控序列連入到含有螢火蟲螢光素酶（luc）或海腎螢光素酶（Rluc）的載體中2、轉(zhuǎn)染3、提供刺激4、檢測熒光五、轉(zhuǎn)染原理：1.脂質(zhì)體也稱人工細(xì)胞膜，是由脂質(zhì)雙分子層組成的。在水中可以自動生成閉合的雙層膜，最初,人們只是運(yùn)用脂質(zhì)體模擬生物膜,研究膜的構(gòu)造及功能,從而發(fā)現(xiàn)了膜的融合及內(nèi)吞作用,因而可用作外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的載體。2.現(xiàn)商品化的脂質(zhì)體通常都