人教版高中生物選修3 專題1基因工程11 DNA重組技術(shù)的基本工具 教學(xué)課件

選修3現(xiàn)代生物技術(shù)專題專題1.基因工程1.1DNA重組技術(shù)的基本工具一、基因重組技術(shù)的概念二、DNA重組技術(shù)的基本工具選修3現(xiàn)代生物技術(shù)專題專題1.基因工程1.1DNA重組1一、基因工程的概念1．手段：通過體外____________和____________等技術(shù)，賦予生物以新的____________。2．目的：按照人們的愿望進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的_________和____________。3．設(shè)計和施工水平：____________水平，因此，基因工程又叫做DNA重組技術(shù)。DNA重組轉(zhuǎn)基因遺傳特性生物類型生物產(chǎn)品DNA分子一、基因工程的概念1．手段：通過體外____________2二、DNA重組技術(shù)的基本工具1．限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”(又稱限制酶)。(1)來源：主要是從____________中分離純化出來的。(2)功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的______________斷開，因此具有________性。經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：__________和________。原核生物磷酸二酯鍵專一黏性末端平末端二、DNA重組技術(shù)的基本工具1．限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手3前者是限制酶在它識別序列的______________將DNA的兩條鏈切開產(chǎn)生的，后者是限制酶在它識別序列的____________切開產(chǎn)生的。中心軸線兩側(cè)中心軸線處二、DNA重組技術(shù)的基本工具(3)種類EcoRⅠ和SmaⅠ限制酶識別序列均為6個核苷酸，其中EcoRⅠ識別的序列為_________，從__和___直接切割，產(chǎn)生的末端為_________;SmaⅠ識別的序列為___________,從___和___直接切割，產(chǎn)生的末端為_________GAATTCGA黏性末端CCCGGGCG平末端前者是限制酶在它識別序列的______________將DN42．DNA連接酶——“分子縫合針”。(1)作用：將______________“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的______________，形成重組DNA分子。(2)種類。①E·coliDNA連接酶：只能縫合DNA片段的____________。雙鏈DNA片段磷酸二酯鍵黏性末端二、DNA重組技術(shù)的基本工具2．DNA連接酶——“分子縫合針”。雙鏈DNA片段磷酸二酯鍵5②T4DNA連接酶：既可縫合DNA片段的黏性末端，又可縫合DNA片段的________，但連接后者的效率________。3．運(yùn)載體——“分子運(yùn)輸車”。(1)作用：攜帶__________進(jìn)入受體細(xì)胞。(2)種類：質(zhì)粒、__________的衍生物、動植物病毒等。平末端低外源基因λ噬菌體二、DNA重組技術(shù)的基本工具②T4DNA連接酶：既可縫合DNA片段的黏性末端，又可縫合D6①能夠在受體細(xì)胞中進(jìn)行__________，或整合到____________上，隨染色體DNA進(jìn)行同步復(fù)制。②有一個至多個__________切割位點，供外源基因插入。③具有特殊的________________，供重組DNA的鑒定和選擇。自我復(fù)制染色體DNA限制酶遺傳標(biāo)記基因(3)特點:二、DNA重組技術(shù)的基本工具①能夠在受體細(xì)胞中進(jìn)行__________，或整合到____7一、目的基因的獲取有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用。載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。1.2基因工程的基本操作程序二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種8一、目的基因的獲取（一）目的基因主要指的是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子（調(diào)節(jié)基因）。對基因組中某個基因通過克隆擴(kuò)增，獲得該基因進(jìn)行研究或應(yīng)用稱這種基因為目的基因。1.概念一、目的基因的獲取（一）目的基因主要指的是編9凡是編碼阻遏或激活結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的基因都稱為調(diào)節(jié)基因。把基因區(qū)分為結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因若著眼于這些基因所編碼的蛋白質(zhì)的作用：2.結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因凡是編碼酶蛋白、血紅蛋白、膠原蛋白或晶體蛋白等蛋白質(zhì)的基因都稱為結(jié)構(gòu)基因。（一）目的基因一、目的基因的獲取啟動子終止子啟動子終止子凡是編碼阻遏或激活結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的基因都10若轉(zhuǎn)入目的基因都是為了合成所需的酶、抗體、蛋白質(zhì)激素、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，則需轉(zhuǎn)入結(jié)構(gòu)基因。若轉(zhuǎn)入目的基因是為了調(diào)控某個結(jié)構(gòu)基因的活動，則可轉(zhuǎn)入調(diào)節(jié)基因。2.結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因（一）目的基因從基因工程的目的看一、目的基因的獲取若轉(zhuǎn)入目的基因都是為了合成所需的酶、抗體、蛋白11（1）基因文庫的概念（二）目的基因的獲取途徑1.從基因文庫中獲取一、目的基因的獲取將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因。基因組文庫部分基因文庫（cDNA文庫）未知序列（2）基因文庫的類型（1）基因文庫的概念（二）目的基因的獲取途徑1.從基因文庫中12（3）從基因組文庫中獲取目的基因一、目的基因的獲取基因組文庫概念如果基因文庫包含了某種生物的所有基因，那么，這種基因文庫叫做基因組文庫。（3）從基因組文庫中獲取目的基因一、目的基因的獲取基因組文13一、目的基因的獲取基因組文庫的構(gòu)建提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接重組載體基因組文庫導(dǎo)入受體菌中儲存一、目的基因的獲取基因組文庫的構(gòu)建提取某種生物的全部DNA14cDNA文庫的概念（4）從cDNA文庫中獲取目的基因（二）目的基因的獲取途徑如果基因文庫只包含了某種生物的一部分基因，這種基因文庫叫做部分基因文庫。一、目的基因的獲取cDNA文庫的概念（4）從cDNA文庫中獲取目的基因（二）15cDNA文庫的構(gòu)建提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA重組載體與載體連接雙鏈cDNA片段DNA聚合酶cDNA文庫導(dǎo)入受體菌中儲存單鏈DNA反（逆）轉(zhuǎn)錄酶反（逆）轉(zhuǎn)錄法一、目的基因的獲取cDNA文庫的構(gòu)建提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mR16非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子編碼區(qū)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄mRNA前體剪接有關(guān)的酶剪接mRNA單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶復(fù)制cDNA不含非編碼系列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子cDNA文庫的構(gòu)建反（逆）轉(zhuǎn)錄法一、目的基因的獲取非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子編碼區(qū)R17基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較一、目的基因的獲取基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫18基因組文庫與cDNA文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以區(qū)別一、目的基因的獲取基因組文庫與cDNA文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文19聯(lián)系基因組文庫與cDNA文庫的比較一、目的基因的獲取聯(lián)系基因組文庫與cDNA文庫的比較一、目的基因的獲取20（二）目的基因的獲取途徑2.鳥槍法這種方法有如用獵槍發(fā)射的散彈打鳥，無論哪一顆彈粒擊中目標(biāo)，都能把鳥打下來。（1）概念未知序列又叫“散彈射擊法”。將目的DNA隨機(jī)地處理成大小不同的片段，再將這些片段的序列連接起來的測序方法。(直接分離法)一、目的基因的獲取（二）目的基因的獲取途徑2.鳥槍法這種方法有212.鳥槍法未知序列（2）過程供體細(xì)胞中的DNA許多DNA片段限制酶受體細(xì)胞導(dǎo)入產(chǎn)生特定性狀目的基因分離一、目的基因的獲取表達(dá)運(yùn)載體與載體連接DNA連接酶2.鳥槍法未知序列（2）過程供體細(xì)胞中的DNA許多DNA片段222.鳥槍法未知序列（2）過程一、目的基因的獲取2.鳥槍法未知序列（2）過程一、目的基因的獲取233.化學(xué)合成法（二）目的基因的獲取途徑一、目的基因的獲取已知序列（1）根據(jù)已知的核苷酸序列合成DNA法結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成DNA合成儀3.化學(xué)合成法（二）目的基因的獲取途徑一、目的基因的獲取已知24（2）據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法3.化學(xué)合成法已知序列根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列推測目的基因化學(xué)合成結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測一、目的基因的獲?。?）據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法3.化學(xué)合成法已知序列25（二）目的基因的獲取途徑4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（1）概念多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點，是能短時間內(nèi)將微量的DNA大幅增加。這項技術(shù)是由穆里斯（K.Mullis）等人于1988年發(fā)明的，為此，穆里斯在1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎。一、目的基因的獲?。ǘ┠康幕虻墨@取途徑4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（1）264.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（2）原理DNA雙鏈半保留復(fù)制的原理，在體外將基因的核苷酸序列不斷地加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。（3）前提條件一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。一、目的基因的獲取4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（2）原理DN27（4）條件四種脫氧核苷酸DNA引物（左引物和右引物）：熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）模板DNA：原料：4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一小段單鏈DNADNA聚合酶（耐高溫）：目的基因一、目的基因的獲?。?）條件四種脫氧核苷酸DNA引物（左引物和右引物）：熱穩(wěn)定284.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（5）擴(kuò)增方式（6）結(jié)果以指數(shù)方式擴(kuò)增，即2n（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增。一、目的基因的獲取4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（5）擴(kuò)增方式（6）結(jié)果以指數(shù)294.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（7）過程（變性、退火、延伸）一、目的基因的獲取變性加熱至90～95℃雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈的DNA；冷卻至55～60℃引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對和結(jié)合，形成局部雙鏈；退火4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（7）過程（變性、退火、延伸）304.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（7）過程（變性、退火、延伸）一、目的基因的獲取加熱至70～75℃在Taq酶的作用下，以目的基因為模板，合成互補(bǔ)的新DNA鏈。延伸4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（7）過程（變性、退火、延伸）31一、目的基因的獲取反應(yīng)的條件熱變性退火（復(fù)性）延伸（7）過程4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一、目的基因的獲取反應(yīng)的條件熱變性退火（復(fù)性）延伸（7）過程32一、目的基因的獲取（7）過程4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一、目的基因的獲取（7）過程4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因331234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一、目的基因的獲取（7）過程1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸334理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一、目的基因的獲?。?）擴(kuò)增結(jié)果的曲線圖理想拷貝數(shù)=2n4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一、目的基因的35具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點。4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（9）優(yōu)點一、目的基因的獲取具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出36（10）PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)場所原理條件解旋方式酶特點結(jié)果堿基互補(bǔ)配對原則堿基互補(bǔ)配對原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶等4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一、目的基因的獲取（10）PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)37二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建小結(jié)從基因文庫中獲取鳥槍法獲取化學(xué)合成法獲取PCR技術(shù)獲取從基因組文庫中獲取從cDNA文庫中獲取二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建小結(jié)從基因文庫中獲取鳥槍法獲取化學(xué)合成38二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建是實施39二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.過程（1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。（2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.過程（1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，40二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.過程質(zhì)粒DNA分子一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶處理同一種二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.過程質(zhì)粒DNA分子一個切口兩個切口41二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建2.連接結(jié)果（1）運(yùn)載體與目的基因的連接（2）目的基因與目的基因的連接（3）運(yùn)載體與運(yùn)載體的連接二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建2.連接結(jié)果（1）運(yùn)載體與目的基因的連42二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.目的（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。（2）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。為什么要構(gòu)建表達(dá)載體？思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？（P15）二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.目的（1）使目的基因在受體細(xì)胞中43科學(xué)家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達(dá)。然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學(xué)家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因尾端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。資料分析:科學(xué)家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和44二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建4.表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)（2）啟動子（3）終止子（4）標(biāo)記基因位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞（1）目的基因二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建4.表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)（2）啟動子（3）終45不可以。因為目的基因在表達(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？（P15）5.幾個問題二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建不可以。（1）作為基因工程表達(dá)載體，只需含46a.生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達(dá)；b.通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；c.目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；d.為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；e.有時需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：a.生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子475.幾個問題（2）表達(dá)載體為什么一定要有啟動子？a.生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能有利于基因的表達(dá)；b.通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體細(xì)胞無法轉(zhuǎn)錄。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建5.幾個問題（2）表達(dá)載體為什么一定要有啟動子？a.生物之間48是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來。（4）標(biāo)記基因有什么作用？5.幾個問題終止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。（3）終止子的作用是什么？二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將49①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。注意②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵。③啟動子、終止子對于目的基因表達(dá)必不可少。④目的基因不能單獨進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DN50常用的受體細(xì)胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：（一）轉(zhuǎn)化三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。是某一基因型的細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收來自另一基因型的細(xì)胞的DNA而使它的基因型和表現(xiàn)型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。該現(xiàn)象首先發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌。常用的受體細(xì)胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵51（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（二）方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)朕r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)521.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法三53（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物的受傷部位（受傷處的細(xì)胞會分泌大量酚類化合物、中性糖，從而使農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞），并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中54根癌農(nóng)桿菌能在自然條件下趨化性地感染140多種雙子葉植物或裸子植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤。引發(fā)冠癭瘤的原因是，Ti質(zhì)粒上的T-DNA上有8個左右的基因在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，指導(dǎo)合成一種非常特殊的化合物冠癭堿，進(jìn)而引起轉(zhuǎn)化細(xì)胞癌變。發(fā)根農(nóng)桿菌發(fā)根農(nóng)桿菌則誘導(dǎo)產(chǎn)生發(fā)狀根，其特征是大量增生高度分支的根系。其Ri質(zhì)粒上有一段T-DNA。（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞根癌農(nóng)桿菌能在自然條件下趨化性地感染140多55根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中，并且可以通過減數(shù)分裂穩(wěn)定的遺傳給后代，這一特性成為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法植物轉(zhuǎn)基因的理論基礎(chǔ)。原理

Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)56科研人員將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應(yīng)用。原理三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞科研人員將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DN57Ti質(zhì)粒表達(dá)新性狀目的基因表達(dá)載體構(gòu)建轉(zhuǎn)入含有Vir致病基因農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物外植體細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA新的植物個體植物組培技術(shù)③轉(zhuǎn)化過程:為什么？為什么？Ti質(zhì)粒表達(dá)新性狀目的基因表達(dá)載體構(gòu)建轉(zhuǎn)入含有Vir致病基因58③轉(zhuǎn)化過程:DNA③轉(zhuǎn)化過程:DNA59三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞60利用農(nóng)桿菌對植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，首先將目的基因插入到Ti質(zhì)粒衍生的轉(zhuǎn)化載體上，形成重組DNA，然后將重組DNA轉(zhuǎn)入含有Vir致病基因的農(nóng)桿菌，再通過上述農(nóng)桿菌侵染植物外植體。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞③轉(zhuǎn)化過程:利用農(nóng)桿菌對植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，首先將目的基因插入到Ti61植物傷口處的細(xì)胞分泌大量的酚類化合物、中性糖，酚類化合物如乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（HO-AS）等，一些中性糖如L-阿拉伯糖、D-木糖等，上述物質(zhì)既是根瘤農(nóng)桿菌的趨化物，又是農(nóng)桿菌中毒性基因Vir表達(dá)的誘導(dǎo)物，在它們的作用下，導(dǎo)致T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移，從而侵染植物細(xì)胞。研究表明，作為主要誘導(dǎo)物的乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮等酚類物質(zhì)，主要在雙子葉植物細(xì)胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，因此根瘤農(nóng)桿菌不易直接侵染單子葉植物。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞為什么農(nóng)桿菌只侵染雙子葉植物和裸子植物而不能侵染單子葉植物呢？若想將一個抗病基因?qū)雴巫尤~植物，如小麥，從理論上說，你認(rèn)為應(yīng)該怎樣做？植物傷口處的細(xì)胞分泌大量的酚類化合物、中性糖62要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因為不是所有的農(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物。要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)性）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。如果想將一個抗病毒基因轉(zhuǎn)入小麥，也可以用農(nóng)桿菌，但要注意兩點：若想將一個抗病基因?qū)雴巫尤~植物，如小麥，從理論上說，你認(rèn)為應(yīng)該怎樣做？三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因為不是所有的農(nóng)桿菌63④優(yōu)點農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)與其他基因轉(zhuǎn)化體系相比，具有許多突出的優(yōu)點：A.該轉(zhuǎn)化體系是模仿或稱之為利用天然的轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，成功率高，效果好；B.農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的機(jī)理研究得最清楚，方法最成熟，應(yīng)用也最廣泛；三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞④優(yōu)點農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)與其他基因轉(zhuǎn)化體64C.農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的外源基因以單拷貝為多數(shù)，遺傳穩(wěn)定性好，并且多數(shù)符合孟德爾遺傳規(guī)律，因此轉(zhuǎn)基因植株能較好地為育種提供了中間選育材料；D.農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)操作比較容易，需要的儀器設(shè)備簡單，易于推廣。④優(yōu)點農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)與其他基因轉(zhuǎn)化體系相比，具有許多突出的優(yōu)點：三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞C.農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的外源基因以單65（2）基因槍法適用于單子葉植物該法又稱粒子轟擊，高速粒子噴射技術(shù)或基因槍轟擊技術(shù)，是由美康奈爾大學(xué)生物化學(xué)系John.C.Sanford等于1983年研究成功。是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞定義（2）基因槍法適用于單子葉植物該法又稱粒子66將直徑4um的鎢粉或金粉在供體DNA中浸泡，然后用基因槍將這些粒子打入細(xì)胞、組織或器官中，具有一次處理多個細(xì)胞的優(yōu)點，但轉(zhuǎn)化效率較低。另外這種方法也用于基因治療和抗體制備，并已取得初步成效?；驑尫ㄟ^程三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將直徑4um的鎢粉或金粉在供體DNA中浸泡67（3）花粉管通道法適用于被子植物三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（3）花粉管通道法適用于被子植物三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞68

植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆螅ǚ坌纬傻幕ǚ酃苓€未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），經(jīng)過珠心進(jìn)入胚囊，最終轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的合子或早期胚胎細(xì)胞(被整合到受體細(xì)胞的基因組中)，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個體。過程（3）花粉管通道法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞實例：抗蟲棉的培育植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通692.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞（1）方法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞思考：為什么要用受精卵而不用體細(xì)胞？顯微注射法將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中2.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞（1）方法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)70顯微注射法（microinjection）是利用管尖極細(xì)（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生的重組、缺失、復(fù)制或易位等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞顯微注射法（microinjection）71（2）操作程序三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞基因表達(dá)載體受精卵移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動物含目的基因的受精卵顯微注射導(dǎo)入培養(yǎng)后（2）操作程序三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞基因表達(dá)載體受精卵移72這種顯微注射術(shù)的程序，需有相當(dāng)精密的顯微操作設(shè)備，制造長管尖時，需用微量吸管拉長器，注射時需有固定管尖位置的微量操作器。這種技術(shù)的長處為任何DNA在原則上均可傳入任何種類的細(xì)胞內(nèi)。此法已成功運(yùn)用于包括小鼠、魚、大鼠、兔子及許多大型家畜，如牛、羊、豬等基因轉(zhuǎn)殖動物。（3）技術(shù)要求三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞這種顯微注射術(shù)的程序，需有相當(dāng)精密的顯微操733.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞常用法：Ca2+處理法常用菌：大腸桿菌微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞常用法：Ca2+處理法常用菌74受態(tài)細(xì)胞（competentcell）：主要原理就是通過處理使細(xì)胞的通透性變大，直觀的說，使得細(xì)胞膜表面出現(xiàn)一些孔洞，便于外源基因或載體進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。由于細(xì)胞膜的流動性，這種孔洞會被細(xì)胞自身所修復(fù)。理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞受態(tài)細(xì)胞（competentcell）：主要75④過程Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA思考：為什么要用Ca2+處理受體細(xì)胞？用Ca2＋處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞④過程Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合76④CaCl2法的過程A.將快速生長的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0℃）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細(xì)胞膨脹，同時Ca2+會使細(xì)胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區(qū)域，誘導(dǎo)細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞細(xì)胞。膜通透性發(fā)生變化，極易與外源DNA相粘附并在細(xì)胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基－磷酸鈣復(fù)合物。聯(lián)合其它的二價金屬離子（如Mn、Co）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，則可使轉(zhuǎn)化率提高100～1000倍。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞④CaCl2法的過程A.將快速生長的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（077B.此時，將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激（90s），細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)會發(fā)生劇烈擾動，并隨機(jī)出現(xiàn)許多間隙，外源DNA就可能被細(xì)胞吸收。進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)，實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。C.將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選出帶有外源DNA分子的陽性克隆。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞④CaCl2法的過程B.此時，將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激（90s），細(xì)78受體生物

植物

動物

微生物受體細(xì)胞導(dǎo)入方法受精卵、體細(xì)胞受精卵細(xì)胞、個體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)用Ca2+處理成感受態(tài)細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.導(dǎo)入三種不同生物受體細(xì)胞的方法的比較受體生物植物動物微生物受體細(xì)胞受精卵、體細(xì)胞79小結(jié)導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法CaCl2法不能百分之百成功的導(dǎo)入受體細(xì)胞中小結(jié)導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞三、將目的基因?qū)?0（一）分子水平上檢測四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測受體細(xì)胞中的標(biāo)記基因是否表達(dá)。2.檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否出入了目的基因，這是目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。3.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出來mRNA，這是檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步，采用DNA和RNA分子雜交技術(shù)。4.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)（一）分子水平上檢測四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測受體細(xì)胞81導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入重組質(zhì)粒導(dǎo)入普通質(zhì)粒未導(dǎo)入質(zhì)粒如何確定細(xì)胞中含有重組質(zhì)粒？質(zhì)粒上的標(biāo)記基因人工在質(zhì)粒上插入標(biāo)記基因?qū)胧荏w細(xì)胞導(dǎo)入重組質(zhì)粒導(dǎo)入普通質(zhì)粒未導(dǎo)入質(zhì)粒如質(zhì)粒上的人82四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測受體細(xì)胞中的標(biāo)記基因是否表達(dá)。（1）常見的標(biāo)記基因四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因抗生素抗性基因使細(xì)菌對氨芐青霉素、氯霉素等抗生素產(chǎn)生抗性的基因。使細(xì)菌對四環(huán)素產(chǎn)生抗性的基因。產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液（藍(lán)灰色）褪色。四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測受體細(xì)胞中的標(biāo)記基因是否表達(dá)83是由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。以前被稱為抗菌素，事實上它不僅能殺滅細(xì)菌而且對霉菌、支原體、衣原體、螺旋體、立克次氏體等其它致病微生物也有良好的抑制和殺滅作用，通常將抗菌素改稱為抗生素?？股?四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測受體細(xì)胞中的標(biāo)記基因是否表達(dá)。（2）幾種抗菌物質(zhì)的作用是由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等84從放線菌金色鏈叢菌的培養(yǎng)液等分離出來的抗菌物質(zhì)，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、立克次體、濾過性病毒、螺旋體屬乃至原蟲類都有很好的抑制作用，對結(jié)核菌、變形菌等則無效。四環(huán)素：四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測受體細(xì)胞中的標(biāo)記基因是否表達(dá)。（2）幾種抗菌物質(zhì)的作用從放線菌金色鏈叢菌的培養(yǎng)液等分離出來的抗菌物85四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測受體細(xì)胞中的標(biāo)記基因是否表達(dá)。（2）幾種抗菌物質(zhì)的作用殺死生長的細(xì)菌，但不殺死停止生長的細(xì)菌。環(huán)絲氨酸：主要用于對青霉素敏感的革蘭氏陽性菌、陰性菌的感染，如大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌等。氨芐青霉素：四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測受體細(xì)胞中的標(biāo)記基因是否表達(dá)86四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因（3）質(zhì)粒上的標(biāo)記基因四、目的基因的檢測與鑒定四環(huán)素氨芐青霉（3）質(zhì)粒上的標(biāo)記基因四、目的基因的檢測與鑒定87（4）利用四環(huán)素抗性基因插入失活進(jìn)行檢測四、目的基因的檢測與鑒定如果在四環(huán)素抗性基因上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。四環(huán)素抗性基因失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來；四環(huán)素抗性基因不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。（4）利用四環(huán)素抗性基因插入失活進(jìn)行檢測四、目的基因的檢測與88導(dǎo)入重組質(zhì)粒導(dǎo)入普通質(zhì)粒未導(dǎo)入質(zhì)粒含四環(huán)素+環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基不抗四環(huán)素，生長被抑制并保留抗四環(huán)素，細(xì)菌生長，被環(huán)絲氨酸殺死含氨芐青霉素培養(yǎng)基無環(huán)絲氨酸使碘-青霉素指示液（藍(lán)灰色）褪色不抗四環(huán)素，生長被抑制不能使碘-青霉素指示液（藍(lán)灰色）褪色四、目的基因的檢測與鑒定導(dǎo)入重導(dǎo)入普未導(dǎo)入含四環(huán)素+環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基不抗四環(huán)素，生長被89（5）利用氨芐青霉素抗性基因插入失活進(jìn)行檢測如果氨芐青霉素抗性基因上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。四、目的基因的檢測與鑒定外源DNA插入氨芐青霉素抗性基因（5）利用氨芐青霉素抗性基因插入失活進(jìn)行檢測如果氨芐青霉素抗90（1）方法DNA分子雜交技術(shù)（DNA與DNA分子雜交）2.檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否出入了目的基因，這是目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。四、目的基因的檢測與鑒定（1）方法DNA分子雜交技術(shù)（DNA與DNA分子雜交）2.檢91（2）基因探針又稱“寡核苷酸探針”，簡稱“探針”，就是一段與目的基因或DNA互補(bǔ)的特異核苷酸序列，它可以包括整個基因，也可以僅僅是目的基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA。DNA探針將一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或熒光染料等標(biāo)記后制成的探針。可與固定在硝酸纖維素膜的DNA或RNA進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合，經(jīng)放射自顯影或其他檢測手段就可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在。四、目的基因的檢測與鑒定（2）基因探針又稱“寡核苷酸探針”，簡稱“探92①首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；②將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針；③使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。（3）過程轉(zhuǎn)基因生物的DNADNA探針14N14N變性變性15N15N穩(wěn)定性同位素四、目的基因的檢測與鑒定①首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；②將含目的基因的DN93四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定943.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出來mRNA，這是檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步，采用DNA和RNA分子雜交技術(shù)。（1）方法分子雜交技術(shù)（DNA與mRNA分子雜交）變性DNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14N14N（2）過程四、目的基因的檢測與鑒定3.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出來mRNA，這是檢測目的基因是否發(fā)95蘇云金桿菌將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體

出現(xiàn)雜交帶組織培養(yǎng)Bt毒素蛋白蛋白質(zhì)提取4.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)（1）方法抗原-抗體雜交（2）過程四、目的基因的檢測與鑒定蘇云金桿菌將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗96四、目的基因的檢測與鑒定（二）個體水平上檢測抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。四、目的基因的檢測與鑒定（二）個體水平上檢測抗蟲、抗病接種實97思考與探究3.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？提示：有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。思考與探究3.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)98提示：基本操作如下：（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。（2）將cDNA前接在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個表達(dá)載體。（3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死亡；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌的群落，則表明β-珠蛋白基因已進(jìn)入其中。（4）培養(yǎng)進(jìn)入了β-珠蛋白的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取β-珠蛋白。4.β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成部分。當(dāng)它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的β-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計？思考與探究提示：基本操作如下：4.β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成部99尋根問底提示：結(jié)構(gòu)基因文科是獲取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲取，也可以通過反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫。1.為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行么？尋根問底提示：結(jié)構(gòu)基因文科是獲取目的基因的方法之一，并不是唯100提示：有人采用總DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個生物中的總的DNA提取出來，用過注射或花粉管通道法導(dǎo)入手提植物，沒有進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建，這種方法針對性差，完全靠運(yùn)氣，也無法確定是什么基因?qū)肓耸痔嶂参?。此法目前爭議頗多，嚴(yán)格來講不算基因工程。2.將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡便嗎？如果這么做，結(jié)果會怎么樣？尋根問底提示：有人采用總DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個生物中的總101結(jié)構(gòu)基因：是決定合成某一種蛋白質(zhì)或RNA分子結(jié)構(gòu)相應(yīng)的一段DNA。結(jié)構(gòu)基因的功能是把攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)錄給mRNA（信使核糖核酸）,再以mRNA為模板合成具有特定氨基酸序列的蛋白質(zhì)或RNA。調(diào)節(jié)基因：是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的基因。它能使結(jié)構(gòu)基因在需要某種酶時就合成某種酶,不需要時,則停止合成，它對不同染色體上的結(jié)構(gòu)基因有調(diào)節(jié)作用。操縱基因:位于結(jié)構(gòu)基因的一端，是操縱結(jié)構(gòu)基因的基因。當(dāng)操縱基因“開動”時,處于同一染色體上的，由它所控制的結(jié)構(gòu)基因就開始轉(zhuǎn)錄、翻譯和合成蛋白質(zhì)。當(dāng)“關(guān)閉”時，結(jié)構(gòu)基因就停止轉(zhuǎn)錄與、翻譯。操縱基因與一系列受它操縱的結(jié)構(gòu)基因合起來就形成一個操縱子。結(jié)構(gòu)基因：是決定合成某一種蛋白質(zhì)或RNA分子結(jié)構(gòu)相應(yīng)的一段D102鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥紅細(xì)胞圓餅狀血紅蛋白正常氨基酸谷氨酸

GAA

┷┷┷mRNADNA┯┯┯

CTT

GＡA

┷┷┷GUA

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GTA

┷┷┷突變纈氨酸鐮刀狀異常5.實例基因探針β—珠蛋白四、基因治療曙光初照抗原——抗體雜交DNA分子雜交鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥紅細(xì)胞圓餅狀血紅蛋白正常氨基酸103（二）基因治療把正?；?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能，達(dá)到治療疾病的目的。四、基因治療曙光初照1.概念2.類型（1）體外基因治療（2）體內(nèi)基因治療（二）基因治療把正?；?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的104（二）基因治療四、基因治療曙光初照（1）體外基因治療概念病例是指在體外完成基因轉(zhuǎn)移，再篩選成功轉(zhuǎn)移的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，最后重新輸入患者體內(nèi)。復(fù)合型免疫缺陷癥（二）基因治療四、基因治療曙光初照（1）體外基因治療概念病例105病例復(fù)合型免疫缺陷癥①病因：腺苷酸脫氨酶基因缺失缺乏腺苷酸脫氨酶免疫功能下降（二）基因治療四、基因治療曙光初照（1）體外基因治療病例復(fù)合型免疫缺陷癥①病因：腺苷酸脫氨酶基因缺失缺乏腺苷酸脫106②治療方法：提取患者的淋巴細(xì)胞篩選出能夠產(chǎn)生腺苷酸脫氨酶的淋巴細(xì)胞患者體內(nèi)含有轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞導(dǎo)入正常的腺苷酸脫氨酶基因?qū)⒃摿馨图?xì)胞擴(kuò)增后轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)半年后，血液檢測被改造的淋巴細(xì)胞、腺苷酸脫氨酶患者產(chǎn)生抗體的功能顯著改善四、基因治療曙光初照1990年9月②治療方法：提取患者的淋巴細(xì)胞篩選出能夠產(chǎn)生腺苷酸脫氨酶的淋107四、基因治療曙光初照（2）體內(nèi)基因治療概念直接向人體組織中轉(zhuǎn)移基因的治病方法。病例囊性纖維化病是一種遺傳性外分泌腺疾病，主要影響胃腸道和呼吸系統(tǒng)，通常具有慢性梗阻性肺部病變、胰腺外分泌功能不良和汗液電解質(zhì)異常升高的特征。四、基因治療曙光初照（2）體內(nèi)基因治療概念直接向人體組織中轉(zhuǎn)108（2）體內(nèi)基因治療病例囊性纖維化病由位于第7對染色體CF基因突變引起的常染色體隱性遺傳病。北美白種人種常見的一種遺傳病，患者汗液中氯離子的濃度升高，支氣管被異常的黏液堵塞，常于幼年時死于肺部感染。病因四、基因治療曙光初照（2）體內(nèi)基因治療病例囊性纖維化病由位于第7對染色體CF基因109四、基因治療曙光初照無論哪一種基因治療，目前都是出于初期的臨床試驗階段。可以說，在沒有完全解釋人類基因組的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制，充分了解基因調(diào)控機(jī)制和疾病的分子機(jī)理之前，進(jìn)行基因治療是十分困難的。另外，還存在著技術(shù)方面、倫理道德方面，以及安全性方面的諸多困難。四、基因治療曙光初照無論哪一種基因治療，目前都110（三）用于基因治療的基因種類1.從健康人體上分離得到的功能正常的基因。2.反義基因3.自殺基因用以取代病變基因，或依靠其表達(dá)產(chǎn)物，來彌補(bǔ)病變基因帶來的生理缺陷，如對血友病和地中海貧血病的治療。即通過產(chǎn)生的mRNA分子，與病變基因產(chǎn)生的mRNA進(jìn)行互補(bǔ)，來阻斷非正常蛋白質(zhì)合成。是編碼可以殺死癌變細(xì)胞的蛋白酶基因。四、基因治療曙光初照（三）用于基因治療的基因種類1.從健康人體上分離得到的功能正111選修3現(xiàn)代生物技術(shù)專題專題1.基因工程1.1DNA重組技術(shù)的基本工具一、基因重組技術(shù)的概念二、DNA重組技術(shù)的基本工具選修3現(xiàn)代生物技術(shù)專題專題1.基因工程1.1DNA重組112一、基因工程的概念1．手段：通過體外____________和____________等技術(shù)，賦予生物以新的____________。2．目的：按照人們的愿望進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的_________和____________。3．設(shè)計和施工水平：____________水平，因此，基因工程又叫做DNA重組技術(shù)。DNA重組轉(zhuǎn)基因遺傳特性生物類型生物產(chǎn)品DNA分子一、基因工程的概念1．手段：通過體外____________113二、DNA重組技術(shù)的基本工具1．限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”(又稱限制酶)。(1)來源：主要是從____________中分離純化出來的。(2)功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的______________斷開，因此具有________性。經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：__________和________。原核生物磷酸二酯鍵專一黏性末端平末端二、DNA重組技術(shù)的基本工具1．限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手114前者是限制酶在它識別序列的______________將DNA的兩條鏈切開產(chǎn)生的，后者是限制酶在它識別序列的____________切開產(chǎn)生的。中心軸線兩側(cè)中心軸線處二、DNA重組技術(shù)的基本工具(3)種類EcoRⅠ和SmaⅠ限制酶識別序列均為6個核苷酸，其中EcoRⅠ識別的序列為_________，從__和___直接切割，產(chǎn)生的末端為_________;SmaⅠ識別的序列為___________,從___和___直接切割，產(chǎn)生的末端為_________GAATTCGA黏性末端CCCGGGCG平末端前者是限制酶在它識別序列的______________將DN1152．DNA連接酶——“分子縫合針”。(1)作用：將______________“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的______________，形成重組DNA分子。(2)種類。①E·coliDNA連接酶：只能縫合DNA片段的____________。雙鏈DNA片段磷酸二酯鍵黏性末端二、DNA重組技術(shù)的基本工具2．DNA連接酶——“分子縫合針”。雙鏈DNA片段磷酸二酯鍵116②T4DNA連接酶：既可縫合DNA片段的黏性末端，又可縫合DNA片段的________，但連接后者的效率________。3．運(yùn)載體——“分子運(yùn)輸車”。(1)作用：攜帶__________進(jìn)入受體細(xì)胞。(2)種類：質(zhì)粒、__________的衍生物、動植物病毒等。平末端低外源基因λ噬菌體二、DNA重組技術(shù)的基本工具②T4DNA連接酶：既可縫合DNA片段的黏性末端，又可縫合D117①能夠在受體細(xì)胞中進(jìn)行__________，或整合到____________上，隨染色體DNA進(jìn)行同步復(fù)制。②有一個至多個__________切割位點，供外源基因插入。③具有特殊的________________，供重組DNA的鑒定和選擇。自我復(fù)制染色體DNA限制酶遺傳標(biāo)記基因(3)特點:二、DNA重組技術(shù)的基本工具①能夠在受體細(xì)胞中進(jìn)行__________，或整合到____118一、目的基因的獲取有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用。載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。1.2基因工程的基本操作程序二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種119一、目的基因的獲?。ㄒ唬┠康幕蛑饕傅氖蔷幋a蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子（調(diào)節(jié)基因）。對基因組中某個基因通過克隆擴(kuò)增，獲得該基因進(jìn)行研究或應(yīng)用稱這種基因為目的基因。1.概念一、目的基因的獲?。ㄒ唬┠康幕蛑饕傅氖蔷?20凡是編碼阻遏或激活結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的基因都稱為調(diào)節(jié)基因。把基因區(qū)分為結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因若著眼于這些基因所編碼的蛋白質(zhì)的作用：2.結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因凡是編碼酶蛋白、血紅蛋白、膠原蛋白或晶體蛋白等蛋白質(zhì)的基因都稱為結(jié)構(gòu)基因。（一）目的基因一、目的基因的獲取啟動子終止子啟動子終止子凡是編碼阻遏或激活結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的基因都121若轉(zhuǎn)入目的基因都是為了合成所需的酶、抗體、蛋白質(zhì)激素、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，則需轉(zhuǎn)入結(jié)構(gòu)基因。若轉(zhuǎn)入目的基因是為了調(diào)控某個結(jié)構(gòu)基因的活動，則可轉(zhuǎn)入調(diào)節(jié)基因。2.結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因（一）目的基因從基因工程的目的看一、目的基因的獲取若轉(zhuǎn)入目的基因都是為了合成所需的酶、抗體、蛋白122（1）基因文庫的概念（二）目的基因的獲取途徑1.從基因文庫中獲取一、目的基因的獲取將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因?；蚪M文庫部分基因文庫（cDNA文庫）未知序列（2）基因文庫的類型（1）基因文庫的概念（二）目的基因的獲取途徑1.從基因文庫中123（3）從基因組文庫中獲取目的基因一、目的基因的獲取基因組文庫概念如果基因文庫包含了某種生物的所有基因，那么，這種基因文庫叫做基因組文庫。（3）從基因組文庫中獲取目的基因一、目的基因的獲取基因組文124一、目的基因的獲取基因組文庫的構(gòu)建提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接重組載體基因組文庫導(dǎo)入受體菌中儲存一、目的基因的獲取基因組文庫的構(gòu)建提取某種生物的全部DNA125cDNA文庫的概念（4）從cDNA文庫中獲取目的基因（二）目的基因的獲取途徑如果基因文庫只包含了某種生物的一部分基因，這種基因文庫叫做部分基因文庫。一、目的基因的獲取cDNA文庫的概念（4）從cDNA文庫中獲取目的基因（二）126cDNA文庫的構(gòu)建提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA重組載體與載體連接雙鏈cDNA片段DNA聚合酶cDNA文庫導(dǎo)入受體菌中儲存單鏈DNA反（逆）轉(zhuǎn)錄酶反（逆）轉(zhuǎn)錄法一、目的基因的獲取cDNA文庫的構(gòu)建提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mR127非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子編碼區(qū)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄mRNA前體剪接有關(guān)的酶剪接mRNA單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶復(fù)制cDNA不含非編碼系列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子cDNA文庫的構(gòu)建反（逆）轉(zhuǎn)錄法一、目的基因的獲取非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子編碼區(qū)R128基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較一、目的基因的獲取基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫129基因組文庫與cDNA文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以區(qū)別一、目的基因的獲取基因組文庫與cDNA文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文130聯(lián)系基因組文庫與cDNA文庫的比較一、目的基因的獲取聯(lián)系基因組文庫與cDNA文庫的比較一、目的基因的獲取131（二）目的基因的獲取途徑2.鳥槍法這種方法有如用獵槍發(fā)射的散彈打鳥，無論哪一顆彈粒擊中目標(biāo)，都能把鳥打下來。（1）概念未知序列又叫“散彈射擊法”。將目的DNA隨機(jī)地處理成大小不同的片段，再將這些片段的序列連接起來的測序方法。(直接分離法)一、目的基因的獲?。ǘ┠康幕虻墨@取途徑2.鳥槍法這種方法有1322.鳥槍法未知序列（2）過程供體細(xì)胞中的DNA許多DNA片段限制酶受體細(xì)胞導(dǎo)入產(chǎn)生特定性狀目的基因分離一、目的基因的獲取表達(dá)運(yùn)載體與載體連接DNA連接酶2.鳥槍法未知序列（2）過程供體細(xì)胞中的DNA許多DNA片段1332.鳥槍法未知序列（2）過程一、目的基因的獲取2.鳥槍法未知序列（2）過程一、目的基因的獲取1343.化學(xué)合成法（二）目的基因的獲取途徑一、目的基因的獲取已知序列（1）根據(jù)已知的核苷酸序列合成DNA法結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成DNA合成儀3.化學(xué)合成法（二）目的基因的獲取途徑一、目的基因的獲取已知135（2）據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法3.化學(xué)合成法已知序列根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列推測目的基因化學(xué)合成結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測一、目的基因的獲?。?）據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法3.化學(xué)合成法已知序列136（二）目的基因的獲取途徑4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（1）概念多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點，是能短時間內(nèi)將微量的DNA大幅增加。這項技術(shù)是由穆里斯（K.Mullis）等人于1988年發(fā)明的，為此，穆里斯在1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎。一、目的基因的獲?。ǘ┠康幕虻墨@取途徑4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（1）1374.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（2）原理DNA雙鏈半保留復(fù)制的原理，在體外將基因的核苷酸序列不斷地加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。（3）前提條件一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。一、目的基因的獲取4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（2）原理DN138（4）條件四種脫氧核苷酸DNA引物（左引物和右引物）：熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）模板DNA：原料：4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一小段單鏈DNADNA聚合酶（耐高溫）：目的基因一、目的基因的獲取（4）條件四種脫氧核苷酸DNA引物（左引物和右引物）：熱穩(wěn)定1394.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（5）擴(kuò)增方式（6）結(jié)果以指數(shù)方式擴(kuò)增，即2n（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增。一、目的基因的獲取4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（5）擴(kuò)增方式（6）結(jié)果以指數(shù)1404.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（7）過程（變性、退火、延伸）一、目的基因的獲取變性加熱至90～95℃雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈的DNA；冷卻至55～60℃引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對和結(jié)合，形成局部雙鏈；退火4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（7）過程（變性、退火、延伸）1414.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（7）過程（變性、退火、延伸）一、目的基因的獲取加熱至70～75℃在Taq酶的作用下，以目的基因為模板，合成互補(bǔ)的新DNA鏈。延伸4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（7）過程（變性、退火、延伸）142一、目的基因的獲取反應(yīng)的條件熱變性退火（復(fù)性）延伸（7）過程4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一、目的基因的獲取反應(yīng)的條件熱變性退火（復(fù)性）延伸（7）過程143一、目的基因的獲?。?）過程4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一、目的基因的獲?。?）過程4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1441234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一、目的基因的獲?。?）過程1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3145理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一、目的基因的獲?。?）擴(kuò)增結(jié)果的曲線圖理想拷貝數(shù)=2n4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一、目的基因的146具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點。4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（9）優(yōu)點一、目的基因的獲取具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出147（10）PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)場所原理條件解旋方式酶特點結(jié)果堿基互補(bǔ)配對原則堿基互補(bǔ)配對原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶等4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一、目的基因的獲?。?0）PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)148二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建小結(jié)從基因文庫中獲取鳥槍法獲取化學(xué)合成法獲取PCR技術(shù)獲取從基因組文庫中獲取從cDNA文庫中獲取二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建小結(jié)從基因文庫中獲取鳥槍法獲取化學(xué)合成149二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建是實施150二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.過程（1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。（2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.過程（1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，151二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.過程質(zhì)粒DNA分子一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶處理同一種二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.過程質(zhì)粒DNA分子一個切口兩個切口152二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建2.連接結(jié)果（1）運(yùn)載體與目的基因的連接（2）目的基因與目的基因的連接（3）運(yùn)載體與運(yùn)載體的連接二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建2.連接結(jié)果（1）運(yùn)載體與目的基因的連153二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.目的（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。（2）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。為什么要構(gòu)建表達(dá)載體？思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？（P15）二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.目的（1）使目的基因在受體細(xì)胞中154科學(xué)家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達(dá)。然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因尾端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。資料分析:科學(xué)家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和155二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建4.表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)（2）啟動子（3）終止子（4）標(biāo)記基因位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞（1）目的基因二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建4.表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)（2）啟動子（3）終156不可以。因為目的基因在表達(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？（P15）5.幾個問題二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建不可以。（1）作為基因工程表達(dá)載體，只需含157a.生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身