實驗四PCR及電泳技術(shù)

實驗4PCR及電泳技術(shù)實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!1.PCR的基本原理PCR基本原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCR的基本步聚1、變性(Denaturation)

：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。2、退火(Annealing)

：當(dāng)溫度突然降低時，反應(yīng)體系中引物和其互補的DNA模板在局部形成雜交鏈。3、延伸(Extension

)：在DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在條件下，5’→3’的聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應(yīng)。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95℃)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意圖①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；5’3’3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’3’3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG加熱94℃實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!PCRCycle-Step3-

At72℃

TaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionasplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈。3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCDNA聚合酶TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGDNA聚合酶5’5’3’3’引物引物實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!PCR儀實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!1、PCR反應(yīng)成分1）模板

單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得到條cDNA。一般100ngDNA模板/100l。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。最好做濃度梯度對照從而確定最佳條件。PCR反應(yīng)體系模板引物TaqDNA聚合酶4種dNTP混合物Mg2+10×緩沖液實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!3）TaqDNA聚合酶一般0.5-2.5U/50l；酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量；濃度過高可引起會造成雜帶、特異產(chǎn)物帶不清晰等不好的結(jié)果，濃度過低則得不到所需的產(chǎn)物。最可靠的做法是先做濃度對照,再根據(jù)結(jié)果決定最佳條件。實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!5）10×PCR緩沖液(Mg2+)：500mMKCl，100mMTris-HCl(pH8.4)，150mMMgCl2，1mg/ml明膠。實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!PCR擴增程序:

94℃,300S

94℃,60S

55℃,60S

72℃,60S

72℃,7min30循環(huán)實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!電泳分離的原理電泳(electrophoresis)溶液中帶電粒子(離子)在電場中移動的現(xiàn)象。1、電荷效應(yīng)利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達到分離的目的。

2、分子篩效應(yīng)

不同的分離介質(zhì)形成的孔徑不同，在孔徑大的介質(zhì)中泳動速度快，相反則慢。3、待分離生物大分子的性質(zhì)一般來說，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。4、電場強度

電場強度（V/cm）是每厘米的電位降，也稱電位梯度。電場強度越大，電泳速度越快。實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!瓊脂糖凝膠電泳對于雙鏈DNA，電泳遷移率的大小主要與DNA分子大小有關(guān)。實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!瓊脂糖濃度（％）DNA有效分離范圍（Kb）0.530～10.712～0.81.010～0.51.27～0.41.53～0.2不同濃度大小瓊脂糖的有效分離范圍實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!引物酶②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；PCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’引物酶3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC引物3’5’5’3’實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!Endofthe1stPCRCycle–ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一個循環(huán)需2-4min，2-3h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’5’3’3’實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!PCR儀實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!PCR儀實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!2）引物

（1）濃度0.1-0.5M濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配，反應(yīng)特異性下降。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵；PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板脫氧核糖核酸互補的程度；人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng)離子交換HPLC進行純化。實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!4）dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP4）

dNTP濃度取決于擴增片段的長度;四種dNTP濃度應(yīng)相等;

PCR常用的濃度為50-200μM，不能低于10-15μM。濃度過高會抑制Taq酶的活性，易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!PCR反應(yīng)體系：

10×PCRbuffer2.5μldNTPmix各0.5μl引物10.5μl引物20.5μlDNA模板2μlTaq酶0.5μl加雙蒸水至總體積為25μl實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!2.電泳技術(shù)電泳槽制膠板梳子電源電泳儀提供穩(wěn)定的電壓或電流電極緩沖液和凝膠的容器形成點樣孔制備垂直或水平凝膠實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!電泳技術(shù)的種類按支持介質(zhì)的不同可分為：⑴紙電泳(Paperelectrophorisis)⑵醋酸纖維薄膜電泳(CelluloseAcetateelectrophoresis)⑶瓊脂凝膠電泳(AgarGelelectrophoresis)⑷聚丙烯酰胺凝膠電泳(PolyacrylamideGelelectrophoresis)(PAGE)⑸SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)。實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!1、熔化瓊脂糖時，宜低火，防暴沸；2、倒膠時溫度要低于60℃且速度要慢；3、拔梳子和點樣要小心，以免破壞膠孔；4、電泳儀打開前應(yīng)檢查電壓、電流旋紐是否處于零位置，工作電壓一般為60-80V，400mA，電泳完畢應(yīng)將電壓、電流旋鈕恢復(fù)到零位置；5、防止EB污染和紫外燈傷眼。注意事項：實驗四PCR及電泳技術(shù)共24頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!MP