噬菌體載體和柯斯載體

第五章噬菌體載體和柯斯載體噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁(yè)!本章主要內(nèi)容噬菌體一般特性λ噬菌體柯斯質(zhì)粒M13噬菌體1、M13噬菌體特性及基因組結(jié)構(gòu)2、M13噬菌體載體類型及特點(diǎn)噬菌粒比較噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁(yè)!節(jié)噬菌體的一般生物學(xué)特性（Bacteriophage，phage）

噬菌體可以在脫離寄主細(xì)胞的狀態(tài)下保持生命，但一旦脫離了寄主細(xì)胞，就不能生長(zhǎng)和復(fù)制利用寄主的核糖體、蛋白質(zhì)合成因子、氨基酸和產(chǎn)能體系，進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁(yè)!一、噬菌體的結(jié)構(gòu)和其核酸類型結(jié)構(gòu)：無(wú)尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、線狀體型核酸類型：最常見的是雙鏈線性DNA、雙鏈環(huán)形DNA、單鏈環(huán)形DNA、單鏈線形DNA、單鏈RNA。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁(yè)!不同的噬菌體之間的核酸分子量的差異也是比較大的。大分子量的噬菌體生命周期比較復(fù)雜；對(duì)寄主的依賴性較低有些噬菌體的DNA堿基不是由標(biāo)準(zhǔn)的A/T/C/G組成的。

Example：

T4噬菌體DNA沒有C堿基，取代的是5-羥甲基胞嘧啶（HMC）；SP01噬菌體DNA中沒有T堿基，取代的是5-羥甲基尿嘧啶（HMU）。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁(yè)!噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁(yè)!三、噬菌體的溶菌生命周期噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期只具有溶菌生長(zhǎng)周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體。烈性噬菌體溶菌生長(zhǎng)的基本過程：1、吸附吸附到位于感染細(xì)胞表面的特殊接受器上2、注入噬菌體DNA穿過細(xì)胞壁注入寄主細(xì)胞3、轉(zhuǎn)變被感染的細(xì)胞成為制造噬菌體顆粒的場(chǎng)所4、合成大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質(zhì)5、組裝包裝了DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒6、釋放子代噬菌體顆粒從寄主細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁(yè)!1、概念溫和噬菌體：既能進(jìn)入溶菌生命周期又能進(jìn)入溶源生命周期。溶源性細(xì)菌：具有一種完整的噬菌體基因組的細(xì)菌溶源化：用溫和噬菌體感染細(xì)菌培養(yǎng)物使之形成溶源性細(xì)菌的過程噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁(yè)!2、溶源周期的主要特征λ噬菌體和P1噬菌體λ噬菌體的特征：(1)噬菌體的DNA分子注入細(xì)菌細(xì)胞(2)經(jīng)過短暫的轉(zhuǎn)錄之后，需要合成一種整合酶，于是轉(zhuǎn)錄活性便被一種阻遏物所關(guān)閉(3)噬菌體的DNA分子插入到細(xì)菌染色體基因組DNA上，變成原噬菌體(4)細(xì)菌繼續(xù)生長(zhǎng)、增值，噬菌體的基因作為細(xì)菌染色體的一部分進(jìn)行復(fù)制。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁(yè)!噬菌體P1基本特征：不存在噬菌體DNA分子的整合作用體系，而是變成了一種進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制的環(huán)形的質(zhì)粒DNA分子。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁(yè)!①超敏感免疫性阻遏－操縱體系：cⅠ基因編碼阻遏蛋白，啟動(dòng)子PL和PR，操縱基因OL和OROLPLcⅠPROR阻遏蛋白同操縱基因結(jié)合使RNA聚合酶不能起始轉(zhuǎn)錄，這種狀態(tài)有充分的能力使原噬菌體保持“關(guān)閉”形式，溶源細(xì)菌能夠正常生長(zhǎng)。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁(yè)!整合酶必須首先與宿主編碼的宿主整合因子(hostintegrationfactor，Hif)結(jié)合形成復(fù)合體，才能催化attP和attB在O區(qū)進(jìn)行重組而形成原噬菌體。Hif噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁(yè)!1、λ噬菌體特性及基因組結(jié)構(gòu)2、λ噬菌體載體類型及特點(diǎn)第二節(jié)λ噬菌體載體back噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁(yè)!λphage一、λ噬菌體的分子生物學(xué)概述1、基因組結(jié)構(gòu)（1）cos位點(diǎn)線性雙鏈DNA分子兩端各有一條12nt組成的彼此完全互補(bǔ)的5’突出單鏈注入宿主后，粘性末端互補(bǔ)形成雙鏈區(qū)，成為cos位點(diǎn)。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁(yè)!cos位點(diǎn)的兩個(gè)作用：使進(jìn)入細(xì)菌的DNA分子成為環(huán)狀，這是插入細(xì)菌基因組的先決條件。作為識(shí)別位點(diǎn)，由內(nèi)切酶將滾環(huán)復(fù)制的多聯(lián)體DNA切開噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁(yè)!左側(cè)區(qū)A～J中間區(qū)J～N右側(cè)區(qū)N右側(cè)（2）基因組噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁(yè)!感染早期：從單一復(fù)制起點(diǎn)開始雙向θ型復(fù)制，由O基因和P基因產(chǎn)物激活；隨后開始滾環(huán)復(fù)制，產(chǎn)生的線性DNA為基因組首尾串連的多聯(lián)體DNA分子①DNA復(fù)制——O基因和P基因早期蛋白表達(dá)θ型復(fù)制cos噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁(yè)!②溶源化控制基因——attintxisXis：控制一種蛋白質(zhì)刪除酶的合成int：控制整合酶的合成att：提供整合酶的識(shí)別位點(diǎn)③控制基因cIII、N、cI、cro、cII④溶菌基因——S、R噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁(yè)!1、插入式載體一種只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)的派生載體。只能插入較小分子量的外源（＜10kb），廣泛用于cDNA及小片段DNA的克隆2、替換型載體（取代型載體）具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的λDNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。可以克隆較大分子量的外源，克隆高等真核生物DNA二、λ噬菌體載體的主要類型噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁(yè)!

cIEcoRI

LA32.7RA10.6

λgt10

λgt10噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁(yè)!噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁(yè)!Charon4A載體

Charon4A載體是用Lac5（乳糖操縱子的大部分系列，包括完整的LacZ）替換入噬菌體的中間區(qū)段，同時(shí)將Lac5作為選擇標(biāo)記使用時(shí)用EcoRI水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進(jìn)行重組、包裝。而后，感染E.coli使之在E.coli內(nèi)繁殖，并裂解E.coli，形成空斑Lac5

EcoRICharon4A噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁(yè)!Charon40的中間可取代區(qū)段是一種DNA短片段多次重復(fù)而成，稱為多節(jié)段區(qū)，兩個(gè)短片段之間可被NaeⅠ識(shí)別，因此用它做載體可以有效的將其中的多節(jié)段區(qū)清除，從而得到的多是重組的噬菌體。克隆能力達(dá)到9～22kb短片段重復(fù)替換區(qū)

MCSMCSCharon40LA19.2RA9.6噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁(yè)!替換型載體克隆外源DNA的步驟1、應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶消化λ載體，除去可取代的DNA片段；2、將上述所得的

λDNA載體臂同外源DNA片段的連接；3、對(duì)重組體的λDNA分子進(jìn)行包裝和增殖，以得到有感染性的λ重組噬菌體噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁(yè)!（三）凱倫噬菌體載體在λ噬菌體基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，既有插入型又有替換型；在基因工程實(shí)驗(yàn)中的用途十分廣泛承受外源DNA的能力：幾個(gè)kb到23kb噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁(yè)!三、λ噬菌體載體的改良改良的目標(biāo)：擴(kuò)大克隆容量設(shè)計(jì)可對(duì)重組體分子作正選擇的克隆載體構(gòu)建可以方便的通過轉(zhuǎn)錄作用制備外源DNA插入序列之RNA探針的克隆載體發(fā)展可以使插入的真核cDNA與β－半乳糖苷酶形成融合蛋白的克隆載體噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁(yè)!基因red和gam位于非必需區(qū)域內(nèi)，外源DNA片段能置換基因red和gam形成重組體，其重組體不能在recA-的P2溶源菌中繁殖可以在recA＋的P2溶源菌中繁殖并且顯示出Spi-的表型。因此只要選用recA+的P2溶源菌作為宿主菌，就可以對(duì)重組體進(jìn)行篩選。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁(yè)!λDNA的復(fù)制是由θ型向滾環(huán)型的轉(zhuǎn)變，受到gam基因控制基因gam功能：蛋白產(chǎn)物和寄主細(xì)胞的外切核酸酶Ⅴ（宿主recB和recC基因產(chǎn)物）結(jié)合成復(fù)合物，失去對(duì)λDNA的作用活性，因而λ噬菌體能夠合成成熟的多聯(lián)體DNA，供作包裝底物基因red功能：參與裂解性生長(zhǎng)早期發(fā)生的重組反應(yīng)，是核酸外切酶，使θ型復(fù)制中的病毒DNA分離形成子代閉環(huán)DNA分子噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁(yè)!chi位點(diǎn)的引入

red和gam基因缺失(red-和gam-)的λ噬菌體在P2溶源菌或野生型大腸桿菌中生長(zhǎng)較差，形成的噬斑很少，然而當(dāng)在λDNA中引人chi位點(diǎn)后，Spi-噬菌體在宿主菌中的繁殖力便會(huì)隨之增強(qiáng)，噬斑變大。chi位點(diǎn)（交換熱點(diǎn)激活區(qū)）由一段長(zhǎng)度為八核苷酸的DNA序列組成，其序列為5’GCTGGTCG3’。野生型λDNA中并無(wú)此序列，但在大腸桿菌染色體DNA和真核基因組中都存在有chi序列，大腸桿菌DNA平均每5000bp出現(xiàn)一次chi序列。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁(yè)!四、體外包裝1、λ重組體DNA分子的轉(zhuǎn)染作用λ噬菌體DNA體外重組后，一般必須經(jīng)過體外包裝，然后以噬菌體感染（轉(zhuǎn)導(dǎo)）的方式將重組DNA導(dǎo)入E.coli細(xì)胞內(nèi)。因?yàn)橐愿腥痉绞綄?dǎo)入細(xì)胞的頻率可達(dá)106~108/μgDNA，而以轉(zhuǎn)染（translation）的方式導(dǎo)入的頻率僅為103~104/μgDNA。

噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁(yè)!2、λ重組體DNA的體外包裝在A蛋白（有終止復(fù)制功能），E蛋白（是包裝蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重組體DNA轉(zhuǎn)入頭部。主要外殼蛋白是基因E的產(chǎn)物基因A的產(chǎn)物在cos位點(diǎn)切割后進(jìn)入頭部包含在外殼中基因D的產(chǎn)物基因W和FⅡ的產(chǎn)物組裝成完整的尾部噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁(yè)!使用具有cⅠ857突變基因的λ噬菌體的溶源大腸桿菌：BHB2690（Dam）和BHB2685（Eam）菌株培養(yǎng)獲得頭部和尾部cⅠ857是溫度敏感性阻遏基因，32℃為溶源狀態(tài)，44～45℃誘發(fā)，溶菌的S基因突變，因而不會(huì)溶菌。大量收集頭部尾部蛋白，在體外與重組λDNA包裝噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁(yè)!計(jì)算包裝范圍（KB）48×75%＝3648×105%＝51必需基因?yàn)?8包裝范圍8kb～23kb《分子克隆試驗(yàn)指南》78%～105%，包裝范圍在10～23kb噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁(yè)!由于λ噬菌體頭部組裝時(shí)容納DNA的量是固定的，因此插入外源DNA長(zhǎng)度必須控制在使重組DNA為野生型λDNA長(zhǎng)度的75%~105%之間，否則難以正常組裝。③具有較高的感染效率，其感染宿主細(xì)胞的效率幾乎可達(dá)100%，而質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化率卻只0.1%。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁(yè)!第三節(jié)柯斯質(zhì)粒載體（Cosmidvector）1978年，J.collins和B.Hohn等人發(fā)展出的一種人工載體

帶有cos位點(diǎn)的質(zhì)粒載體

4-6kb，帶有選擇標(biāo)記，在構(gòu)建cDNA文庫(kù)中很有用?？蓴y帶大的外源DNA片段，克隆45kb基因。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁(yè)!cosmid載體帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、選擇性標(biāo)記λ噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。但它不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁(yè)!二、柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)1、具有λ噬菌體的特性；插入合適長(zhǎng)度外源基因后，可以在體外被包裝成噬菌體，可以高效的感染大腸桿菌，進(jìn)入細(xì)胞后環(huán)化，并且不形成子代噬菌體噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁(yè)!3、具有較高容量的克隆能力；分子量較小，一般4-6kb，因此插入的載體上并且可以被成功包裝的外源可以達(dá)到45kb最低極限，如果柯斯質(zhì)粒有5kb，外源必需要至少30kb4、具有與同源性序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力在同一個(gè)宿主中的柯斯質(zhì)粒和質(zhì)粒會(huì)形成共合體。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁(yè)!三、柯斯克隆柯斯克?。╟osmindcloning）：在大腸桿菌中克隆大片段的真核基因組DNA的技術(shù)依據(jù)原理:λ噬菌體在生命周期可以產(chǎn)生數(shù)百個(gè)由cos位點(diǎn)連接的多連體分子噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁(yè)!DigestionLigationC)PackagingandinfectFormationofacosmidclone噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁(yè)!四、柯斯克隆的改良優(yōu)點(diǎn)：1、兼具質(zhì)粒和噬菌體的特性，提高了克隆容量，對(duì)于構(gòu)建真核生物基因文庫(kù)十分有用；2、形成的非重組體克隆本底比較低噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁(yè)!②大小不等的外源片段相互連接后插入同一個(gè)載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來(lái)不是相鄰的片段錯(cuò)亂地連接成一個(gè)片段，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，后來(lái)專門選出30～45kb的外源DNA插入載體DNA，此時(shí)，每個(gè)載體只可能插入一個(gè)外源片段，因?yàn)槿绻€(gè)片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度；噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁(yè)!1、Ish－Horowicz－Burke柯斯克隆方案pJB8是由高拷貝的質(zhì)粒pAT153派生而來(lái)，能夠克隆大片段的外源DNA，適合于真核基因文庫(kù)構(gòu)建特點(diǎn)：在BamHⅠ兩端各有一個(gè)EcoRⅠ噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁(yè)!2、Bates－Swift柯斯克隆方案c2XB具有兩個(gè)cos位點(diǎn)，一個(gè)BamH和SmaⅠ切點(diǎn)c2XB6.8kbcoscosBamHⅠSmaⅠSmaⅠBamHⅠcoscosSmaⅠ平末端BamHⅠBamHⅠSmaⅠ平末端真核基因組Sau3AI局部消化磷酸酶OHOH32～47kb噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁(yè)!第四節(jié)單鏈DNA噬菌體載體單鏈DNA噬菌體載體M13、f1、fd優(yōu)越性：1、單鏈DNA噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這種復(fù)制形式的DNA簡(jiǎn)稱RFDNA；2、不論是RFDNA還是ssDNA都能感染大腸桿菌；噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁(yè)!一、M13噬菌體生物學(xué)特性M13是一種含單鏈（+）DNA（ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為6.4kb。這類載體主要用來(lái)獲得大量的單鏈ＤＮＡ片段，這種單鏈ＤＮＡ片段在遺傳學(xué)研究中主要用來(lái)測(cè)定ＤＮＡ序列（sanger雙脫氧法）、基因的定點(diǎn)突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁(yè)!10個(gè)基因，90％以上都編碼蛋白質(zhì)僅有2個(gè)基因間隔區(qū)間隔區(qū)基因Ⅷ——噬菌體顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白基因Ⅲ——噬菌體顆粒的次要結(jié)構(gòu)蛋白基因Ⅱ——在RFDNA上形成切口

基因Ⅴ作用——單鏈DNA結(jié)合蛋白噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁(yè)!3、進(jìn)行θ復(fù)制后，在基因Ⅱ的作用下，在RFDNA正鏈的特定位點(diǎn)上作切割反應(yīng)4、利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ，M13（－）為模板合成正鏈5、基因Ⅱ切割出完整的M13（＋）6、環(huán)化返回噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁(yè)!形態(tài)建成：

基因Ⅴ蛋白－DNA（正鏈）復(fù)合物移動(dòng)至細(xì)菌的細(xì)胞膜的同時(shí)，基因Ⅴ蛋白脫落，病毒基因組從細(xì)菌溢出時(shí)被衣殼蛋白包裹噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁(yè)!proAB：細(xì)菌脯氨酸合成酶編碼區(qū)，proAB常出現(xiàn)在F’附加體上，可以彌補(bǔ)宿主的基因缺失，以確保F’在宿主體內(nèi)穩(wěn)定traD36：抑制F’接合轉(zhuǎn)移△（lac－proAB）：缺失乳糖操縱子及比鄰的脯氨酸生物合成酶類的編碼基因，這類寄主不能利用乳糖，生長(zhǎng)必需脯氨酸噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第50頁(yè)!M13克隆載體分子結(jié)構(gòu)圖噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第51頁(yè)!3、對(duì)克隆基因的調(diào)節(jié)控制——lacIqlacI基因的突變體，可使lac操縱子阻遏物的合成量增加到野生型的10倍，合成大量的阻遏物阻止M13載體表達(dá)。加入誘導(dǎo)物IPTG，可以誘導(dǎo)合成Xgal顯色底物噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第52頁(yè)!返回噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第53頁(yè)!返回噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第54頁(yè)!M13mp18MCSM13mp19MCSEcoRIBamHIHindIIIPstIBglIBglIPstIHindIIIBamHIEcoRI

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BPPBBamHI&PstI噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第55頁(yè)!非展示系統(tǒng)展示系統(tǒng)噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第56頁(yè)!LeadHvLinkLvEPIII融合蛋白PIII基因型表達(dá)型噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第57頁(yè)!biotin

antigenSolutionphaseselectionwithbiotinylatedantigen噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第58頁(yè)!Washtoremoveunboundphageparticles.噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第59頁(yè)!AmplifyelutedphageRepeatselectionAnalyze a)ELISA b)Specificity c)Sequencing d)Affinity e)ActivityE.coli感染和擴(kuò)增二、噬菌體抗體庫(kù)展示技術(shù)back噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第60頁(yè)!噬菌粒的特點(diǎn)比M13小，約為3000bp，易于體外操作，可以克隆10kb外源兩種復(fù)制方式可以得到直接用于測(cè)序的單鏈結(jié)構(gòu)，免去了從質(zhì)粒載體到噬菌體的這一煩瑣的亞克隆步驟。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第61頁(yè)!二、噬菌粒載體pUC118和pUC119

在pUC18和19的NdeⅠ位點(diǎn)上插入來(lái)源于M13的IG區(qū)，長(zhǎng)度476bp，含有M13的復(fù)制起點(diǎn)噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第62頁(yè)!在pUC118和pUC119這兩個(gè)載體中，多克隆位點(diǎn)區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當(dāng)中的一個(gè)可轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈DNA，另一個(gè)則可轉(zhuǎn)錄出負(fù)鏈DNA；噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第63頁(yè)!三、輔助噬菌體M13KO7輔助噬菌體（一）結(jié)構(gòu)M13的衍生株，大小為8.7kb來(lái)自p15A質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，因此可以象質(zhì)粒一樣復(fù)制，且可以與帶ColE1的質(zhì)粒共存于同一個(gè)宿主菌中。來(lái)自轉(zhuǎn)座子Tn903的卡那霉素抗性基因（kanr）基因Ⅱ帶有一個(gè)G至T的突變（第6125核苷酸），40位氨基酸由甲硫氨酸變?yōu)楫惲涟彼帷?/p>

噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第64頁(yè)!當(dāng)M13K07感染帶有噬菌粒的大腸桿菌后，如E.coli（pUC118），進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)的單鏈DNA，在宿主胞內(nèi)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈形式，后者可在質(zhì)粒p15A的復(fù)制起點(diǎn)控制下進(jìn)行復(fù)制。細(xì)胞內(nèi)M13K07雙鏈DNA的積累并不需要病毒基因產(chǎn)物，細(xì)胞內(nèi)的噬菌粒幾乎沒有機(jī)會(huì)干擾所進(jìn)入的M13K07病毒基因組的早期復(fù)制。（二）作用噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第65頁(yè)!三、pBluescript噬菌粒載體（一）基本結(jié)構(gòu)

1、在多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)，有一對(duì)T3和T7噬菌體的啟動(dòng)子，可以定向指導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)；

2、同時(shí)具有一個(gè)單鏈?zhǔn)删wM13或f1的復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)來(lái)自ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，在不同的情況下，可以采取不同的復(fù)制形式，分別合成單鏈或雙鏈的DNA；噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第66頁(yè)!T7T3用于體外轉(zhuǎn)錄總結(jié)噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第67頁(yè)!可脫離寄主細(xì)胞生存，但不能進(jìn)行復(fù)制。除了對(duì)寄主的依賴性，還具備其它的功能：1、保護(hù)自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的破壞；2、將其核苷酸分子注入到被感染的細(xì)菌細(xì)胞；3、將被感染的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成制造噬菌體的體系，從而生長(zhǎng)出大量的子代噬菌體顆粒；4、使感染的細(xì)菌細(xì)胞釋放出子代的噬菌體顆粒噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第68頁(yè)!噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第69頁(yè)!二、噬菌體的感染性噬菌斑形成噬菌體感染高濃度細(xì)菌在未發(fā)生次裂解前涂布平板噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第70頁(yè)!噬菌體的感染過程尾部粘至細(xì)胞壁尾部蛋白質(zhì)收縮核酸注入細(xì)菌利用細(xì)菌的RNA聚合酶和核糖體翻譯得到噬菌體蛋白使細(xì)菌的DNA降解合成自身的DNA至數(shù)百個(gè)拷貝合成頭部尾部蛋白進(jìn)行組裝噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第71頁(yè)!四、噬菌體的溶源生命周期溶源生長(zhǎng)周期：是指在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體的DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體DNA上，成為它的一個(gè)組成部分?，F(xiàn)知道只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第72頁(yè)!整合：噬菌體的DNA是被包容在寄主細(xì)胞染色體DNA中原噬菌體：在溶源細(xì)菌內(nèi)存在的整合的或非整合的噬菌體超感染免疫性：溶源性細(xì)菌不能夠被頭一次感染并使之溶源化的同種噬菌體再感染。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第73頁(yè)!噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第74頁(yè)!3、超感染免疫性（1）溶源細(xì)菌的兩個(gè)重要特點(diǎn)：不能被頭一次感染的噬菌體再次感染，稱為超感染免疫性；經(jīng)過許多世代以后，溶源性細(xì)菌可以進(jìn)入溶菌周期，稱為溶源性誘發(fā)。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第75頁(yè)!②溶源噬菌體的誘發(fā)依賴于阻遏基因與操縱基因的相互作用。阻遏物被一種蛋白酶切割，失活，使噬菌體轉(zhuǎn)錄。需要?jiǎng)h除酶將噬菌體的DNA從大腸桿菌染色體上刪除下來(lái)，使之形成環(huán)形的DNA分子，恢復(fù)溶源周期開始時(shí)的狀態(tài)。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第76頁(yè)!五、重組噬菌體的分離大腸桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期?加入λ噬菌體懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時(shí)?用新鮮培養(yǎng)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時(shí)?高速離心，沉淀噬菌體?苯酚抽提，釋放λ-DNA?乙醇或異丙醇沉淀DNA。back噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第77頁(yè)!λ噬菌體分子量31×106dal，中等大小的溫和噬菌體，目前已經(jīng)定位61個(gè)基因，其中一半?yún)⑴c了生命周期，為必要基因；余下的為非必要基因。溶菌階段(復(fù)制和釋放)

溶源階段

(整合寄主染色體)噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第78頁(yè)!噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第79頁(yè)!

5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’

CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephagecosendsCircularformLinearform噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第80頁(yè)!COSAWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cIcrocIIOPQSR

attintxis

gamredcIIIN

COS頭部基因尾部基因功能不明區(qū)溶源化重組早期控制阻遏DNA合成溶菌生長(zhǎng)非必要區(qū)段cI基因：溶源過程控制基因λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第81頁(yè)!早期蛋白不表達(dá)，晚期蛋白表達(dá)噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第82頁(yè)!DNAProteincoatcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bp噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第83頁(yè)!（一）插入式載體λ噬菌體載體相對(duì)于質(zhì)粒載體來(lái)說，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)的構(gòu)建。1、cI基因插入失活如λgt10、λNM1149等載體，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點(diǎn)。外源基因插入后將導(dǎo)致cI基因的失活。cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶源化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第84頁(yè)!LacZ基因插入失活：如charon16A，λgt11載體，在非必需區(qū)段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRⅠ位點(diǎn)，插入失活后利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。

lacZLA19.9RA21.9EcoRIcharon16A噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第85頁(yè)!（二）λ替換型載體（取代型載體）外源DNA取代噬菌體染色體中對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制非必要的片段(~20kb)高感染效率(109

轉(zhuǎn)化株/ug載體DNA，比質(zhì)粒高100-倍)替換型噬菌體λ是使用最廣泛的載體。eg:

EMBL3,DASH噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第86頁(yè)!λEMBL3/4、Charon40噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第87頁(yè)!在λNM781替換型載體中，可取代的EcoRⅠ片段，編碼有一個(gè)supE基因（大腸桿菌突變體tRNA基因），這種λNM781噬菌體感染細(xì)胞后，寄主細(xì)胞lacZ基因的琥珀突變被抑制，因此能在X-gal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出藍(lán)色的噬菌斑。如果這個(gè)具有supE基因的EcoRⅠ片段被外源DNA取代了，那么所形成的重組體噬菌體，在上述指示培養(yǎng)基上只能產(chǎn)生出無(wú)色的噬菌斑。λNM781噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第88頁(yè)!λ取代載體2、組裝連接3、侵染噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第89頁(yè)!（左右臂連接）（三段自身連接）（插入片段）噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第90頁(yè)!1、Spi-正選擇的λ噬菌體載體λ1059、λL47.1Spi-重組體的篩選野生型λ噬菌體不能在攜帶有P2原噬菌體的溶源菌中生長(zhǎng)，λ的這種表型稱為Spi+(對(duì)P2的干擾敏感)但是當(dāng)λ基因組中缺少參與重組的兩個(gè)基因red和gam時(shí)，λ突變體可以在P2溶原菌中生長(zhǎng)，其表型稱為Spi-。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第91頁(yè)!recA＋的P2溶源菌噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第92頁(yè)!recA＋的P2溶原菌red-gam-：利用大腸桿菌的重組酶（recA＋），通過單體λDNA間的重組作用，產(chǎn)生出成熟的多聯(lián)體λDNA以進(jìn)行包裝，大腸桿菌的重組系統(tǒng)依賴于recA基因。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第93頁(yè)!chi位點(diǎn)：與重組事件有關(guān)聯(lián)的DNA序列，激活以rec為媒介的交換反應(yīng)，是recB、C系統(tǒng)催化重組作用的底物。但RecB、C重組酶的活性可被基因gam的產(chǎn)物所抑制。因此對(duì)于red-、gam-突變體或因外源DNA的插入而呈Spi-表型的重組體而言，chi位點(diǎn)的引人會(huì)使噬菌體生長(zhǎng)繁殖力變強(qiáng)，噬斑增大。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第94頁(yè)!體外包裝：把重組體DNA分子包裝成成熟的噬菌體顆粒，從而能夠按照正常的噬菌體感染過程導(dǎo)入宿主細(xì)胞，可以提高轉(zhuǎn)染效率，可達(dá)107左右。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第95頁(yè)!λ重組體DNA的體外包裝：在體外試管中完成上述反應(yīng)，利用D基因突變和E基因突變。E基因琥珀突變（Eam）不能形成任何頭部，積累大量的尾部D基因琥珀突變（Dam），λ重組體DNA不能進(jìn)入頭部，成熟作用在頭部前體階段被終止，因而它感染的宿主中有大量頭部前體蛋白積累。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第96頁(yè)!由于λ噬菌體包裝時(shí)，當(dāng)DNA的長(zhǎng)度短于野生型的75%或超過105%時(shí)，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型DNA（48KB）的75%～105%左右的ＤＮＡ，要求λ載體DNA和外源DNA長(zhǎng)度上限是51kb，必需基因?yàn)?8kb，外源極限在23kb。3、λ噬菌體的包裝限制噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第97頁(yè)!λ噬菌體克隆載體是基因工程中一類很有價(jià)值的克隆載體，具有很多優(yōu)點(diǎn)：①其分子遺傳學(xué)背景十分清楚；②載體容量較大，一般質(zhì)粒載體只能容納10多個(gè)kb，而λ噬菌體載體卻能容納大約23kb的外源DNA片段；噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第98頁(yè)!back噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第99頁(yè)!一、柯斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建cosmid載體：也稱粘粒、柯斯載體。這是一類用于克隆大片段DNA的載體，它是由λ噬菌體的cos（cohesive）末端及質(zhì)粒（plasmid）重組而成的載體。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第100頁(yè)!柯斯質(zhì)粒pHC79系由質(zhì)粒pBR322和噬菌體λ的cos位點(diǎn)的一段DNA構(gòu)成全長(zhǎng)4.3kb，克隆能力為31～45kb，能夠被包裝成具有感染性能的噬菌體噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第101頁(yè)!2、具有質(zhì)粒載體的特性；含有質(zhì)粒復(fù)制子，進(jìn)入寄主后可以象質(zhì)粒一樣復(fù)制，抗菌素抗性標(biāo)記可以進(jìn)行篩選噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第102頁(yè)!噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第103頁(yè)!末端酶（Ter體系）：能識(shí)別兩個(gè)相距適宜的cos位點(diǎn)，將多聯(lián)體切割成單位長(zhǎng)度的片段，并包裝至頭部，作用有效范圍，兩個(gè)cos之間相距38～54kb。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第104頁(yè)!噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第105頁(yè)!采用柯斯質(zhì)粒作載體的困難①載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的1/10左右，因此往往會(huì)出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個(gè)重組分子內(nèi)可有幾個(gè)柯斯質(zhì)粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第106頁(yè)!③細(xì)菌的菌落體積遠(yuǎn)大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫(kù)，則篩選所需的含某一DNA片段的菌落很費(fèi)時(shí)間?，F(xiàn)雖建立了高密度菌落篩選法，但由于柯斯質(zhì)粒制成的基因文庫(kù)常常不太穩(wěn)定，插入的大片段外源DNA有可能通過同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第107頁(yè)!cosBamHⅠHindⅢpJB8SalⅠHindⅢ、磷酸酶SalⅠ、磷酸酶cosOHOHSalⅠBamHⅠBamHⅠcosOHOHSalⅠppcosOHOHBamHⅠBamHⅠcosOHOHppHindⅢ真核基因組Sau3AI局部消化磷酸酶OHOH32～47kb噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第108頁(yè)!3、其他柯斯克隆方案（1）在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)引入T3和T7噬菌體的RNA聚合酶啟動(dòng)子（圖5-23）（2）構(gòu)建與大腸桿菌質(zhì)粒沒有同源性序列的克斯載體，避免重組（3）導(dǎo)入真核生物的選擇性標(biāo)記，做為穿梭載體噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第109頁(yè)!3、單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的多寡制約的，不存在包裝限制問題；4、容易測(cè)定外源DNA片斷的插入取向；5、可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈DNA分子。噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第110頁(yè)!感染方式M13噬菌體是大腸桿菌特有的噬菌體，只能感染帶有F性須的菌株通過人工方式可以轉(zhuǎn)染雌性的大腸桿菌噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第111頁(yè)!RFDNA復(fù)制方式：1、M13正鏈在基因Ⅲ編碼的蛋白作用下進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞，合成出M13（－）鏈，雙鏈DNA為復(fù)制型（RFDNA）2、開始θ型復(fù)制噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第112頁(yè)!PhageM13replicationinthehostcell:+RNApolDNApolI±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第113頁(yè)!二、M13噬菌體載體的寄主菌由于M13噬菌體通過F因子編碼的菌毛進(jìn)入宿主細(xì)胞，故只能用雄性細(xì)菌來(lái)增殖病毒。lacZ△M15：缺失lacZ基因中β-半乳糖苷酶的N端部分編碼序列，很多宿主菌的F’附加體帶有這種缺失的lacZ基因。lacIq：lacI基因的突變體，可使lac操縱子阻遏物的合成量增加到野生型的10倍，很多宿主菌的F’附加體帶有這種lacIq和lacZ△M15基因。JM101：△（lac－proAB）

F’traD36

proAB＋

lacIqlacZ△M15噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第114頁(yè)!1、M13載體系列的發(fā)展IGIG區(qū)段：位于基因Ⅱ和基因Ⅳ之間，長(zhǎng)度507核苷酸

M13mpn：由M13mp1衍生而來(lái)三、M13克隆體系噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第115頁(yè)!2、α互補(bǔ)作用M13載體：編碼β-半乳糖苷酶的N端，來(lái)源于β-半乳糖苷酶基因的HindⅡ酶切片段F’附加體：含有l(wèi)acZ△M15基因，缺失了編碼β-半乳糖苷酶中第11-41個(gè)氨基酸的lacZ基因，不能形成四聚體。藍(lán)白篩選噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第116頁(yè)!Blue-whiteselection噬菌體載體和柯斯載體共132頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第117頁(yè)!四、M13載體系列的優(yōu)點(diǎn)1、在這類載體的基因組中有一條飾變的β-半乳糖苷酶基因片段（HindⅡ片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位點(diǎn)的序列；2、M13載體系列是應(yīng)用基因工程技術(shù)成對(duì)地構(gòu)建的，可有效地克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈。