基因工程的基本操作程序（新）課件

1、結(jié)合圖，判斷下列有關(guān)基因工程的工具酶功能的敘述，正確的是()。A．切斷a處的酶為限制性核酸內(nèi)切酶B．連接a處的酶為DNA聚合酶C．切斷b處的酶為限制性核酸內(nèi)切酶D．切斷c處的為限制性核酸內(nèi)切酶cADNA連接酶解旋酶DNA水解酶1、結(jié)合圖，判斷下列有關(guān)基因工程的工具酶功能的敘述，正確的是11.2基因工程的基本操作程序1.2基因工程的基本操作程序2

基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四、目的基因的檢測(cè)與鑒定基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取二、基因表3一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取方法：1、目的基因:1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取方法：141）從基因文庫(kù)中獲取目的基因：⑴基因文庫(kù):

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(kù)(genelibrary)⑵分類：①基因組文庫(kù):包含了一種生物所有的基因的基因文庫(kù)。構(gòu)建方法：限制酶切法②部分基因文庫(kù)（如cDNA文庫(kù)):包含了一種生物的一部分基因的基因文庫(kù)。構(gòu)建方法：逆轉(zhuǎn)錄法1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因：⑴基因文庫(kù):5限制酶切法（鳥槍法或散彈射擊法）

用限制酶切斷成許多片段限制酶切法（鳥槍法或散彈射擊法）用限制酶切斷成許多片段6某生物體內(nèi)全部DNA

許多DNA片段受體菌群體1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因限制酶與運(yùn)載體連接導(dǎo)入基因組文庫(kù)某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運(yùn)載體連接導(dǎo)入部分基因文庫(kù)（cDNA文庫(kù)）某生物體內(nèi)全部DNA許多DNA片段受體菌群體1、從基因文庫(kù)7外顯子內(nèi)含子與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)原核生物基因真核生物基因外顯子內(nèi)含子與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編8RNA聚合酶AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCAGGUCACGUCG一個(gè)典型的原核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)示意圖非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)TCCAGTAGGTCAAGATCTmRNA多肽鏈RNA聚合酶AGGTCACGTCGTC9與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子12345編碼區(qū)下游非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄mRNA前體加工成熟mRNA翻譯肽鏈一個(gè)典型的真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)示意圖與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子12345編碼區(qū)下游非編碼10一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取方法：1、目的基因:1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取方法：1112、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)?？梢垣@得大量的目的基因。③條件：_______________________、_______________、___________(做啟動(dòng)子)、_______

____.②原理：__________DNA復(fù)制模板DNA四種脫氧核苷酸一對(duì)引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在12利用PCR技術(shù)擴(kuò)增利用PCR技術(shù)擴(kuò)增13循環(huán)變性退火延伸循環(huán)變性退火延伸14⑤方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因④過程：

使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增⑥結(jié)果：①：加熱至90～95℃，使DNA解旋；②：冷卻到55～60℃，2個(gè)引物分別與DNA單鏈結(jié)合；③：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶開始互補(bǔ)鏈的合成。氫鍵斷裂⑤方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循指數(shù)2n15與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別：①：不需要解旋酶；②：需加入引物（前提：已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物）③：需熱穩(wěn)定DNA聚合酶(

Taq酶)；與體內(nèi)DNA復(fù)制的相同點(diǎn)：(1)模板：均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板(2)原料：均為四種脫氧核苷酸(3)酶：均需DNA聚合酶(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別：①：不需要解旋酶；與體內(nèi)DNA復(fù)制的16一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取方法：1、目的基因:3）化學(xué)方法人工合成——DNA合成儀1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取方法：1173、人工合成法

在基因較小，核苷酸序列已知的前提下，可以利用DNA合成儀人工合成蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成推測(cè)推測(cè)思考：化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動(dòng)子和終止子嗎？3、人工合成法在基因較小，核苷酸序列已知的前提下，可以利18二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建1、載體構(gòu)建目的：2、基因表達(dá)載體的組成啟動(dòng)子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因-----------核心（P11）同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。使目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建1、載體構(gòu)建目的：2、基因表達(dá)載體的組19表達(dá)載體啟動(dòng)子：終止子：①位置:首端②本質(zhì):DNA③功能:有與RNA聚合酶結(jié)合的位點(diǎn)，能驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄①位置:尾端②本質(zhì):能終止轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體啟動(dòng)子：①位置:首端②本質(zhì):DNA③功能:有與RNA203、基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程特別提醒該過程把三種工具(兩種工具酶、一種載體)全用上了，是最核心、最關(guān)鍵的一步，在體外進(jìn)行。3、基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程特別提醒該過程把三種工具(兩種工21基因工程的基本操作程序（新）課件22思考：

如果用同一種限制性內(nèi)切酶，處理質(zhì)粒和目的基因，并將產(chǎn)物放在一起用連接酶連接它們，最后可以產(chǎn)生多少種環(huán)狀的DNA分子？你認(rèn)為它們是怎么組成的？思考：23三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。1、常用的受體細(xì)胞：動(dòng)物、植物、微生物。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：24（1）.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——最常用方法、經(jīng)濟(jì)有效3、轉(zhuǎn)化的概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)并在受體細(xì)胞中維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。4、轉(zhuǎn)化的方法：（1）.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法三、將目的基因251）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

⑴適用范圍：雙子葉植物和裸子植物；

(2)原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(2)原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到26三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)入穩(wěn)定維持和表達(dá)③過程：三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)27（1）.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2）基因槍法3）花粉管通道法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——最常用方法、經(jīng)濟(jì)有效——單子葉植物常用、準(zhǔn)確但成本高——我國(guó)獨(dú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)3、轉(zhuǎn)化的概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)并在受體細(xì)胞中維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。4、轉(zhuǎn)化的方法：（2）.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞-----顯微注射技術(shù)（1）.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2）基因槍法3282）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞1.方法：顯微注射技術(shù)2.受體細(xì)胞：受精卵

3.程序:目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動(dòng)物2）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞1.方法：顯微注射技術(shù)3.程序:目29（1）.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2）基因槍法3）花粉管通道法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（2）.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（3）.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞-----Ca2+處理-----顯微注射技術(shù)——最常用方法、經(jīng)濟(jì)有效——單子葉植物常用、準(zhǔn)確但成本高——我國(guó)獨(dú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)3、轉(zhuǎn)化的概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)并在受體細(xì)胞中維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。4、轉(zhuǎn)化的方法：（1）.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2）基因槍法3303)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少②常用菌：大腸桿菌③常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細(xì)胞④過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合3)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①微生物作受體細(xì)胞原因：Ca2+31方法受體細(xì)胞其他處理或特點(diǎn)植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法體細(xì)胞、受精卵植物組織培養(yǎng)（脫分化和再分化）動(dòng)物細(xì)胞顯微注射法受精卵動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植或胚胎分割移植微生物細(xì)胞Ca2+處理法（感受態(tài)細(xì)胞）原核細(xì)胞繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)少（農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA的特點(diǎn)：即能進(jìn)入受體細(xì)胞，又能與受體細(xì)胞的染色體DNA整合）雙子葉、裸子方法受體其他處理植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法體細(xì)胞、32四、目的基因的檢測(cè)與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？1真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少。2目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？不一定，需要檢測(cè)四、目的基因的檢測(cè)與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝33四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1、分子水平檢測(cè)—2、個(gè)體水平鑒定—①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等DNA分子雜交DNA-RNA分子雜交抗原—抗體雜交四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1、分子水平檢測(cè)—2、個(gè)體水34轉(zhuǎn)基因生物的DNA含目的基因的DNA單鏈為探針15N15N14N14N基因探針：放射性同位素等標(biāo)記的DNA分子方法——DNA分子雜交技術(shù)變性變性轉(zhuǎn)基因生含目的基因的DNA單鏈為探針15N15N14N14N35DNA分子雜交示意圖用DNA分子雜交技術(shù)可鑒定兩個(gè)物種之間的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。如果雜合部位多，則親緣關(guān)系近，反之則遠(yuǎn)。DNA分子雜交示意圖用DNA分子雜交技術(shù)可鑒定兩個(gè)物種之間的361、鑒定——分子水平的鑒定變性方法——分子雜交技術(shù)（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14N14N1、鑒定——分子水平的鑒定變性方法——分子雜交技術(shù)（2）檢測(cè)371、鑒定——分子水平的鑒定提?。?）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)1、鑒定——分子水平的鑒定提?。?）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋382、鑒定——個(gè)體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn)例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。2、鑒定——個(gè)體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn)39四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1、分子水平檢測(cè)—2、個(gè)體水平鑒定—①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等DNA分子雜交DNA-RNA分子雜交抗原—抗體雜交四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1、分子水平檢測(cè)—2、個(gè)體水40考法方法過程導(dǎo)入檢測(cè)外源基因是否與受體細(xì)胞的染色體整合DNA分子雜交用放射性同位素或熒光分子標(biāo)記的目的基因的單鏈做探針，與轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA雜交，觀察是否出現(xiàn)雜交帶。表達(dá)檢測(cè)是否轉(zhuǎn)錄分子雜交用放射性同位素或熒光分子標(biāo)記的目的基因的單鏈做探針，與轉(zhuǎn)基因生物細(xì)胞中的mRNA雜交，觀察是否出現(xiàn)雜交帶。表達(dá)檢測(cè)是否翻譯抗原-抗體雜交從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原－抗體雜交，觀察是否出現(xiàn)反應(yīng)。個(gè)體水平檢測(cè)比較簡(jiǎn)單的方法抗蟲或抗病實(shí)驗(yàn)如，轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀，讓害蟲食用轉(zhuǎn)基因植物的葉片，觀察其是否死亡?？挤ǚ椒ㄟ^程導(dǎo)入檢測(cè)外源基因是否與受體細(xì)胞的染色體整合DNA41基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、化學(xué)方法人工合成目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、Ca2+處理法DNA分子雜交技術(shù)DNA-RNA分子雜交技術(shù)抗原—抗體雜交技術(shù)個(gè)體水平鑒定分子檢測(cè)基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的42鞏固練習(xí):1.人們常選用的細(xì)菌質(zhì)粒分子往往帶有一個(gè)抗生素抗性基因,該抗性基因的主要作用是()A.提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性B.有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測(cè)C.增加質(zhì)粒分子的分子量D.便于與外源基因連接2.在遺傳工程技術(shù)中,限制性內(nèi)切酶主要用于()A.目的基因的提取和導(dǎo)入B.目的基因的提取和檢測(cè)C.目的基因與載體的結(jié)合和導(dǎo)入D.目的基因的提取與載體結(jié)合BD鞏固練習(xí):BD433.在遺傳工程技術(shù)中,下列何種目的基因一般以直接分離的方法獲得()A.人的胰島素基因B.蠶的蠶絲蛋白基因C.芽孢桿菌的抗蟲基因D.菜豆儲(chǔ)藏蛋白基因4.1976年,美國(guó)的科學(xué)家首次將人的生長(zhǎng)抑制素釋放因子的基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌,并獲得了表達(dá),此文中的表達(dá)是指該基因在大腸桿菌()A.能進(jìn)行DNA復(fù)制B.能傳遞給細(xì)菌后代C.能合成生長(zhǎng)抑制素釋放因子D.能合成人的生長(zhǎng)素CC3.在遺傳工程技術(shù)中,下列何種目的基因一般以直接分離的方法獲445.基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的,在基因操作的基本步驟中,不進(jìn)行減基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是()A.人工合成目的基因B.目的基因與載體結(jié)合C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D.目的基因的檢測(cè)和表達(dá)C5.基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的,在基因操作的45原核生物基因表達(dá)的調(diào)控ＲＰＯ

lacZlacY

lacA調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子操縱基因結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶信使RNA轉(zhuǎn)錄翻譯阻抑物乳糖轉(zhuǎn)錄半乳糖苷酶酶酶原核生物基因表達(dá)的調(diào)控Ｒ461、下列四條DNA分子，彼此間具有粘性末端的一組是()

A．①②

B．②③

C．③④

D．②④D練習(xí)1、下列四條DNA分子，彼此間具有粘性末端的一組是(473、已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。根據(jù)圖示判斷下列操作正確的是（）A．目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅱ切割B．目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅰ切割C．質(zhì)粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割D．質(zhì)粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割C3、已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制48實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)推論在含青霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況導(dǎo)入質(zhì)粒情況，及目的基因插入位置目的基因插入位置ABCD未導(dǎo)入質(zhì)粒的普通的大腸桿菌不能生長(zhǎng)不能生長(zhǎng)導(dǎo)入外源基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌，且位點(diǎn)在a能生長(zhǎng)不能生長(zhǎng)導(dǎo)入外源基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌，且位點(diǎn)在c不能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)導(dǎo)入外源基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌，且位點(diǎn)在b或?qū)胭|(zhì)粒的大腸桿菌能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)練一練實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)推論在含青霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況在含四環(huán)素培養(yǎng)基上49演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！501、結(jié)合圖，判斷下列有關(guān)基因工程的工具酶功能的敘述，正確的是()。A．切斷a處的酶為限制性核酸內(nèi)切酶B．連接a處的酶為DNA聚合酶C．切斷b處的酶為限制性核酸內(nèi)切酶D．切斷c處的為限制性核酸內(nèi)切酶cADNA連接酶解旋酶DNA水解酶1、結(jié)合圖，判斷下列有關(guān)基因工程的工具酶功能的敘述，正確的是511.2基因工程的基本操作程序1.2基因工程的基本操作程序52

基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四、目的基因的檢測(cè)與鑒定基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取二、基因表53一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取方法：1、目的基因:1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取方法：1541）從基因文庫(kù)中獲取目的基因：⑴基因文庫(kù):

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(kù)(genelibrary)⑵分類：①基因組文庫(kù):包含了一種生物所有的基因的基因文庫(kù)。構(gòu)建方法：限制酶切法②部分基因文庫(kù)（如cDNA文庫(kù)):包含了一種生物的一部分基因的基因文庫(kù)。構(gòu)建方法：逆轉(zhuǎn)錄法1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因：⑴基因文庫(kù):55限制酶切法（鳥槍法或散彈射擊法）

用限制酶切斷成許多片段限制酶切法（鳥槍法或散彈射擊法）用限制酶切斷成許多片段56某生物體內(nèi)全部DNA

許多DNA片段受體菌群體1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因限制酶與運(yùn)載體連接導(dǎo)入基因組文庫(kù)某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運(yùn)載體連接導(dǎo)入部分基因文庫(kù)（cDNA文庫(kù)）某生物體內(nèi)全部DNA許多DNA片段受體菌群體1、從基因文庫(kù)57外顯子內(nèi)含子與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)原核生物基因真核生物基因外顯子內(nèi)含子與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編58RNA聚合酶AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCAGGUCACGUCG一個(gè)典型的原核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)示意圖非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)TCCAGTAGGTCAAGATCTmRNA多肽鏈RNA聚合酶AGGTCACGTCGTC59與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子12345編碼區(qū)下游非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄mRNA前體加工成熟mRNA翻譯肽鏈一個(gè)典型的真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)示意圖與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子12345編碼區(qū)下游非編碼60一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取方法：1、目的基因:1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取方法：1612、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。可以獲得大量的目的基因。③條件：_______________________、_______________、___________(做啟動(dòng)子)、_______

____.②原理：__________DNA復(fù)制模板DNA四種脫氧核苷酸一對(duì)引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在62利用PCR技術(shù)擴(kuò)增利用PCR技術(shù)擴(kuò)增63循環(huán)變性退火延伸循環(huán)變性退火延伸64⑤方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因④過程：

使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增⑥結(jié)果：①：加熱至90～95℃，使DNA解旋；②：冷卻到55～60℃，2個(gè)引物分別與DNA單鏈結(jié)合；③：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶開始互補(bǔ)鏈的合成。氫鍵斷裂⑤方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循指數(shù)2n65與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別：①：不需要解旋酶；②：需加入引物（前提：已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物）③：需熱穩(wěn)定DNA聚合酶(

Taq酶)；與體內(nèi)DNA復(fù)制的相同點(diǎn)：(1)模板：均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板(2)原料：均為四種脫氧核苷酸(3)酶：均需DNA聚合酶(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別：①：不需要解旋酶；與體內(nèi)DNA復(fù)制的66一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取方法：1、目的基因:3）化學(xué)方法人工合成——DNA合成儀1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取方法：1673、人工合成法

在基因較小，核苷酸序列已知的前提下，可以利用DNA合成儀人工合成蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成推測(cè)推測(cè)思考：化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動(dòng)子和終止子嗎？3、人工合成法在基因較小，核苷酸序列已知的前提下，可以利68二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建1、載體構(gòu)建目的：2、基因表達(dá)載體的組成啟動(dòng)子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因-----------核心（P11）同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。使目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建1、載體構(gòu)建目的：2、基因表達(dá)載體的組69表達(dá)載體啟動(dòng)子：終止子：①位置:首端②本質(zhì):DNA③功能:有與RNA聚合酶結(jié)合的位點(diǎn)，能驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄①位置:尾端②本質(zhì):能終止轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體啟動(dòng)子：①位置:首端②本質(zhì):DNA③功能:有與RNA703、基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程特別提醒該過程把三種工具(兩種工具酶、一種載體)全用上了，是最核心、最關(guān)鍵的一步，在體外進(jìn)行。3、基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程特別提醒該過程把三種工具(兩種工71基因工程的基本操作程序（新）課件72思考：

如果用同一種限制性內(nèi)切酶，處理質(zhì)粒和目的基因，并將產(chǎn)物放在一起用連接酶連接它們，最后可以產(chǎn)生多少種環(huán)狀的DNA分子？你認(rèn)為它們是怎么組成的？思考：73三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。1、常用的受體細(xì)胞：動(dòng)物、植物、微生物。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：74（1）.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——最常用方法、經(jīng)濟(jì)有效3、轉(zhuǎn)化的概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)并在受體細(xì)胞中維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。4、轉(zhuǎn)化的方法：（1）.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法三、將目的基因751）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

⑴適用范圍：雙子葉植物和裸子植物；

(2)原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(2)原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到76三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)入穩(wěn)定維持和表達(dá)③過程：三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)77（1）.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2）基因槍法3）花粉管通道法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——最常用方法、經(jīng)濟(jì)有效——單子葉植物常用、準(zhǔn)確但成本高——我國(guó)獨(dú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)3、轉(zhuǎn)化的概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)并在受體細(xì)胞中維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。4、轉(zhuǎn)化的方法：（2）.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞-----顯微注射技術(shù)（1）.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2）基因槍法3782）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞1.方法：顯微注射技術(shù)2.受體細(xì)胞：受精卵

3.程序:目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動(dòng)物2）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞1.方法：顯微注射技術(shù)3.程序:目79（1）.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2）基因槍法3）花粉管通道法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（2）.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（3）.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞-----Ca2+處理-----顯微注射技術(shù)——最常用方法、經(jīng)濟(jì)有效——單子葉植物常用、準(zhǔn)確但成本高——我國(guó)獨(dú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)3、轉(zhuǎn)化的概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)并在受體細(xì)胞中維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。4、轉(zhuǎn)化的方法：（1）.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2）基因槍法3803)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少②常用菌：大腸桿菌③常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細(xì)胞④過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合3)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①微生物作受體細(xì)胞原因：Ca2+81方法受體細(xì)胞其他處理或特點(diǎn)植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法體細(xì)胞、受精卵植物組織培養(yǎng)（脫分化和再分化）動(dòng)物細(xì)胞顯微注射法受精卵動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植或胚胎分割移植微生物細(xì)胞Ca2+處理法（感受態(tài)細(xì)胞）原核細(xì)胞繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)少（農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA的特點(diǎn)：即能進(jìn)入受體細(xì)胞，又能與受體細(xì)胞的染色體DNA整合）雙子葉、裸子方法受體其他處理植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法體細(xì)胞、82四、目的基因的檢測(cè)與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？1真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少。2目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？不一定，需要檢測(cè)四、目的基因的檢測(cè)與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝83四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1、分子水平檢測(cè)—2、個(gè)體水平鑒定—①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等DNA分子雜交DNA-RNA分子雜交抗原—抗體雜交四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1、分子水平檢測(cè)—2、個(gè)體水84轉(zhuǎn)基因生物的DNA含目的基因的DNA單鏈為探針15N15N14N14N基因探針：放射性同位素等標(biāo)記的DNA分子方法——DNA分子雜交技術(shù)變性變性轉(zhuǎn)基因生含目的基因的DNA單鏈為探針15N15N14N14N85DNA分子雜交示意圖用DNA分子雜交技術(shù)可鑒定兩個(gè)物種之間的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。如果雜合部位多，則親緣關(guān)系近，反之則遠(yuǎn)。DNA分子雜交示意圖用DNA分子雜交技術(shù)可鑒定兩個(gè)物種之間的861、鑒定——分子水平的鑒定變性方法——分子雜交技術(shù)（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14N14N1、鑒定——分子水平的鑒定變性方法——分子雜交技術(shù)（2）檢測(cè)871、鑒定——分子水平的鑒定提取（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)1、鑒定——分子水平的鑒定提取（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋882、鑒定——個(gè)體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn)例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。2、鑒定——個(gè)體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn)89四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1、分子水平檢測(cè)—2、個(gè)體水平鑒定—①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等DNA分子雜交DNA-RNA分子雜交抗原—抗體雜交四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1、分子水平檢測(cè)—2、個(gè)體水90考法方法過程導(dǎo)入檢測(cè)外源基因是否與受體細(xì)胞的染色體整合DNA分子雜交用放射性同位素或熒光分子標(biāo)記的目的基因的單鏈做探針，與轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA雜交，觀察是否出現(xiàn)雜交帶。表達(dá)檢測(cè)是否轉(zhuǎn)錄分子雜交用放射性同位素或熒光分子標(biāo)記的目的基因的單鏈做探針，與轉(zhuǎn)基因生物細(xì)胞中的mRNA雜交，觀察是否出現(xiàn)雜交帶。表達(dá)檢測(cè)是否翻譯抗原-抗體雜交從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原－抗體雜交，觀察是否出現(xiàn)反應(yīng)。個(gè)體水平檢測(cè)比較簡(jiǎn)單的方法抗蟲或抗病實(shí)驗(yàn)如，轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀，讓害蟲食用轉(zhuǎn)基因植物的葉片，觀察其是否死亡。考法方法過程導(dǎo)入檢測(cè)外源基因是否與受體細(xì)胞的染色體整合DNA91基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、化學(xué)方法人工合成目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、Ca2+處理法DNA分子雜交技術(shù)DNA-RNA分子雜交技術(shù)抗原—抗體雜交技術(shù)個(gè)體水平鑒定分子檢測(cè)基因