冷凍保存原理-張兆旺課件

冷凍保存生物材料理論與實(shí)踐

12/16/20221動物繁殖原理與技術(shù)1.卵母細(xì)胞和胚胎在冷凍/解凍過程中死亡的原因12/16/20222動物繁殖原理與技術(shù)（1）物理損傷（胞內(nèi)冰晶）溫度下降到細(xì)胞懸浮液冰點(diǎn)時，首先使細(xì)胞外溶液中的水結(jié)冰，細(xì)胞內(nèi)此時由于原生質(zhì)的作用處于過冷卻狀態(tài)（低于冰點(diǎn)而未結(jié)冰的狀態(tài)），隨著溫度的進(jìn)一步下降和胞外冰晶的增長出現(xiàn)了一種胞外溶液滲透壓逐漸高于胞內(nèi)過冷溶液的不平衡狀態(tài)。要達(dá)到平衡，要么是胞內(nèi)水分外流；要么是胞內(nèi)水分就地結(jié)冰。出現(xiàn)哪種情況取決于溫度下降的速度。12/16/20223動物繁殖原理與技術(shù)胞內(nèi)冰晶的預(yù)防為使細(xì)胞內(nèi)部不產(chǎn)生冰晶，冷凍保存液中必須添加抗凍保護(hù)劑物質(zhì)。胚胎或卵子的冷凍保存中，常采用的抗凍保護(hù)劑除丙三醇外，還有乙二醇、丙二醇、DMSO和乙酰胺等。這些物質(zhì)的分子量不超過100道爾頓，可以自由地通過細(xì)胞膜，所以被稱作滲透性抗凍保護(hù)劑或細(xì)胞內(nèi)液抗凍保護(hù)劑。細(xì)胞內(nèi)、外液的抗凍保護(hù)劑的摩爾濃度較高的情況下，使溶液的冰點(diǎn)下降，具有抑制冰晶生成的作用。12/16/20225動物繁殖原理與技術(shù)（2）化學(xué)損傷（滲透效應(yīng)或溶液效應(yīng)、胞外冰晶）降溫較慢時，胞內(nèi)的水分不斷外流然后結(jié)冰，即胞外冰晶。細(xì)胞外液的水分形成冰晶后使未結(jié)冰溶液濃度升高，若鹽類濃度升高，對細(xì)胞產(chǎn)生離子影響(鹽害)，即高濃度的的電解質(zhì)作用于細(xì)胞膜，引起脂蛋白復(fù)合物的變性和部分類脂質(zhì)的丟失，增加了細(xì)胞膜對陽離子的通透性，在細(xì)胞上形成一些小孔，解凍時水分大量進(jìn)入細(xì)胞造成滲透休克。12/16/20226動物繁殖原理與技術(shù)此時胞內(nèi)外滲透壓在高位相近或相等，隨著冷卻時間的延長，細(xì)胞外液有更多的冰晶，使水分逐漸減少，溶液發(fā)生濃縮，對細(xì)胞的影響越來越大，原生質(zhì)變干，電解質(zhì)濃度增高，酸堿度失衡；抗凍液的濃度升高，抗凍劑的化學(xué)毒性也隨之增大，同樣導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這是冷凍對細(xì)胞的化學(xué)損傷，也稱溶液效應(yīng)（solutioneffects）。降低溫度可以減少鹽類和抗凍保護(hù)劑對細(xì)胞的化學(xué)損傷。為避免化學(xué)損傷，冷卻過程中應(yīng)盡快地使溶液降至致命溫度以下的低溫狀態(tài)。12/16/20227動物繁殖原理與技術(shù)（3）低溫?fù)p傷和低溫打擊一些動物品種的卵子或胚胎，在10～20℃情況下則可受到損傷。這與胞質(zhì)內(nèi)的脂肪顆粒的含量有關(guān)，這種損傷稱為低溫?fù)p傷（chillinginjury）。豬的胚胎在孵化囊胚以前的發(fā)育階段對低溫?fù)p傷更為敏感，故迄今豬的卵子和胚胎的冷凍保進(jìn)展緩慢。牛體內(nèi)受精卵發(fā)育到致密桑葚胚前和體外受精卵發(fā)育到致密桑葚胚階段的胚胎，仍可出現(xiàn)低溫?fù)p傷現(xiàn)象。但是，體內(nèi)或體外的胚胎超過上述發(fā)育階段時，幾乎不受低溫?fù)p傷的影響。12/16/20228動物繁殖原理與技術(shù)（4）抗凍保護(hù)劑的化學(xué)毒性采用慢速冷凍法對胚胎或卵子進(jìn)行冷凍保存，其冷凍液中所含抗凍保護(hù)劑的濃度一般在1.0～2.Omol/L。添加抗凍保護(hù)劑和生理性溶液大不相同，當(dāng)胚胎或卵子移入含有抗凍保護(hù)劑溶液中平衡，隨著時間的延長和濃度的升高，生存率下降。12/16/202210動物繁殖原理與技術(shù)（5）破裂損傷液氮中保存的胚胎或卵子，解凍后常見到透明帶或部分胞質(zhì)破裂。在投入液氮冷凍前的胚胎或卵子，處于濃縮的抗凍液中，投入液氮后溶液由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)(詳見常規(guī)冷凍法)。12/16/202212動物繁殖原理與技術(shù)（6）滲透性休克冷凍胚胎剛解凍時，細(xì)胞內(nèi)通常所含的滲透性保護(hù)劑濃度很高，可達(dá)2000～3000mOsm/L或更高，若此時將胚胎置于滲透壓為300mOsm/L的等滲溶液中，大量水分快速進(jìn)入細(xì)胞而保護(hù)劑卻不能立即滲出，細(xì)胞急劇膨脹甚至破裂，這種現(xiàn)象稱為滲透性休克。12/16/202214動物繁殖原理與技術(shù)細(xì)胞對皺縮和膨脹的耐受度卵子和胚胎不能耐受過大而突然的跨膜滲透壓差。大鼠的合子，在生理溫度下，逐漸改變其容積，皺縮到正常體積的25%或膨脹到290%，然后恢復(fù)到正常可不影響其繼續(xù)發(fā)育。容積變化的速度和變化時的溫度較容積變化的大小對合子的發(fā)育更重要。為避免滲透性休克對胚胎的損害，為使抗凍保護(hù)劑盡快地脫出，將細(xì)胞膨脹控制在最小程度，有兩種方法：

12/16/202215動物繁殖原理與技術(shù)滲透壓緩沖液一種是選擇胞內(nèi)抗凍劑；一種是在解凍液中加入胞外抗凍劑，使細(xì)胞外液與細(xì)胞內(nèi)液等滲，這樣，將胚胎放入胞外抗凍劑形成的滲透壓緩沖液中，就不會因胞內(nèi)含大量的胞內(nèi)抗凍劑而吸入大量水分。因胞外無滲透性抗凍劑，它可從胞內(nèi)滲出，從而被稀釋，使細(xì)胞的膨脹得到控制。常用蔗糖等雙糖溶液作為滲透壓緩沖液。12/16/202216動物繁殖原理與技術(shù)脫出細(xì)胞抗凍護(hù)劑時注意事項(xiàng)細(xì)胞內(nèi)的抗凍保護(hù)劑脫出后，若溫度大于25℃時長時間受蔗糖液的作用，細(xì)胞在一定時間內(nèi)仍處于收縮狀態(tài)，長時間的收縮也能對細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用，妊娠率明顯較低。新鮮的胚胎或卵子對滲透壓造成的膨脹和收縮所產(chǎn)生影響的抵抗能力較強(qiáng)，但冷凍/解凍后的卵子或胚胎則否。值得注意的是，在脫出細(xì)胞抗凍護(hù)劑的同時要使細(xì)胞膨脹控制在最小程度，但抗凍保護(hù)劑被脫出后又不能使細(xì)胞過度收縮。12/16/202217動物繁殖原理與技術(shù)2.克服冷凍、解凍對細(xì)胞損傷的理論和實(shí)踐不管是物理損傷還是化學(xué)損傷，其根源都是由冰晶引起的，要使細(xì)胞在冷凍后仍能復(fù)蘇，就要改變冷凍降溫過程中冰晶的質(zhì)和量。12/16/202218動物繁殖原理與技術(shù)物質(zhì)的玻璃態(tài)1）物質(zhì)在低溫下為固態(tài)，固態(tài)可分為兩種情況，一般的結(jié)晶態(tài)和不穩(wěn)定的玻璃態(tài)，冷凍情況下致死細(xì)胞的冰晶屬結(jié)晶態(tài)。12/16/202220動物繁殖原理與技術(shù)玻璃態(tài)形成的條件2）從液態(tài)變?yōu)椴ＡB(tài)需要特定條件，即在很短的時間內(nèi)使溶液的溫度迅速降至-130℃以下，即可跨越結(jié)晶態(tài)而形成玻璃態(tài)。為此應(yīng)滿足以下兩個條件：一是被冷凍對象的體積必須盡量的小，以便減少結(jié)晶中心的冰晶和在其中形成的機(jī)會；二是被冷凍的對象應(yīng)該被迅速降溫以便使結(jié)晶和來不及形成。據(jù)推算，將0℃的水降到-130℃形成玻璃態(tài)的降溫速度應(yīng)該在0.026秒內(nèi)完成，亦即每秒降溫5000℃，現(xiàn)在常用的冷源和冷凍方法很難達(dá)到這樣的降溫速度。12/16/202221動物繁殖原理與技術(shù)（2）最適降溫速度許多實(shí)驗(yàn)證明影響細(xì)胞存活的首要因素是冷凍時溫度降至‐60℃以下的速度。若與細(xì)胞的存活率為縱坐標(biāo)，以降溫速度為橫坐標(biāo)，則細(xì)胞的存活率曲線呈現(xiàn)倒V字形。這個曲線表明，降溫速度過慢，形成胞內(nèi)冰晶的危害不存在，但化學(xué)損傷很強(qiáng)烈；反之，降溫速度過快，雖避免了化學(xué)損傷，但胞內(nèi)冰晶造成的物理損傷使細(xì)胞的存活率下降，圖中倒V字頂點(diǎn)對應(yīng)的降溫速度可以認(rèn)為是最適降溫速度，此時物理損傷與化學(xué)損傷的危害都最小。12/16/202223動物繁殖原理與技術(shù)細(xì)胞不同最適降溫速度不同小鼠胚胎為0.3℃／min，人的紅血球是800℃／min或更快。為什么最適降溫速度因細(xì)胞種類不同而異呢？細(xì)胞不同相對滲透面積——表面積與容積之比不同，因之對水的通透能力有差異。例如人的紅血球在20℃下對水的通透性是5μm3／μm2大氣壓.min，滲透的能量為6千卡／克分子，在生理鹽水中的最適降溫速度為800～2000℃／min。小鼠卵子的體積比人的紅血球大2000倍，對水的通透性是0.4μm3／μm2大氣壓.min，通透能量為14千卡／克分子，最適降溫速度小于1℃／min。12/16/202224動物繁殖原理與技術(shù)最適降溫速度與細(xì)胞存活率降溫速度（℃/min)化學(xué)損傷物理損傷最適較慢較快存活率（%）255012/16/202226動物繁殖原理與技術(shù)（3）抗凍保護(hù)劑的使用：可以說，沒有抗凍保護(hù)劑的使用，就沒有配子和胚胎的冷凍保存技術(shù)。12/16/202227動物繁殖原理與技術(shù)抗凍保護(hù)劑（cryoprotectiveagents）是指某一類化合物，可以保護(hù)細(xì)胞抵抗低溫或超低溫對細(xì)胞產(chǎn)生的損害，如細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰、脫水、溶質(zhì)濃度提高和蛋白質(zhì)變性及其細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的損傷等。這類化合物稱作抗凍保護(hù)劑。常用的抗凍保護(hù)劑可分為以下兩大類：12/16/202228動物繁殖原理與技術(shù)2）非滲透性抗凍保護(hù)劑非滲透性抗凍保護(hù)劑通常也稱作細(xì)胞外液抗凍保護(hù)劑，其中包括蔗糖(分子量342.30)、聚蔗糖70(分子量70000)、葡聚糖(dextran，分子量70000)、牛血清白蛋白(BSA，分子量)、胎牛血清(FBS，分子量)、聚乙烯乙二醇(PEG，分子量～10000)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量)等。12/16/202230動物繁殖原理與技術(shù)3）抗凍保護(hù)劑的作用原理從抗凍保護(hù)劑的分子結(jié)構(gòu)看，大多有幾個羥基（－OH），可以和溶液中水分子形成氫鍵，在冷凍過程中，水分子受到多羥基物質(zhì)的牽制，阻礙了結(jié)晶的形成。減弱了冰晶對細(xì)胞的物理損傷和化學(xué)損傷，此第一；12/16/202231動物繁殖原理與技術(shù)第二由于抗凍劑屬親水性物質(zhì)，冰點(diǎn)低，許多低分子量抗凍劑滲透性強(qiáng)，從危險溫度區(qū)（0～-60℃）的上限縮小了危險溫度區(qū)，同時也減少了胞內(nèi)冰晶。12/16/202232動物繁殖原理與技術(shù)第三以甘油為代表的抗凍劑的加入沖淡了溶液中溶質(zhì)濃度，尤其是滲入胞內(nèi)的甘油，降低了胞內(nèi)的溶質(zhì)濃度，從而在冷凍時，阻止了在-15℃以下引起的細(xì)胞蛋白質(zhì)變性；12/16/202233動物繁殖原理與技術(shù)第四滲透型冷凍保護(hù)劑保證了細(xì)胞內(nèi)外蒸氣壓相近，減緩了細(xì)胞的脫水速度和皺縮程度，維持了細(xì)胞正常的形態(tài)。12/16/202234動物繁殖原理與技術(shù)（4）過冷狀態(tài)與植冰純水的冰點(diǎn)為0℃，生理鹽水的冰點(diǎn)約-0.6℃。胚胎的常規(guī)冷凍法是采用1.O～2.Omol/L濃度的抗凍保護(hù)劑，其溶液的冰點(diǎn)為-2.6～-4.8℃。但往往這種溶液到達(dá)冰點(diǎn)溫度時不結(jié)冰，而在低于冰點(diǎn)10℃左右的溫度下也不會生成冰晶，這種現(xiàn)象叫做過冷現(xiàn)象。所以在稍低于溶液冰點(diǎn)溫度(一般在-5℃)時強(qiáng)行冷卻可以使溶液結(jié)冰，使溶液瞬間渡過冰點(diǎn)溫度，防止過冷現(xiàn)象的發(fā)生。這種促使溶液結(jié)冰的方法，稱作誘發(fā)結(jié)晶或植冰。12/16/202235動物繁殖原理與技術(shù)在超低溫冷凍過程中，過冷現(xiàn)象的產(chǎn)生是細(xì)胞死亡的重要原因。溶液在冰點(diǎn)下任一溫度都可能回升到冰點(diǎn)，對細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用。如果溶液在結(jié)冰的溫度離冰點(diǎn)很遠(yuǎn)(如-15℃以下)，則由于潛熱的釋放使溶液溫度迅速上升，接著又急劇下降，細(xì)胞往往就在溫度的這種劇烈變化中死亡。12/16/202236動物繁殖原理與技術(shù)過冷程度與玻璃化有關(guān)另外，分子的運(yùn)動和溫度呈正相關(guān)。當(dāng)溶液在較高溫度(冰點(diǎn)附近)下結(jié)冰時，水分子還處于相當(dāng)活躍的運(yùn)動狀態(tài)，生成的結(jié)晶就小且來不及排列，呈現(xiàn)無序狀態(tài)，對細(xì)胞影響不大。倘若出現(xiàn)過冷卻現(xiàn)象，溶液在過冷狀態(tài)下較低的溫度(-15℃或更低)結(jié)冰，則水分子由于運(yùn)動速度放慢，可以逐漸有序地整齊排列，生成大的冰晶，對細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷。同時，過冷卻溶液凍結(jié)時釋放的潛熱較正常情況下高，這種溫度的回升同樣對細(xì)胞的存活十分有害。12/16/202237動物繁殖原理與技術(shù)植冰溫度為防止過冷現(xiàn)象的發(fā)生，一般采用低于溶液冰點(diǎn)幾攝氏度誘發(fā)結(jié)冰。誘發(fā)結(jié)冰的溫度不同的動物的胚胎稍有不同，小鼠胚胎為-3.5～-5℃，家兔和羊?yàn)?5～-6℃，牛為-7℃。低于-7℃，各種動物的胚胎存活率均下降。12/16/202238動物繁殖原理與技術(shù)（5）玻璃化溶液的采用含有高濃度的抗凍保護(hù)劑溶液(6mol/L以上)，在0℃以上溫度直接投入液氮的急速冷卻過程中，液體的粘度增加，當(dāng)粘度達(dá)到臨界值時發(fā)生凝固化。自由液態(tài)變?yōu)榘牍虘B(tài)再過渡為固態(tài)，且呈現(xiàn)透明狀態(tài)，故稱作玻璃化。12/16/202239動物繁殖原理與技術(shù)玻璃化溶液中添加高濃度的滲透性抗凍保護(hù)劑，借助于細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的差距，分子量較小的抗凍保護(hù)劑通過細(xì)胞膜向細(xì)胞內(nèi)部滲透，同時細(xì)胞內(nèi)的水分向外脫出。由于玻璃化溶液的摩爾濃度較高，短時間內(nèi)使胞內(nèi)外抗凍保護(hù)劑的濃度達(dá)到平衡，使降溫過程中胞內(nèi)冰晶的生成受到抑制。12/16/202240動物繁殖原理與技術(shù)脫毒——脫出胞內(nèi)抗凍劑另外，抗凍保護(hù)液中添加非滲透性的抗凍保護(hù)劑(蔗糖、海藻糖等)，能增加溶液的滲透壓，使細(xì)胞內(nèi)部的水分能充分脫出，同時也有助于滲透性抗凍保護(hù)劑的滲入。解凍時借助其滲透壓力的作用，脫出細(xì)胞內(nèi)部抗凍保護(hù)劑(也稱作脫毒)12/16/202241動物繁殖原理與技術(shù)非滲透性的高分子抗凍保護(hù)劑添加非滲透性的高分子抗凍保護(hù)劑(Ficoll、DextranFCS、PVP、PEG、BSA等)，這些物質(zhì)不能透過細(xì)胞膜，在急速降溫過程中粘性增加在細(xì)胞外液形成玻璃化狀態(tài)。由于降溫過程對溶液產(chǎn)生巨大的壓力，而玻璃化冷凍液是呈現(xiàn)液態(tài)—半固態(tài)—固態(tài)的過程，并且細(xì)管中的冷凍液有多層空氣段隔離，為此使胚胎在降溫過程中的壓力能夠得到緩沖，也不致使細(xì)管破裂12/16/202242動物繁殖原理與技術(shù)低化學(xué)毒性同時玻璃化冷凍使細(xì)胞內(nèi)液、外液皆不產(chǎn)生冰晶，所以對胚胎起到保護(hù)作用。由于這些物質(zhì)未能透過細(xì)胞膜，因此與細(xì)胞滲透性抗凍保護(hù)劑相比，它們對細(xì)胞的化學(xué)毒性非常低。12/16/202243動物繁殖原理與技術(shù)（三）胚胎的冷凍保存方法與胞內(nèi)外變化分析12/16/202244動物繁殖原理與技術(shù)1、常規(guī)冷凍法在室溫下用PBS等生理性溶液加抗凍保護(hù)劑配制成1.O～2.0mol/L的抗凍液，將胚胎置于此溶液中處理。采用的抗凍保護(hù)劑有DMSO、丙三醇和乙二醇等。由于細(xì)胞外部的抗凍液滲透壓比較高，為保持細(xì)胞內(nèi)、外滲透壓的平衡，細(xì)胞內(nèi)的水分向外滲出，胚胎開始收縮。隨后抗凍保護(hù)劑滲入，同時水分向細(xì)胞內(nèi)回流，胚胎體積得以恢復(fù)。12/16/202245動物繁殖原理與技術(shù)平衡時間約需10～20min。將胚胎裝入配制好抗凍液的0.25ml塑料細(xì)管中，置程序降溫儀中降溫。當(dāng)降溫至冰點(diǎn)或稍低于冰點(diǎn)溫度時(含有1.5mol/L抗凍液，約-4℃)植冰。植冰后細(xì)胞外液的冰晶形成和抗凍液的濃縮，使?jié)B透壓升高，形成細(xì)胞內(nèi)、外液的滲透壓差。在處于低溫的情況下，抗凍保護(hù)劑不再通過細(xì)胞膜進(jìn)行滲透。12/16/202246動物繁殖原理與技術(shù)為保持滲透壓的平衡，細(xì)胞內(nèi)的水分向外滲出，使細(xì)胞收縮，胞質(zhì)內(nèi)的抗凍液也被濃縮。然后以0.3～0.5℃/min的速度降溫至-30～-35℃，在降溫過程中，細(xì)胞外液冰晶逐漸增加和溶液不斷濃縮，為調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，因此細(xì)胞內(nèi)的水分不斷滲出并不斷地形成冰晶，使得細(xì)胞內(nèi)、外液同時濃縮。12/16/202247動物繁殖原理與技術(shù)因此細(xì)胞內(nèi)的水分不斷滲出并不斷地形成冰晶，使得細(xì)胞內(nèi)、外液同時濃縮。胚胎或卵母細(xì)胞與精子相比體積較大，但相對表面積卻較小，在低溫下細(xì)胞內(nèi)的水分向外滲出需要一定的時間，所以緩慢降溫是非常必要的。最初的胚胎冷凍方法是連續(xù)慢速降溫到-60～-75℃時投入液氮中，而后來有人慢速降溫至-25～-35℃的溫度區(qū)域內(nèi)投入液氮中冷凍保存。至今上述方法仍被廣泛使用。12/16/202248動物繁殖原理與技術(shù)緩慢降溫使得細(xì)胞內(nèi)液高度濃縮，即使降溫到液氮相同的溫度，胞質(zhì)內(nèi)也不會有冰晶生成。另外，細(xì)胞外液的冰晶之間也有部分濃縮的溶液存在，這部分溶液也不會形成冰晶。無論是何種溶液，在急速降溫的情況下，溶液的粘性急劇增高，形成非結(jié)晶的固體的現(xiàn)象稱為玻璃樣狀態(tài)，即玻璃化。12/16/202249動物繁殖原理與技術(shù)玻璃化轉(zhuǎn)相溫度溶液形成玻璃化的溫度(玻璃化轉(zhuǎn)相溫度)大約在-110～-130℃。若快速通過此溫度區(qū)域，易造成胚胎破裂。所以當(dāng)樣本慢速降溫至-25～-35℃(或-60～-75℃)時，并不直接投入液氮中，而是在液氮?dú)庵醒魯?shù)分鐘，使其緩慢通過玻璃化轉(zhuǎn)相溫度，然后再投入液氮中冷凍效果較好。12/16/202250動物繁殖原理與技術(shù)胚胎在溶液中保存期間，隨時間的延長，其生存能力下降。但是，當(dāng)細(xì)胞外液形成玻璃化，即形成固態(tài)時，分子停止運(yùn)動，可進(jìn)行半永久保存。若要進(jìn)行長期保存必須在-130℃以下，通常使用液氮保存。液氮保存的溫度為-196℃，液氮?dú)庵斜４嬉材鼙３?150℃，長期冷凍保存的情況下，胚胎解凍后其生存力不會受到影響。12/16/202251動物繁殖原理與技術(shù)2.玻璃化冷凍法已知慢速降溫后使胚胎的內(nèi)、外液充分濃縮，投入液氮后由于胚胎細(xì)胞內(nèi)部形成玻璃化使其保持生存能力。那么如果胚胎在O℃以上的溫度下，置于高濃度且急速降溫時易形成玻璃化的溶液中平衡后，直接投入液氮中，使細(xì)胞內(nèi)、外液皆形成玻璃化狀態(tài)，胚胎也應(yīng)不會發(fā)生死亡。12/16/202252動物繁殖原理與技術(shù)1985年Rall等人利用小鼠的胚胎為實(shí)驗(yàn)材料，研發(fā)了胚胎的玻璃化冷凍法。此法快速、簡單而高效，還可以免去昂貴的控溫冷凍儀。它是在常規(guī)胚胎冷凍的基礎(chǔ)上采用高濃度的低滲性冷凍保護(hù)劑。12/16/202253動物繁殖原理與技術(shù)在平衡過程中，高濃度的保護(hù)劑大量滲入胚胎細(xì)胞內(nèi)，同時細(xì)胞內(nèi)水分大量滲出，由于細(xì)胞內(nèi)防凍劑濃度很高，水分很少，在冷凍時胚胎內(nèi)不形成冰晶而形成均勻的玻璃化狀態(tài)，這樣就避免了常規(guī)冷凍法在冷凍過程中形成冰晶而損傷細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架的現(xiàn)象發(fā)生。另外，細(xì)胞外液也不生成冰晶，幾乎不產(chǎn)生物理性的損傷，胚胎生存率高。此方法尚在不斷改良，正朝著實(shí)用化方向發(fā)展。12/16/202254動物繁殖原理與技術(shù)玻璃化溶液玻璃化冷凍法所采用的抗凍液，稱為玻璃化溶液。此溶液是以PBS為基礎(chǔ)液，添加高濃度的抗凍保護(hù)劑配制而成。當(dāng)抗凍保護(hù)劑的濃度達(dá)到50%(v/v)，或8.Omol/L以上時，選擇化學(xué)毒性較低的抗凍保護(hù)劑是非常必要的。已經(jīng)研制出了多種改良的玻璃化溶液，抗凍保護(hù)劑的組合也多種多樣。采用乙二醇為主體抗凍保護(hù)劑。乙二醇具有化學(xué)毒性較低、滲透速度較快等特點(diǎn)。抗凍保護(hù)劑的滲透速度快和處理時間短，可避免其對細(xì)胞化學(xué)毒性作用。12/16/202255動物繁殖原理與技術(shù)玻璃化溶液添加的成分功能在玻璃化溶液中，添加滲透性抗凍保護(hù)劑的同時，有必要添加聚蔗糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙二醇、胎牛血清和牛血清白蛋白等高分子物質(zhì)以及蔗糖和海藻糖等非滲透性糖類物質(zhì)。這些物質(zhì)化學(xué)毒性較低，高分子物質(zhì)對溶液形成玻璃化具有重要作用。添加非滲透性物質(zhì)也可以降低抗凍保護(hù)劑的濃度，因此間接地起到降低玻璃化溶液的毒性作用。另外，蔗糖類物質(zhì)的滲透壓作用使細(xì)胞發(fā)生收縮，從而限制滲透性抗凍保護(hù)劑過量地滲入細(xì)胞內(nèi)，也間接地起到降低化學(xué)毒性的效果。12/16/202256動物繁殖原理與技術(shù)胚胎一步法玻璃化冷凍保存法該方法利用乙二醇為主體抗凍保護(hù)劑，添加高分子聚蔗糖和滲透壓較高的蔗糖，配制成約7.5mol/L濃度的玻璃化溶液(EFS40)，在室溫(20℃)條件下，將胚胎直接裝入含有玻璃化溶液的塑料細(xì)管中，經(jīng)2min平衡后投入液氮，小鼠桑葚胚冷凍解凍后的發(fā)育率達(dá)98%，家兔桑葚胚冷凍解凍后100%發(fā)育到囊胚。冷凍后胚胎移植妊娠率分別達(dá)到69%和60%。12/16/202257動物繁殖原理與技術(shù)胚胎二步法玻璃化冷凍法分別采用乙二醇或丙三醇以及乙二醇和DMSO為主體抗凍保護(hù)劑，配制成EFS、GFS、EDT玻璃化溶液，在室溫(20～25℃)條件下，先將胚胎在10%乙二醇(或丙三醇或10%乙二醇+10%DMSO)溶液中預(yù)處理5min，然后再移入含有上述玻璃化溶液的細(xì)管中，平衡30s后將細(xì)管封口，投入液氮中冷凍保存。小鼠、家兔、牛和羊體內(nèi)生產(chǎn)的囊胚經(jīng)冷凍解凍后的繼續(xù)發(fā)育率達(dá)92～98%。12/16/202258動物繁殖原理與技術(shù)二步法冷凍處理的優(yōu)點(diǎn)具有腔體的囊胚，滲透性抗凍保護(hù)劑向細(xì)胞內(nèi)滲透需要時間長，如果在高濃度的玻璃化溶液中直接平衡，隨時間的延長，化學(xué)毒性對胚胎的影響加大。先用低濃度抗凍保護(hù)劑預(yù)處理胚胎，使抗凍保護(hù)劑充分滲透到細(xì)胞內(nèi)部，然后再移入高濃度玻璃化溶液中平衡，短時間內(nèi)細(xì)胞高度脫水后冷凍保存。這種做法既能使抗凍保護(hù)劑向細(xì)胞內(nèi)部充分滲透，又能避免高濃度玻璃化溶液的化學(xué)毒性的損傷，同時又能很好地形成玻璃化狀態(tài)，提高了冷凍-解凍后的胚胎存活率。12/16/202259動物繁殖原理與技術(shù)3.解凍方法常規(guī)冷凍和玻璃化冷凍法的解凍方法有所不同，現(xiàn)將各自的解凍方法分別加以介紹。12/16/202260動物繁殖原理與技術(shù)(1)常規(guī)冷凍法的解凍方法胚胎的解凍根據(jù)冷凍時降溫速度快慢來決定，緩慢的冷凍胚胎因失水完全，故因通過緩慢的解凍而逐漸復(fù)水，若快速解凍則會使胚胎細(xì)胞膜承受不住瞬間大量水分滲入的壓力。相反，快速冷凍則由于胚胎細(xì)胞滲出的水分少，使其體積變化小，故必須配合快速解凍，以防止解凍過程引起重復(fù)結(jié)晶而損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。這就是所謂的“快凍者快解、慢凍者慢解”。。12/16/202261動物繁殖原理與技術(shù)常規(guī)冷凍法保存的細(xì)管，胚胎由液氮中取出后在空氣中停留10～15s后，浸入室溫水或37℃水浴中解凍。空氣中停留是為了慢速通過胚胎易產(chǎn)生破裂的溫度區(qū)域(即-110～-130℃)。由于此方法受冰晶生成的影響，徹底防止細(xì)胞破裂的發(fā)生有一定的困難。12/16/202262動物繁殖原理與技術(shù)脫玻璃化（divitrification）慢速降溫不論是-25～-35℃或-60℃以下冷凍保存的樣本，其細(xì)胞內(nèi)液的濃縮程度均不充分，在解凍、升溫過程中有冰晶形成現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱為脫玻璃化。脫玻璃化的產(chǎn)生對細(xì)胞具有致命性的打擊。產(chǎn)生脫玻璃化的溫度區(qū)域?yàn)?80～-50℃，升溫速度越慢越容易產(chǎn)生此種現(xiàn)象。為避免脫玻璃化現(xiàn)象的產(chǎn)生，解凍時必須快速通過這個溫度區(qū)域。所以細(xì)管在空氣中停留后，應(yīng)迅速浸入水浴中升溫。12/16/202263動物繁殖原理與技術(shù)解凍后將細(xì)管中的內(nèi)容物沖出，用PBS或其他等滲液稀釋的0.5mol/L蔗糖液脫出細(xì)胞內(nèi)部的抗凍保護(hù)劑，然后將胚胎移入等滲生理溶液中洗凈備用。但是回收的胚胎需在顯微鏡下操作，如牛等大家畜胚胎需要裝入一支細(xì)管中移植給受體母畜。這種操作有些繁瑣，操作過程中容易丟失胚胎。若像冷凍精液一樣，解凍后胚胎不出細(xì)管直接移植，則在生產(chǎn)中會更實(shí)用。12/16/202264動物繁殖原理與技術(shù)氣泡的作用所以有研究者在細(xì)管內(nèi)將冷凍保存液和稀釋液用空氣層隔開，解凍后用力甩動，兩液混合后進(jìn)行移植，近年來這種方法在生產(chǎn)中得到部分應(yīng)用。上述方法解凍后不經(jīng)稀釋，抗凍保護(hù)劑的脫出是在母畜子宮中進(jìn)行。為此應(yīng)選用對細(xì)胞膜通透性強(qiáng)，化學(xué)毒性低的抗凍保護(hù)劑為宜。試驗(yàn)證明，乙二醇要比丙三醇等其他種類的抗凍保護(hù)劑效果好。12/16/202265動物繁殖原理與技術(shù)(2)玻璃化冷凍解凍方法：玻璃化冷凍保存的樣本，解凍時和慢速冷凍法基本相同；細(xì)管在空氣中停留10～15s后浸入室溫(20～25℃)水浴中解凍。玻璃化冷凍法由于抗凍液的摩爾濃度較高，降溫和升溫過程中，玻璃化轉(zhuǎn)相溫度通過的比較緩和，可徹底防止胚胎的破裂現(xiàn)象。12/16/202266動物繁殖原理與技術(shù)防止脫玻璃化玻璃化溶液中含有高濃度抗凍保護(hù)劑，在液氮中處于超低溫狀態(tài)的情況下，若抗凍保護(hù)劑的濃度達(dá)不到所要求的程度，在浸入水浴的數(shù)秒后可觀察到有乳白色(脫玻璃化)現(xiàn)象產(chǎn)生。這種現(xiàn)象在解凍時所發(fā)生的幾率比冷凍過程多。脫玻璃化使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，直接影響胚胎的存活。為此，在易產(chǎn)生脫玻璃化的溫度區(qū)域(-80～-50℃)應(yīng)快速升溫，對防止脫玻璃化現(xiàn)象的產(chǎn)生非常重要。12/16/202267動物繁殖原理與技術(shù)防止化學(xué)毒性的操作玻璃化溶液中抗凍保護(hù)劑的含量較高，對細(xì)胞的化學(xué)毒性影響也較大。解凍后若不經(jīng)稀釋，在室溫下放置，短時間內(nèi)會造成胚胎死亡，所以解凍后應(yīng)盡快將細(xì)管中的內(nèi)容物沖出，并在0.3～1.Omol/L蔗糖溶液中稀釋以脫出細(xì)胞內(nèi)部抗凍保護(hù)劑。借助蔗糖溶液的滲透壓作用，使細(xì)胞進(jìn)一步脫水而收縮，脫水的同時將細(xì)胞內(nèi)部的抗凍保護(hù)劑一同脫出，然后再放入等滲生理溶液(PBS液等)中洗凈后供移植或其他實(shí)驗(yàn)使用。12/16/202268動物繁殖原理與技術(shù)尚待解決的問題牛胚胎經(jīng)玻璃化冷凍保存后，也曾有人做過細(xì)管內(nèi)部直接進(jìn)行解凍(一步細(xì)管法)。但是玻璃化溶液的粘性非常大，加之抗凍液和蔗糖溶液有多層空氣段隔離，混合比較困難。另外，利用這種方法解凍，由于溶液的化學(xué)毒性較大，細(xì)胞內(nèi)部抗凍保護(hù)劑不能及時、充分地脫出，使胚胎的存活率下降。為此玻璃化冷凍保存后的胚胎，不經(jīng)過脫出抗凍保護(hù)劑的過程則直接移植，目前的技術(shù)條件尚欠成熟。12/16/202269動物繁殖原理與技術(shù)4.抗凍劑的脫除解凍后的胚胎需脫除防凍劑，恢復(fù)在培養(yǎng)液中繼續(xù)發(fā)育或進(jìn)行移植，根據(jù)冷凍胚胎時防凍劑的添加方法不同，可相應(yīng)的采用不同方法去除，如采用了濃度梯度遞增方法的則用由高到低的濃度梯度逐漸脫除；如果是一步法添加的則用一步法解除。12/16/202270動物繁殖原理與技術(shù)5.幾種哺乳動物胚胎超低溫冷凍保存方法12/16/202271動物繁殖原理與技術(shù)（1）小鼠：冷凍用培養(yǎng)液可選擇PBS、PB1或M2，pH為7.2與7.4。胚胎可裝入帶塑料塞的小管或小玻璃試管中(75mm長，粗10mm)或授精用的塑料細(xì)管中。加0.15m1培養(yǎng)液于小管中，將胚胎或卵母細(xì)胞吸入，降溫到0℃，10min后吸入0.15ml3molDMSO。15min鐘以后將其移到-6℃的植冰小皿中。用從液氮中預(yù)冷的鑷子按常規(guī)方法植冰，5min后移到冷凍的裝有液氮的小罐中，以每分鐘下降-0.5℃的速度降到-40℃或-70℃，然后放液氮罐中保存。解凍時，取出細(xì)管使以每分鐘上升500℃的速度速升到-40℃，然后立即放于40℃的熱水中。取出細(xì)管5min使降到室溫。加1mlM2于0.3ml細(xì)管中，使混合，以脫去DMSO。1min后移到平皿中，再用M22ml洗2次。12/16/202272動物繁殖原理與技術(shù)（2）兔：把8～16細(xì)胞期胚胎連同保存液裝入冷凍細(xì)管，保存液為PBS+50%兔血清+1.5molDMSO。在37℃平衡15min，再以1℃/min的速度冷卻至-76℃。之后，直接投入液氮。解凍時，從-80℃以4℃/min升為0℃。在37℃分級稀釋DMSO，充分洗滌后，經(jīng)培養(yǎng)可發(fā)育到囊胚，移植后產(chǎn)仔。采用一步法、玻璃化法等冷凍兔胚胎均獲成功。12/16/202273動物繁殖原理與技術(shù)（3）綿羊：用DMSO和乙二醇作為冷凍保護(hù)劑，以慢速冷凍法可得到30%～60%的妊娠率。用玻璃化法冷凍解凍后，也已移植產(chǎn)羔羊。12/16/202274動物繁殖原理與技術(shù)（4）山羊：用慢速冷凍、慢速解凍法。其方法是：將7天的早期囊胚，在含有25%血清的PBS中浮游并移入試管，37℃時分步加入2.0mol/l甘油0.3m1，使甘油最終濃度為1.0mol/l。以1℃/min速度降到6℃。在干冰中以0.2～1.4℃/min降到-60℃，中途在-25℃植冰，由-60℃直接投入液氮中。解凍速度為1.4～8.0℃/min，由-50℃升至0℃，再以0.6℃/min升至37℃。以10倍的PBS稀釋，使甘油降至1/4以下，再以PBS洗滌數(shù)次，短期培養(yǎng)后移植。玻璃化法冷凍解凍移植也已獲得羔羊。12/16/202275動物繁殖原理與技術(shù)（5）馬和豬：馬早期囊胚比擴(kuò)展囊胚更適于冷凍，但冷凍存活率偏低。豬胚胎對溫度變化特別敏感，冷凍成功率很低。較晚期豬胚胎如擴(kuò)展和孵化囊胚對溫度有一定的適應(yīng)性，降到6℃仍有一些存活。用慢速降溫至-35℃(0.3℃/min)的擴(kuò)展囊胚，解凍移植后可產(chǎn)仔。有人報道，用液氮保存后的豬胚胎移植產(chǎn)仔，終于使豬胚胎冷凍有了重大突破(Niemann，1991)。12/16/202276動物繁殖原理與技術(shù)（6）牛：家畜胚胎冷凍以牛胚胎最為成功。添加牛血清或牛血清白蛋白的杜氏PBS，一直被廣泛用于胚胎保存的基礎(chǔ)液。采用慢速冷凍、快速冷凍、一步冷凍及玻璃化法，均可成功。甘油比DMSO更有利于牛胚胎冷凍。牛胚胎冷凍已廣泛應(yīng)用于商業(yè)性胚胎移植工作。12/16/202277動物繁殖原理與技術(shù)（7）人：1981年Trunson等首先將冷凍解凍技術(shù)用于人胚，并用DMSO作保護(hù)劑首次將人胚冷凍并妊娠。到目前為止，超低溫冷凍保存人的IVF胚胎，在國內(nèi)外均已移植成功。據(jù)報道，正常胚胎移植的妊娠失敗率，也可達(dá)到1%～2%，冷凍胚胎尤其是冷凍IVF人胚，成功率就更低。8～16細(xì)胞的人胚冷凍效果較好。12/16/202278動物繁殖原理與技術(shù)但也有人認(rèn)為4細(xì)胞冷凍后的成活率也不低。人胚的冷凍保護(hù)劑為DMSO和丙二醇。配制保護(hù)劑使用PBS+20%人臍帶血清(HCS)，首先配制1.5mo1的丙二醇和0.1mol的蔗糖。胚胎平衡過程是先移入1.5ml丙二醇中15min，再移入1.5ml丙二醇加0.1mol的蔗糖中。12/16/202279動物繁殖原理與技術(shù)按常規(guī)方法將胚胎吸入冷凍細(xì)管并封口，以每分鐘下降2℃的速度從室溫降到-7℃，以與小鼠的同樣方法植冰，后以每分鐘0.3℃的速度降到-30℃，再投入液氮中保存。解凍時，從液氮中取出，室溫中放40s，即速投入30℃的熱水中，冰晶溶解后，將胚胎移入1.0mol/L丙二醇加0.2mol/L蔗糖中，再移到0.5mol/L丙二醇+0.2mol/L蔗糖液以及PBS+HCG中，各5min以脫去保護(hù)劑。早期囊胚也可先用0.25mol/LDMSO10min后再移入1.5mol/LDMSO中，以后的操作程序基本同上。12/16/202280動物繁殖原理與技術(shù)（四）卵母細(xì)胞的冷凍保存12/16/202281動物繁殖原理與技術(shù)哺乳動物的卵母細(xì)胞的冷凍和精子與胚胎的冷凍一樣，具有潛在的應(yīng)用價值。但卵母細(xì)胞的冷凍要比后兩者困難的多，特別是未成熟卵對低溫敏感而不易保存。但人們往往容易獲得未成熟的卵，所以對未成熟卵的冷凍，特別成為研究的熱門話題。12/16/202282動物繁殖原理與技術(shù)（1）常規(guī)冷凍法：1977年Whittingham用慢速冷凍法對小鼠卵母細(xì)胞冷凍保存后進(jìn)行受精，移植后獲得產(chǎn)仔。此后，人們也開展了牛、羊等大家畜卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)的研究。12/16/202283動物繁殖原理與技術(shù)抗凍液與裝管方法將卵母細(xì)胞以TCM-199+5%(V/V)FCS洗2～3次，在冷凍平衡液中(4mg/mlBSA，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，1mol/L甘油，以PBS配制)室溫下20min，裝入冷凍細(xì)管中。其方法是先吸入空氣，再吸入帶有卵母細(xì)胞的冷凍平衡液，最后，再吸入空氣、封口。12/16/202284動物繁殖原理與技術(shù)冷凍程序?qū)⒓?xì)管裝入冷凍儀中，以下列程序冷凍。從20℃開始，以1℃/min下降的速度降到-7℃，植冰后停10min，再以0.3℃/min的下降速度降到-30℃，最后，以0.1℃/min的下降速度，降到-33℃，后投入液氮中保存。解凍方法與胚胎解凍法類似。12/16/202285動物繁殖原理與技術(shù)（2）玻璃化冷凍法將洗后的卵母細(xì)胞，用玻璃化溶液VS1(20.5%W/VDMSO，15.5%W/V乙酰胺，10%W/V丙二醇，6%W/V聚二醇MW8000，pH8.0)，處理5～10min，裝管之后立即投入液氮保存。用時，由液氮中取出，在室溫放5s后，投入37℃的水浴中20s解凍。用含0.5mol/L蔗糖的PBS，在室溫下處理10min，一步脫除平衡保護(hù)劑，用TCM-199+10%FCS洗2次，再進(jìn)行培養(yǎng)、受精和移植。12/16/202286動物繁殖原理與技術(shù)1.細(xì)管法用M2配制6.0mol/LDMSO作為冷凍液(VS)。將小鼠卵母細(xì)胞在20℃的25%VS和65%VS中兩步平衡后，移入0.25ml塑料細(xì)管中的VS，在液氮蒸汽中熏蒸3min后投入液氮冷凍保存。解凍時細(xì)管先進(jìn)行10s空氣浴(20℃)，然后在20℃水浴中升溫10s，解凍后卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率最高為77%，體外受精后培養(yǎng)，2細(xì)胞發(fā)育率為91%，移植妊娠率為79%。12/16/202287動物繁殖原理與技術(shù)2.微滴法塑料細(xì)管導(dǎo)熱性能差，這限制了細(xì)管法的冷凍速度最高只能達(dá)到2000℃/min。提高冷凍速度的最簡單的方法是不用承載物，將冷凍液和胚胎/卵母細(xì)胞直接投入液氮，這便產(chǎn)生了微滴法。12/16/202288動物繁殖原理與技術(shù)微滴法操作過程在微滴法冷凍過程中，胚胎/卵母細(xì)胞在冷凍液中平衡一段時間后，將含有胚胎/卵母細(xì)胞的冷凍液小滴(droplet，體積約為6μ1)直接滴入液氮中，然后將冷凍后的顆粒集中到一小管，置液氮罐中保存。解凍程序十分簡單，只需將冷凍顆粒直接投入一定溫度解凍液中，溶化后進(jìn)行回收和脫毒操作。微滴法用于冷凍小鼠胚胎，后來分別被用于冷凍保存牛胚胎、合子和卵母細(xì)胞，試驗(yàn)結(jié)果表明這種方法的冷凍效率很高。12/16/202289動物繁殖原理與技術(shù)微滴法存在如下缺陷①冷凍液小滴體積大，小滴在下沉之前漂浮在液氮面上，降低了冷凍速度；②沒有承載物，不易進(jìn)行胚胎細(xì)胞特性標(biāo)記；③在往液氮中作小滴時，容易丟失胚胎/卵母細(xì)胞。④冷凍液與液氮的接觸面積大，容易造成污染。12/16/202290動物繁殖原理與技術(shù)3.電子顯微鏡銅網(wǎng)法已知冷凍速度與溶液的體積密切相關(guān)，減少冷凍液的體積能夠顯著提高冷凍降溫速度。基于此，電子顯微鏡銅網(wǎng)法采用小體積冷凍液(小于1μ1)和液氮直接接觸，并以電子顯微鏡銅網(wǎng)作為承載胚胎或卵母細(xì)胞的工具，冷凍速度達(dá)到3000℃/min。12/16/202291動物繁殖原理與技術(shù)操作過程具體操作為胚胎或卵母細(xì)胞在冷凍液中處理一定時間后，將它們和冷凍液移到電子顯微鏡銅網(wǎng)上，然后用鑷子夾住銅網(wǎng)，直接浸入液氮。解凍時，只需將銅網(wǎng)浸沒在一定溫度的解凍液中，再進(jìn)行胚胎或卵母細(xì)胞回收和脫毒。12/16/202292動物繁殖原理與技術(shù)效果用電子顯微鏡銅網(wǎng)法可成功地冷凍保存對低溫非常敏感的果蠅胚胎。用該法冷凍保存牛卵母細(xì)胞，解凍后形態(tài)正常率近60%。體外受精后，卵裂率和囊胚發(fā)育率分別達(dá)到29～32%和10～15%。采用該方法并以-210℃液氮作為冷源，冷凍速度達(dá)24，000℃/min，冷凍的牛卵母細(xì)胞解凍后進(jìn)行體外受精，卵裂率為48%。12/16/202293動物繁殖原理與技術(shù)4.開放式拉長塑料細(xì)管法(OPS法)開放式拉長塑料細(xì)管法(簡稱OPS法)1997成功用于冷凍保存體外受精后3～5d的牛胚胎。OPS由0.25ml細(xì)管拉制成，直徑為0.8mm，管壁厚度為0.07mm。在25～27℃室溫中、39℃恒溫臺上操作。12/16/202294動物繁殖原理與技術(shù)操作方法冷凍時，將OPS的細(xì)小端沒入含有胚胎或卵母細(xì)胞的冷凍液小滴(1～2μl)，利用虹吸效應(yīng)將胚胎或卵母細(xì)胞連同冷凍液裝入OPS，然后直接投入液氮保存。解凍時，只要將OPS細(xì)端浸入一定溫度解凍液，1～2s內(nèi)冷凍液融化，解凍液進(jìn)入細(xì)管中，胚胎或卵母細(xì)胞由于沉降作用離開OPS。12/16/202295動物繁殖原理與技術(shù)特點(diǎn)與效果OPS法的冷凍和解凍速度大于20，000℃/min，是細(xì)管法的10倍，而且胚胎或卵母細(xì)胞與高濃度抗凍保護(hù)劑接觸的時間極短(-180℃以上小于3Os)，極大地降低了冷凍損傷。另外，與細(xì)管法和電子顯微鏡銅網(wǎng)法相比，OPS法冷凍、解凍程序大大簡化，提高了工作效率。用該方法冷凍保存184枚牛卵母細(xì)胞，解凍后體外受精并培養(yǎng)7d，囊胚發(fā)育率達(dá)到25%。將這些囊胚再冷凍解凍后移植給14頭受體母牛，有3頭受體妊娠。12/16/202296動物繁殖原理與技術(shù)玻璃微細(xì)管法(GMP法)以毛細(xì)玻璃管拉制成直徑為0.3mm玻璃微細(xì)管(GMP)作為冷凍承載工具，與OPS法相比較，冷凍保存小鼠囊胚，結(jié)果兩