(10檢本)第七章熒光免疫技術(shù)課件

熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)1教學(xué)目的要求：掌握免疫熒光顯微鏡技術(shù)掌握時間分辨熒光免疫技術(shù)了解熒光免疫測定的臨床應(yīng)用教學(xué)目的要求：掌握免疫熒光顯微鏡技術(shù)21、概述

熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性結(jié)合起來的一種方法，是免疫標(biāo)記技術(shù)中發(fā)展最早的一種檢測方法。

1、概述

熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)3近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一系列新的儀器和技術(shù)問世，使熒光技術(shù)不斷完善，已從原來僅限于檢測固定標(biāo)本，如檢測組織切片或細(xì)胞表面的抗原，擴(kuò)大到進(jìn)行活細(xì)胞分類檢測及多種成分定量檢測。熒光技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于臨床檢測和科學(xué)研究。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一系列新的儀器和技術(shù)問世，使42、技術(shù)分類：⑴熒光抗體技術(shù)(熒光顯微鏡技術(shù))抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。⑵免疫熒光測定技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法2、技術(shù)分類：5第一節(jié)熒光免疫技術(shù)的特點(diǎn)熒光物質(zhì)在吸收激發(fā)光的能量后，使原來處于基態(tài)的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時，激發(fā)態(tài)的電子以發(fā)射光的形式釋放出能量，這種發(fā)射光稱為熒光（fluorescence）。第一節(jié)熒光免疫技術(shù)的特點(diǎn)熒光物質(zhì)在吸收激發(fā)光的能量后，使原6一、熒光的基本知識（一）發(fā)射光譜指固定激發(fā)波長，在不同波長下所記錄到的樣品發(fā)射熒光的相對強(qiáng)度。（二）激發(fā)光譜指固定檢測發(fā)射波長，用不同波長的激發(fā)光激發(fā)樣品所記錄到的相應(yīng)的熒光發(fā)射強(qiáng)度。一、熒光的基本知識（一）發(fā)射光譜指固定激發(fā)波長，在不同波7（三）熒光的效率：熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率熒光效率﹦發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強(qiáng)度）吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強(qiáng)度）吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）8（四）熒光壽命熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度所用的時間。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。（五）熒光的淬滅

熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退成為熒光淬滅。例如紫外線照射、高溫、苯胺、硝基苯、酚、I-等。（四）熒光壽命9（六）熒光偏振（六）熒光偏振10二、熒光物質(zhì)二、熒光物質(zhì)11第二節(jié)熒光抗體的制備一、抗體要求第二節(jié)熒光抗體的制備一、抗體要求12二、熒光素要求二、熒光素要求13三、熒光素標(biāo)記抗體的方法三、熒光素標(biāo)記抗體的方法14四、熒光素標(biāo)記抗體的純化四、熒光素標(biāo)記抗體的純化15五、熒光抗體的鑒定五、熒光抗體的鑒定16六、熒光抗體的保存六、熒光抗體的保存17第三節(jié)免疫熒光顯微技術(shù)免疫熒光顯微技術(shù)的基本原理是：熒光抗體可與標(biāo)本切片中組織或細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮的特異熒光，即可對標(biāo)本中的抗原物質(zhì)進(jìn)行鑒定。第三節(jié)免疫熒光顯微技術(shù)免疫熒光顯微技術(shù)的基本原理是：熒光抗18一、標(biāo)本的制作熒光顯微技術(shù)主要是靠觀察切片標(biāo)本上熒光抗體的染色結(jié)果來對抗原進(jìn)行鑒定和定位。因此，標(biāo)本制作的好壞直接影響到檢測結(jié)果。一、標(biāo)本的制作19常見的臨床標(biāo)本有：組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類，可分別制成切片、印片和涂片。組織切片：冷凍切片、石蠟切片（最常用）印片：肝、脾、淋巴結(jié)等器官或組織

涂片：各種體液、穿刺液、細(xì)菌培養(yǎng)物和細(xì)胞懸液培養(yǎng)細(xì)胞：單層培養(yǎng)細(xì)胞（人喉癌上皮細(xì)胞HEP-2)常見的臨床標(biāo)本有：組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類，可分別制成切片、印20標(biāo)本的固定和保存：固定劑：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等保存：4℃、-20℃標(biāo)本的固定和保存：21二、熒光抗體染色與結(jié)果判斷于已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體置25-37℃

30min或4℃過夜用PBS充分洗滌鏡檢。二、熒光抗體染色與結(jié)果判斷22試驗(yàn)類型

1直接法

2間接法3雙標(biāo)記法兩種熒光素分別標(biāo)記的兩種不同的特異性抗體，與同一標(biāo)本反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察兩種顏色。試驗(yàn)類型

1直接法23返回返回24(10檢本)第七章熒光免疫技術(shù)課件25熒光抗體染色結(jié)果判斷

設(shè)立實(shí)驗(yàn)對照:陽性對照和陰性對照

區(qū)分特異和非特異染色

陽性細(xì)胞顯色分布:胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型

抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(斑點(diǎn)型)抗核抗體(核膜型)熒光抗體染色結(jié)果判斷

設(shè)立實(shí)驗(yàn)對照:陽性對照和陰性對26

“-”：無或僅見極微弱熒光。

“+”：熒光較弱但清楚可見。“++”：熒光明亮。“+++”：耀眼強(qiáng)熒光。特異熒光強(qiáng)度“+”以上判定為陽性，對照光應(yīng)呈“-”或“±”。根據(jù)呈"+"的血清最高稀釋度判定特異性抗體效價。

“-”：無或僅見極微弱熒光。27三、熒光顯微鏡檢查

利用一定波長的激發(fā)光對樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長的熒光，對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測。

經(jīng)熒光抗體染色的標(biāo)本，需要在熒光微鏡下觀察。一般要求染色后立刻鏡檢，以防熒光消褪，造成假陰性結(jié)果。三、熒光顯微鏡檢查利用一定波長的激發(fā)光對樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生28

熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素?zé)魹V光片：隔熱、激發(fā)和吸收濾光片光路：透射光、落射光聚光器：明視野、暗視野和相差熒光聚光器鏡頭：消色差鏡頭熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素?zé)?9隔熱濾光片：阻斷紅外線通過而隔熱。激發(fā)濾光片：位于光源和物鏡之間，能選擇性地透過紫外線可見波長的光域，提供合適的激發(fā)光。

吸收濾光片：位于物鏡和目鏡之間，阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過，保護(hù)眼睛。返回隔熱濾光片：阻斷紅外線通過而隔熱。返回30透射熒光顯微鏡光路(a)落射熒光顯微鏡光路(b)透射光：照明光線從標(biāo)本下經(jīng)聚光器透過標(biāo)本進(jìn)入物鏡。落射光：照明光線從標(biāo)本上經(jīng)垂直照明器落射到標(biāo)本，經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡。透射熒光顯微鏡光路(a)31基本原理：將抗原抗體反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，用熒光檢測儀檢測抗原抗體復(fù)合物中特異性熒光強(qiáng)度，對液體標(biāo)本中微量或超微量物質(zhì)進(jìn)行定量測定。第四節(jié)熒光免疫分析基本原理：將抗原抗體反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，用熒光檢測32熒光免疫測定的方法類型非均相熒光免疫測定：

時間分辨熒光免疫測定、熒光酶免疫測定均相熒光免疫測定：

熒光偏振免疫測定熒光免疫測定的方法類型非均相熒光免疫測定：33時間分辨熒光免疫測定(TR-FIA)基本原理：是用鑭系稀土元素螯合物（如Eu3+）標(biāo)記抗體或抗原，檢測標(biāo)本中的抗原或抗體。此螯合物具有較長熒光壽命，得用時間分辨熒光分析儀延緩測量時間，可排除標(biāo)本中非特異性熒光的干擾，所得信號完全是稀土元素螯合物發(fā)射的特異熒光。時間分辨熒光免疫測定(TR-FIA)34時間分辨檢測原理示意圖自發(fā)熒光壽命短:1ns～10ns鑭系元素壽命長:10μs～1000μs短壽命熒光完全衰變后再測定鑭系元素特異熒光時間分辨檢測原理示意圖自發(fā)熒光壽命短:1ns～10ns35時間分辨熒光免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖時間分辨熒光免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖36方法評價和臨床應(yīng)用靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L標(biāo)記物穩(wěn)定：有效使用期長測量快速，易自動化易受污染，本底增高因此,是很有發(fā)展前途的超微量物質(zhì)免疫分析技術(shù)。方法評價和臨床應(yīng)用靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L37第五節(jié)熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用

熒光抗體技術(shù)在臨床上可用作腫瘤細(xì)胞的診斷；細(xì)菌、病毒和寄生蟲的檢驗(yàn)及自身免疫病的協(xié)助診斷等方面。第五節(jié)熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用38一、熒光顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用一、熒光顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用39(10檢本)第七章熒光免疫技術(shù)課件40(10檢本)第七章熒光免疫技術(shù)課件41(10檢本)第七章熒光免疫技術(shù)課件42二、熒光免疫測定的應(yīng)用二、熒光免疫測定的應(yīng)用43思考題1．熒光、熒光效率、熒光壽命和熒光淬滅的概念是什么？2．常用的熒光物質(zhì)有哪些？3．熒光免疫技術(shù)有哪些類型？4．熒光抗體技術(shù)的基本原理是什么？3．什么是熒光抗體？如何制備、純化和鑒定熒光抗體？4．熒光抗體染色有哪些方法？各自的反應(yīng)原理是什么？5．熒光免疫測定的基本原理是什么？有哪些方法類型?思考題1．熒光、熒光效率、熒光壽命和熒光淬滅的概念是什么？44課堂練習(xí)1、用于標(biāo)記熒光抗體的熒光素應(yīng)符合下列要求，除外A與蛋白質(zhì)分子形成離子鍵B熒光效率高，與蛋白結(jié)合后仍能保持較高的熒光效率C熒光色澤與背景組織色澤對比鮮明D與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化和免疫學(xué)性質(zhì)E標(biāo)記方法簡單，安全無毒（A）課堂練習(xí)1、用于標(biāo)記熒光抗體的熒光素應(yīng)符合下列要求，除外452、熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)中，與普通光學(xué)顯微鏡相同的是A光源B濾板C聚光器D目鏡E物鏡（D）2、熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)中，與普通光學(xué)顯微鏡相同的是463、不能作為熒光顯微鏡光源的是A高壓汞燈B氚燈C紫外燈D氙燈E鹵素?zé)簦–）3、不能作為熒光顯微鏡光源的是474、熒光抗體染色技術(shù)中，特異性最高，非特異性染色最低的方法是A直接法B間接法C補(bǔ)體結(jié)合法D雙標(biāo)記法E以上都不對(A)4、熒光抗體染色技術(shù)中，特異性最高，非特異性染色最低的方法是485、目前公認(rèn)的最有效的檢測抗核抗體的方法是AELISAB放射免疫技術(shù)C直接凝集實(shí)驗(yàn)D直接熒光法E間接熒光法(E)5、目前公認(rèn)的最有效的檢測抗核抗體的方法是496、FITC在紫外光的激發(fā)下，所產(chǎn)生的熒光為A灰藍(lán)色B黃綠色C橙色D暗紅色E橙紅色（B）6、FITC在紫外光的激發(fā)下，所產(chǎn)生的熒光為507、雙標(biāo)記熒光抗體技術(shù)的主要用途是A提高熒光強(qiáng)度B提高熒光效率C可同時檢測同一標(biāo)本中兩種抗原D使用一種標(biāo)記物可檢測多種抗原E減少非特異性熒光（C）7、雙標(biāo)記熒光抗體技術(shù)的主要用途是518、時間分辨熒光免疫測定特點(diǎn)中不包括A標(biāo)記物熒光衰變時間長B測定范圍狹窄C標(biāo)記物為鑭系元素D能排除非特異性熒光的干擾E熒光強(qiáng)，靈敏度高（B）8、時間分辨熒光免疫測定特點(diǎn)中不包括529、下列有關(guān)時間分辨熒光免疫測定的敘述中，錯誤的是A以鑭系螯合物作為標(biāo)記物B鑭系螯合物具有超短熒光壽命的特點(diǎn)C可以有效的消除非特異性自然本底熒光的干擾D增強(qiáng)液的主要成分是B-二酮苯E靈敏度較普通熒光抗體技術(shù)高（B）9、下列有關(guān)時間分辨熒光免疫測定的敘述中，錯誤的是5310、時間分辨熒光免疫測定所用的熒光標(biāo)記物為AFITCBRB200CTRITCD鑭系元素螯合物E4-甲基傘型酮（D）10、時間分辨熒光免疫測定所用的熒光標(biāo)記物為54謝謝！??！謝謝！??！55熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)56教學(xué)目的要求：掌握免疫熒光顯微鏡技術(shù)掌握時間分辨熒光免疫技術(shù)了解熒光免疫測定的臨床應(yīng)用教學(xué)目的要求：掌握免疫熒光顯微鏡技術(shù)571、概述

熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性結(jié)合起來的一種方法，是免疫標(biāo)記技術(shù)中發(fā)展最早的一種檢測方法。

1、概述

熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)58近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一系列新的儀器和技術(shù)問世，使熒光技術(shù)不斷完善，已從原來僅限于檢測固定標(biāo)本，如檢測組織切片或細(xì)胞表面的抗原，擴(kuò)大到進(jìn)行活細(xì)胞分類檢測及多種成分定量檢測。熒光技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于臨床檢測和科學(xué)研究。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一系列新的儀器和技術(shù)問世，使592、技術(shù)分類：⑴熒光抗體技術(shù)(熒光顯微鏡技術(shù))抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。⑵免疫熒光測定技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法2、技術(shù)分類：60第一節(jié)熒光免疫技術(shù)的特點(diǎn)熒光物質(zhì)在吸收激發(fā)光的能量后，使原來處于基態(tài)的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時，激發(fā)態(tài)的電子以發(fā)射光的形式釋放出能量，這種發(fā)射光稱為熒光（fluorescence）。第一節(jié)熒光免疫技術(shù)的特點(diǎn)熒光物質(zhì)在吸收激發(fā)光的能量后，使原61一、熒光的基本知識（一）發(fā)射光譜指固定激發(fā)波長，在不同波長下所記錄到的樣品發(fā)射熒光的相對強(qiáng)度。（二）激發(fā)光譜指固定檢測發(fā)射波長，用不同波長的激發(fā)光激發(fā)樣品所記錄到的相應(yīng)的熒光發(fā)射強(qiáng)度。一、熒光的基本知識（一）發(fā)射光譜指固定激發(fā)波長，在不同波62（三）熒光的效率：熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率熒光效率﹦發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強(qiáng)度）吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強(qiáng)度）吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）63（四）熒光壽命熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度所用的時間。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。（五）熒光的淬滅

熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退成為熒光淬滅。例如紫外線照射、高溫、苯胺、硝基苯、酚、I-等。（四）熒光壽命64（六）熒光偏振（六）熒光偏振65二、熒光物質(zhì)二、熒光物質(zhì)66第二節(jié)熒光抗體的制備一、抗體要求第二節(jié)熒光抗體的制備一、抗體要求67二、熒光素要求二、熒光素要求68三、熒光素標(biāo)記抗體的方法三、熒光素標(biāo)記抗體的方法69四、熒光素標(biāo)記抗體的純化四、熒光素標(biāo)記抗體的純化70五、熒光抗體的鑒定五、熒光抗體的鑒定71六、熒光抗體的保存六、熒光抗體的保存72第三節(jié)免疫熒光顯微技術(shù)免疫熒光顯微技術(shù)的基本原理是：熒光抗體可與標(biāo)本切片中組織或細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮的特異熒光，即可對標(biāo)本中的抗原物質(zhì)進(jìn)行鑒定。第三節(jié)免疫熒光顯微技術(shù)免疫熒光顯微技術(shù)的基本原理是：熒光抗73一、標(biāo)本的制作熒光顯微技術(shù)主要是靠觀察切片標(biāo)本上熒光抗體的染色結(jié)果來對抗原進(jìn)行鑒定和定位。因此，標(biāo)本制作的好壞直接影響到檢測結(jié)果。一、標(biāo)本的制作74常見的臨床標(biāo)本有：組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類，可分別制成切片、印片和涂片。組織切片：冷凍切片、石蠟切片（最常用）印片：肝、脾、淋巴結(jié)等器官或組織

涂片：各種體液、穿刺液、細(xì)菌培養(yǎng)物和細(xì)胞懸液培養(yǎng)細(xì)胞：單層培養(yǎng)細(xì)胞（人喉癌上皮細(xì)胞HEP-2)常見的臨床標(biāo)本有：組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類，可分別制成切片、印75標(biāo)本的固定和保存：固定劑：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等保存：4℃、-20℃標(biāo)本的固定和保存：76二、熒光抗體染色與結(jié)果判斷于已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體置25-37℃

30min或4℃過夜用PBS充分洗滌鏡檢。二、熒光抗體染色與結(jié)果判斷77試驗(yàn)類型

1直接法

2間接法3雙標(biāo)記法兩種熒光素分別標(biāo)記的兩種不同的特異性抗體，與同一標(biāo)本反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察兩種顏色。試驗(yàn)類型

1直接法78返回返回79(10檢本)第七章熒光免疫技術(shù)課件80熒光抗體染色結(jié)果判斷

設(shè)立實(shí)驗(yàn)對照:陽性對照和陰性對照

區(qū)分特異和非特異染色

陽性細(xì)胞顯色分布:胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型

抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(斑點(diǎn)型)抗核抗體(核膜型)熒光抗體染色結(jié)果判斷

設(shè)立實(shí)驗(yàn)對照:陽性對照和陰性對81

“-”：無或僅見極微弱熒光。

“+”：熒光較弱但清楚可見?！?+”：熒光明亮?！?++”：耀眼強(qiáng)熒光。特異熒光強(qiáng)度“+”以上判定為陽性，對照光應(yīng)呈“-”或“±”。根據(jù)呈"+"的血清最高稀釋度判定特異性抗體效價。

“-”：無或僅見極微弱熒光。82三、熒光顯微鏡檢查

利用一定波長的激發(fā)光對樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長的熒光，對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測。

經(jīng)熒光抗體染色的標(biāo)本，需要在熒光微鏡下觀察。一般要求染色后立刻鏡檢，以防熒光消褪，造成假陰性結(jié)果。三、熒光顯微鏡檢查利用一定波長的激發(fā)光對樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生83

熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素?zé)魹V光片：隔熱、激發(fā)和吸收濾光片光路：透射光、落射光聚光器：明視野、暗視野和相差熒光聚光器鏡頭：消色差鏡頭熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素?zé)?4隔熱濾光片：阻斷紅外線通過而隔熱。激發(fā)濾光片：位于光源和物鏡之間，能選擇性地透過紫外線可見波長的光域，提供合適的激發(fā)光。

吸收濾光片：位于物鏡和目鏡之間，阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過，保護(hù)眼睛。返回隔熱濾光片：阻斷紅外線通過而隔熱。返回85透射熒光顯微鏡光路(a)落射熒光顯微鏡光路(b)透射光：照明光線從標(biāo)本下經(jīng)聚光器透過標(biāo)本進(jìn)入物鏡。落射光：照明光線從標(biāo)本上經(jīng)垂直照明器落射到標(biāo)本，經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡。透射熒光顯微鏡光路(a)86基本原理：將抗原抗體反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，用熒光檢測儀檢測抗原抗體復(fù)合物中特異性熒光強(qiáng)度，對液體標(biāo)本中微量或超微量物質(zhì)進(jìn)行定量測定。第四節(jié)熒光免疫分析基本原理：將抗原抗體反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，用熒光檢測87熒光免疫測定的方法類型非均相熒光免疫測定：

時間分辨熒光免疫測定、熒光酶免疫測定均相熒光免疫測定：

熒光偏振免疫測定熒光免疫測定的方法類型非均相熒光免疫測定：88時間分辨熒光免疫測定(TR-FIA)基本原理：是用鑭系稀土元素螯合物（如Eu3+）標(biāo)記抗體或抗原，檢測標(biāo)本中的抗原或抗體。此螯合物具有較長熒光壽命，得用時間分辨熒光分析儀延緩測量時間，可排除標(biāo)本中非特異性熒光的干擾，所得信號完全是稀土元素螯合物發(fā)射的特異熒光。時間分辨熒光免疫測定(TR-FIA)89時間分辨檢測原理示意圖自發(fā)熒光壽命短:1ns～10ns鑭系元素壽命長:10μs～1000μs短壽命熒光完全衰變后再測定鑭系元素特異熒光時間分辨檢測原理示意圖自發(fā)熒光壽命短:1ns～10ns90時間分辨熒光免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖時間分辨熒光免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖91方法評價和臨床應(yīng)用靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L標(biāo)記物穩(wěn)定：有效使用期長測量快速，易自動化易受污染，本底增高因此,是很有發(fā)展前途的超微量物質(zhì)免疫分析技術(shù)。方法評價和臨床應(yīng)用靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L92第五節(jié)熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用

熒光抗體技術(shù)在臨床上可用作腫瘤細(xì)胞的診斷；細(xì)菌、病毒和寄生蟲的檢驗(yàn)及自身免疫病的協(xié)助診斷等方面。第五節(jié)熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用93一、熒光顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用一、熒光顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用94(10檢本)第七章熒光免疫技術(shù)課件95(10檢本)第七章熒光免疫技術(shù)課件96(10檢本)第七章熒光免疫技術(shù)課件97二、熒光免疫測定的應(yīng)用二、熒光免疫測定的應(yīng)用98思考題1．熒光、熒光效率、熒光壽命和熒光淬滅的概念是什么？2．常用的熒光物質(zhì)有哪些？3．熒光免疫技術(shù)有哪些類型？4．熒光抗體技術(shù)的基本原理是什么？3．什么是熒光抗體？如何制備、純化和鑒定熒光抗體？4．熒光抗體染色有哪些方法？各自的反應(yīng)原理是什么？5．熒光免疫測定的基本原理是什么？有哪些方法類型?思考題1．熒光、熒光效率、熒光壽命和熒光淬滅的概念是什么？99課堂練習(xí)1、用于標(biāo)記熒光抗體的熒光素應(yīng)符合下列要求，除外A與蛋白質(zhì)分子形成離子鍵B熒光效率高，與蛋白結(jié)合后仍能保持較高的熒光效率C熒光色澤與背景組織色澤對比鮮明D與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化和免疫學(xué)性質(zhì)