第五章-環(huán)境污染物的一般毒性及其評價方法-課件

第五章環(huán)境污染物的一般毒性及其評價

主講教師：劉薇大連理工大學(xué)環(huán)境學(xué)院生態(tài)毒理學(xué)

(Ecotoxicology)第五章環(huán)境污染物的一般毒性及其評價

主講教師：劉薇生態(tài)一般毒性和特殊毒性一般毒性特殊毒性急性毒性亞慢性毒性和慢性毒性蓄積毒性局部毒性致癌性致突變作用生殖和發(fā)育毒性一般毒性和特殊毒性一般毒性特殊毒性急性毒性致癌性5.1毒性評價的實驗基礎(chǔ)

流行病學(xué)資料和臨床觀察，可以獲得環(huán)境污染物對人類健康的危害。毒理學(xué)實驗為闡明毒性特點、毒作用機制、劑量-反應(yīng)關(guān)系，預(yù)測對人類健康的潛在危害一般規(guī)律，為制訂衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。一般毒性實驗急性毒性實驗亞慢性和慢性毒性實驗

蓄積實驗

5.1毒性評價的實驗基礎(chǔ)流行病學(xué)資料和臨床觀察，可毒理學(xué)試驗?zāi)康?.闡明受試物毒性表現(xiàn)和性質(zhì)2.闡明毒性作用的劑量-反應(yīng)(效應(yīng))3.確定毒作用的靶器官4.闡明毒性機制5.確定損害的可逆性

5.1毒性評價的實驗基礎(chǔ)毒理學(xué)試驗?zāi)康?.闡明受試物毒性表現(xiàn)和性質(zhì)5.1毒性評價一.實驗動物的選擇1.實驗動物(laboratoryanimal)

經(jīng)人工培育，對其攜帶微生物實行控制，遺傳背景明確，來源清楚，可用于科學(xué)研究的動物。Wistar

大鼠豚鼠5.1毒性評價的實驗基礎(chǔ)一.實驗動物的選擇1.實驗動物(laboratoryan2.選擇實驗動物的基本原則1.毒性反應(yīng)及代謝特點與人類相近2.自然壽命適宜3.易于飼養(yǎng)和實驗操作4.經(jīng)濟并易于獲得5.對受試物敏感一.實驗動物的選擇2.選擇實驗動物的基本原則1.毒性反應(yīng)及代謝特點與人類相近一3.毒理學(xué)實驗常用動物主要品系(strain）(1)

近交系動物

采用連續(xù)20代以上兄妹間交配或親子交配而培育的純品系動物。津白、津白165，BALB/C，C3HC57B/6J小鼠等。BALB/cA津白一.實驗動物的選擇3.毒理學(xué)實驗常用動物主要品系(strain）(1)近交系(2)

突變系動物

動物在生長繁殖過程中，通過自然突變或人工定向突變的辦法，使其某個基因發(fā)生突變，并喪失了原有的正常功能。這種突變的基因可以世代相傳并保持遺傳基因特性的品系動物。無胸腺裸鼠一.實驗動物的選擇(2)突變系動物動物在生長繁殖過程中，通過自然突變

兩個不同近交系之間有目的進行交配，所產(chǎn)生的雜交第一代動物。(3)

雜交群動物

5年以上不從外部引進新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所保存繁殖的動物群。

昆明種小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、Wistar大鼠、SD大鼠、青紫藍兔、新西蘭兔等。(4)

封閉群動物一.實驗動物的選擇兩個不同近交系之間有目的進行交配，所產(chǎn)生的雜交第一代4.微生物控制級別(1)

無菌動物

體內(nèi)外均無任何微生物和寄生蟲的動物。(2)無特定病原體動物（SPF）

體內(nèi)無特定的微生物和寄生蟲存在的動物。容許攜帶非特定微生物，但不能攜帶傳染性病原菌。(3)清潔動物

最低限度疾病動物。動物體內(nèi)外不攜帶人畜共患的病原體或動物傳染病病原體。抗體檢查常發(fā)現(xiàn)腦脊髓質(zhì)炎病毒、鼠肝炎病毒等抗體。但不應(yīng)有臨床癥狀、病理改變及自然死亡。飼養(yǎng)在半屏蔽系統(tǒng)。一.實驗動物的選擇4.微生物控制級別(1)無菌動物一.實驗動物的選擇1.年齡2.性別3.生理狀態(tài)4.健康狀況

5.個體選擇要求一.實驗動物的選擇1.年齡5.個體選擇要求一.實驗動物的選擇可根據(jù)人類實際接觸方式和受試物的理化性質(zhì)等因素，選擇合適的染毒方式。1.經(jīng)口染毒灌胃，喂飼，膠囊2.經(jīng)呼吸道染毒靜式吸入染毒，動式吸入染毒3.經(jīng)皮染毒4.皮下、靜脈注射和腹腔內(nèi)注射

5.其他

二.常用染毒方式可根據(jù)人類實際接觸方式和受試物的理化性質(zhì)等因素，選擇合適的染三.毒理學(xué)試驗中的常用對照組1.未處理對照組(空白對照組)

本底值，質(zhì)量控制2.陰性(溶劑／賦形劑)對照

與染毒組比較的基礎(chǔ)

3.陽性對照

檢測試驗體系的有效性和準(zhǔn)確性4.歷史性對照檢查試驗體系的穩(wěn)定性，即進行實驗室質(zhì)量控制和保證

三.毒理學(xué)試驗中的常用對照組1.未處理對照組(空白對照組)四.受試樣品要求

用同一種、同一批號受試物受試物成分和配方必須固定如存在異構(gòu)體混合物，則要求異構(gòu)體比例必須固定

活性成分的含量和雜質(zhì)的濃度應(yīng)固定受試物保質(zhì)期內(nèi)不發(fā)生分解，摻入到飼料惑溶液中也要求穩(wěn)定四.受試樣品要求用同一種、同一批號受試物五.實驗結(jié)果的判斷1.實驗組與對照組比較有無顯著性差異2.劑量-反應(yīng)關(guān)系和劑量-效應(yīng)關(guān)系3.其他相關(guān)參數(shù)的改變4.是否在“正?！敝捣秶?/p>

五.實驗結(jié)果的判斷1.實驗組與對照組比較有無顯著性差異一.急性毒性

急性毒性(acutetoxicity)指機體一次接觸或在24小時內(nèi)多次接觸化學(xué)物后，短期內(nèi)引起的毒效應(yīng)。死亡行為生理生化指標(biāo)的異常變化

病理學(xué)改變5.1急性毒性及其評價一.急性毒性急性毒性(acutetoxicity)指機急性毒性實驗?zāi)康?/p>

1.致死劑量、急性閾劑量、初步估計對人類毒害的危險性。

2.闡明急性毒性強度、特征、可能的靶器官、致死原因和劑量－反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系。

3.體內(nèi)生物轉(zhuǎn)運和轉(zhuǎn)化，及其動力學(xué)變化。

4.為設(shè)定蓄積性、亞慢性、慢性毒性實驗的染毒劑量、觀察指標(biāo)提供參考依據(jù)。一.急性毒性急性毒性實驗?zāi)康?.致死劑量、急性閾劑量、初步估計對人類急性毒性參數(shù)1.絕對致死劑量或濃度(LDl00/LC100)

2.最小致死劑量或濃度(MLD/MLC)

3.最大耐受劑量或濃度(MTD、LD0/MTC、LC0)

4.半數(shù)致死劑量或濃度(LD50/LC50)

5.急性毒性LOAEL6.急性毒性NOAEL7.急性毒作用帶(Zac)

一.急性毒性急性毒性參數(shù)1.絕對致死劑量或濃度(LDl00/LC10二.急性毒性實驗的動物選擇

健康成年動物未曾交配或受孕

大鼠(180240g)小鼠(1825g)

家兔(22.5kg)貓(1.52.0kg)氣態(tài)毒物的粘膜刺激—貓皮膚的局部刺激作用—豚鼠，家兔過敏反應(yīng)—豚鼠、家兔、狗、小鼠、貓嘔吐反應(yīng)—狗、貓哺乳動物二.急性毒性實驗的動物選擇健康成年動物未曾交配或受孕氣三.急性毒性實驗染毒方式1.經(jīng)口(胃腸道)接觸

(1)一次灌胃體積小鼠0.10.5ml/10g體重大鼠0.51.0ml/100g體重

(2)吞咽膠囊家兔及貓、狗等大動物

實驗動物染毒前應(yīng)禁食，染毒后也應(yīng)繼續(xù)禁食34小時。三.急性毒性實驗染毒方式1.經(jīng)口(胃腸道)接觸實驗動2.經(jīng)呼吸道接觸

常溫、常壓下為氣態(tài)，或以蒸氣態(tài)、氣溶膠、煙、塵狀態(tài)污染生產(chǎn)環(huán)境與生活環(huán)境空氣。①靜式染毒②動式染毒3.經(jīng)皮膚接觸

應(yīng)當(dāng)盡量選擇皮膚解剖、生理與人類較近似的動物為對象。家兔和豚鼠為首選，也可用大鼠代替。

三.急性毒性實驗染毒方式2.經(jīng)呼吸道接觸常溫、常壓下為氣態(tài)，或以3.經(jīng)皮膚接觸四.半數(shù)致死量測定程序1實驗動物

性成熟、健康，雌雄各半2化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和毒性參考資料

3預(yù)試驗

求出全活、全死劑量

4正式實驗在求出全活、全死劑量之間設(shè)5~6個實驗組組距1.2~1.5倍小鼠、大鼠10只/組、家兔46只/組如化合物毒性有性別差異，則應(yīng)分別計算雌、雄性動物各自的LD50(LC50)。四.半數(shù)致死量測定程序1實驗動物性成熟、健康，雌雄各觀察持續(xù)時間和飼養(yǎng)條件

觀察期一般為14天內(nèi)的總死亡數(shù)。速死性毒物求其LD50(LC50)，應(yīng)計算24小時的死亡率。

LD50值的表示應(yīng)注明染毒途徑和觀察時間，以便于在進行毒性比較時有可比性。在觀察期間，應(yīng)保障實驗動物有完全的膳食、充足的飲水及適宜的溫濕度環(huán)境，以防止動物出現(xiàn)非中毒性死亡。四.半數(shù)致死量測定程序觀察持續(xù)時間和飼養(yǎng)條件觀察期一般為14天內(nèi)的總死亡數(shù)。中毒癥狀觀察

應(yīng)詳細(xì)地觀察記錄動物的中毒癥狀、發(fā)生和發(fā)展過程及規(guī)律，死亡前癥狀特點、死亡時間等。很多毒物初期往往初期先出現(xiàn)興奮或抑制現(xiàn)象。應(yīng)注意體重變化。粘膜刺激癥狀，如出汗、流涎，甚至有血性分泌物，瞳孔改變等。四.半數(shù)致死量測定程序中毒癥狀觀察應(yīng)詳細(xì)地觀察記錄動物的中毒癥狀、發(fā)生和發(fā)病理學(xué)檢查和其它指標(biāo)觀察

在觀察期間中毒死亡動物應(yīng)及時解剖，檢查器官有無充血、出血、水腫或其它改變，并對有變化的臟器作病理組織學(xué)檢查。對存活動物在觀察期結(jié)束時，應(yīng)做全部動物解剖，逐一進行病理學(xué)檢查。四.半數(shù)致死量測定程序病理學(xué)檢查和其它指標(biāo)觀察在觀察期間中毒死亡動物應(yīng)及時計算LD50和LD5095%可信限1.霍恩式法2.簡化寇式法3.直接回歸法四.半數(shù)致死量測定程序計算LD50和LD5095%可信限1.霍恩式法四.半數(shù)致五.急性毒性分級單位：mg/kgWHO化學(xué)品毒性分級劇毒<1高毒 1~中等毒50~低毒 500~實際無毒5000~極毒<1劇毒 1~50中等毒51~500低毒 501~5000實際無毒5001~15000無毒 >15000

中國衛(wèi)生部根據(jù)大鼠一次經(jīng)口LD50的急性毒性分級五.急性毒性分級單位：mg/kgWHO化學(xué)品毒性分級劇毒急性毒性閾劑量(濃度)

一次染毒引起某種毒性反應(yīng)的最小劑量，屬于非致死性指標(biāo)。未知毒性污染物：可選擇綜合性、非特異性指標(biāo)。如體重，活動能力，應(yīng)激狀態(tài)、條件反射等。已知毒性比較了解的可選擇最敏感的指標(biāo)刺激性氣體或蒸汽：可選擇眼睛和嗅覺刺激閾濃度。觀察指標(biāo)的選擇急性毒性閾劑量(濃度)一次染毒引起某種毒性反應(yīng)的最小劑量，急性毒性試驗的局限性1.消耗的動物量大2.獲得的信息有限3.測得的LD50僅僅是一個近似值4.在安全性評價中僅評價動物死亡和簡單的癥狀觀察是不夠的，更需要的是生理學(xué)、血液學(xué)及其它化驗檢查所提供的深入細(xì)致的毒性信息。急性毒性試驗的局限性1.消耗的動物量大急性毒性閾劑量實驗方法游泳實驗

反映體力和活動能力刺激閾實驗

反映對上呼吸道、眼睛和口腔等粘膜的刺激作用貓置于染毒柜內(nèi)，加入受試物，觀察癥狀30min癥狀：流淚、流締、噴嚏、嗆咳、流涎等50%實驗動物出現(xiàn)癥狀的最小濃度—刺激閾濃度水槽水溫20℃

動物放入水中，記錄從放入到沉沒5秒所需要的時間記錄游泳速度和游泳姿勢

急性毒性閾劑量實驗方法游泳實驗反映體力和活動能力刺激閾實一.慢性毒性和亞慢性毒性

在日常生活環(huán)境中，人類接觸環(huán)境污染物的濃度遠(yuǎn)低于急性致死濃度，但接觸的時間則較長。為了評價在較長的一段時間內(nèi)反復(fù)接觸低濃度環(huán)境污染物的毒性作用，獲得接近于人類實際接觸條件下的毒性資料，需進行亞慢性或慢性毒性試驗。5.2

環(huán)境污染物的亞慢性、慢性毒性及其評價一.慢性毒性和亞慢性毒性在日常生活環(huán)境中，人類接觸環(huán)亞慢性毒性(subchronictoxicity)

在一段時間內(nèi)（1~3個月）連續(xù)攝入、較大劑量環(huán)境污染物引起的毒性效應(yīng)。慢性毒性(chronictoxicity)

長期連續(xù)、低劑量攝入環(huán)境污染物（6個月~終生）引起的毒性效應(yīng)。5.2

環(huán)境污染物的亞慢性、慢性毒性及其評價亞慢性毒性(subchronictoxicity)慢性毒性二.亞慢性毒性及評價方法1.在急性毒性試驗的基礎(chǔ)上，在較短時間內(nèi)了解受試物對機體長期作用時的主要毒性性質(zhì)和特點、靶器官和最大耐受劑量2.探討敏感指標(biāo)及其劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系3.為慢性毒性試驗設(shè)計提供依據(jù)。亞慢性毒性評價目的二.亞慢性毒性及評價方法1.在急性毒性試驗的基礎(chǔ)上，在較短實驗動物和分組

大鼠或小鼠健康，幼齡每組10~20只雌雄各半染毒途徑染毒劑量和實驗期限1.1/20~1/5LD50范圍內(nèi)設(shè)三個劑量組，設(shè)對照組2.無蓄積作用，排泄快的毒物還可適當(dāng)加大劑量3.低劑量組動物不會產(chǎn)生可觀察到的毒性反應(yīng)4.高劑量組動物出現(xiàn)明顯的中毒反應(yīng)，但不引起動物死亡（或10%）5.1~3個月與人類實際接觸的方式和途徑相同亞慢性毒性試驗二.亞慢性毒性及評價方法實驗動物和分組染毒途徑染毒劑量和實驗期限1.1/20~1/亞慢性毒性實驗觀察指標(biāo)1一般性指標(biāo)

體重、食物利用率、活動能力等指標(biāo)2特異指標(biāo)

特異性反應(yīng),能更確切地闡明受試物引起的有害影響的閾劑量及最大無作用劑量。應(yīng)盡量選用特異指標(biāo)。3血液學(xué)及生化學(xué)指標(biāo)

血常規(guī)，骨髓細(xì)胞成分、血清和尿液生化學(xué)檢查

4有害物質(zhì)在體內(nèi)的分布、代謝及排泄指標(biāo)

5病理組織學(xué)檢查

死亡的動物應(yīng)作病理檢查。實驗結(jié)束時，全部動物進行剖檢，測定臟器系數(shù)，應(yīng)特別注意靶器官的變化。

肝、腎等組織應(yīng)列為常規(guī)檢查項目。二.亞慢性毒性及評價方法亞慢性毒性實驗觀察指標(biāo)1一般性指標(biāo)二.亞慢性毒性及評價試驗結(jié)果評價1

確定毒性作用

闡明亞慢性毒性的性質(zhì)、特點、毒效應(yīng)類型、作用強度和靶器官。2確定毒性作用的敏感指標(biāo)3

中毒閾劑量和最大無作用劑量二.亞慢性毒性及評價方法試驗結(jié)果評價1確定毒性作用二.亞慢性毒性及評價方法慢性毒性實驗的目的

本實驗?zāi)康氖窃u價環(huán)境污染物在長期、小劑量、反復(fù)作用條件下，對機體產(chǎn)生的損害及其特點，確定其慢性毒性閾劑量和最大無作用劑量，為制訂環(huán)境中有害物質(zhì)的最高容許濃度(MAC)和人類每日容許攝入量(ADI)提供科學(xué)依據(jù)。三.慢性毒性及評價方法慢性毒性實驗的目的本實驗?zāi)康氖窃u價環(huán)境污染物在長期、慢性毒性試驗設(shè)計初斷乳的大鼠或小鼠。每組20~40只，雌雄各半。設(shè)3~4個實驗組和一個對照組。實驗動物和分組染毒劑量和實驗期限對照組溶劑對照低劑量組1/100

亞慢性毒性閾劑量不出現(xiàn)中毒反應(yīng)無作用劑量組NOAEL中劑量組1/10

可出現(xiàn)輕微的毒效應(yīng)LOAEL高劑量組1/5

出現(xiàn)明顯的毒效應(yīng)甚至亞致死狀態(tài)實驗期間6~終生實驗結(jié)束后可停止染毒觀察恢復(fù)狀況染毒方式和觀察指標(biāo)

選擇原則同亞慢性試驗，盡量選擇在亞慢性試驗中觀察到的特異和敏感指標(biāo)。三.慢性毒性及評價方法慢性毒性試驗設(shè)計初斷乳的大鼠或小鼠。每組20~40只，雌雄各慢性毒性實驗注意事項

1

控制實驗條件

排除干擾因素對實驗結(jié)果的影響

2

試驗前應(yīng)對觀察指標(biāo)，尤其是血、尿常規(guī)及重點測定的生化指標(biāo)進行正常值測定，篩除個體差異過大的動物

3

染毒期間進行動態(tài)觀察的各項指標(biāo)，應(yīng)與對照組同步測定

4各化驗測定方法應(yīng)精確、可靠、需要進行質(zhì)量控制。

5

應(yīng)重視病理組織學(xué)的檢查。凡試驗期間死亡的動物，都應(yīng)做病理組織學(xué)檢查。三.慢性毒性及評價方法慢性毒性實驗注意事項1控制實驗條件三.慢性毒性及評價方慢性毒性實驗結(jié)果評價

1觀察指標(biāo)與對照組比較，是否超出正常值范圍，是否具有顯著性差異和劑量-效應(yīng)(反應(yīng))關(guān)系

2根據(jù)實驗期間和恢復(fù)期的觀察和檢測結(jié)果，進行全面的綜合分析。結(jié)合受試物的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性，應(yīng)用生物學(xué)和醫(yī)學(xué)理論，闡明慢性毒性的性質(zhì)、特點、毒作用類型、靶器官和中毒機理。

3確定敏感指標(biāo)的慢性毒性閾劑量(LOAEL)和最大無作用劑量(NOAEL)。三.慢性毒性及評價方法慢性毒性實驗結(jié)果評價1觀察指標(biāo)與對照組比較，是否超出正5.3

蓄積毒性

連續(xù)多次攝入的環(huán)境毒物總量（或速度），大于代謝和排泄速度時，毒物或其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)逐漸增加并貯留現(xiàn)象叫做毒物的蓄積作用(Accumulation)。蓄積作用功能蓄積FunctionalAccumulation物質(zhì)蓄積MaterialAccumulation5.3蓄積毒性連續(xù)多次攝入的環(huán)境毒物總量（或速度）蓄積毒性評價方法蓄積系數(shù)法K=LD50(n)LD50(1)<1高度蓄積1~明顯蓄積3~中等蓄積5~輕度蓄積≥5蓄積性固定劑量法1.先測定一次經(jīng)口LD502.每日固定劑量(1/20~1/5LD50）選定一個劑量，固定時間和相同途經(jīng)連續(xù)染毒，至一半實驗動物死亡。3.如果累積劑量達到5個LD50，即使未引起一半動物死亡，也可以終止試驗。蓄積毒性評價方法蓄積系數(shù)法K=LD50(n)<1高度蓄積劑量遞增法染毒天數(shù)累積劑量（LD50）0.400.600.901.362.003.004.484天內(nèi)染毒總量（LD50）

0.10.150.220.340.500.751.12每日染毒劑量（LD50/kg/day）1~45~89~1213~1617~2021~2425~280.401.001.903.265.268.2612.74固定劑量的20天蓄積實驗陰性對照實驗組：1/20LD50,1/10LD50,1/5LD50,1/2LD50結(jié)果判定：

1.各實驗組均無死亡，無蓄積性2.1/20LD50組，有死亡，其他組無死亡，弱蓄積性3.除1/20LD50組之外，其他組均有死亡，中等蓄積性4.各組均有死亡，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系，強蓄積性連續(xù)染毒20天劑量遞增法染毒天數(shù)累積劑量0.400.605.4局部毒性測定實驗急性皮膚刺激/腐蝕試驗

豚鼠或家兔皮膚染毒4~24h

洗去殘留毒物，觀察染毒后24、48、72小時涂抹部位的皮膚反應(yīng)急性眼睛刺激/腐蝕試驗

家兔0.1ml受試物滴入眼結(jié)膜囊內(nèi)，記錄染毒后1、12、24、48、72、96h的局部反應(yīng)。檢查結(jié)膜充血和損傷、角膜透明度、虹膜紋理和角膜損傷5.4局部毒性測定實驗急性皮膚刺激/腐蝕試驗豚鼠或毒理學(xué)研究方法的優(yōu)缺點比較

流行病學(xué)研究受控的臨床研究體內(nèi)試驗 體外試驗真實的暴露條件規(guī)定的限定暴露條件易于控制暴露條件影響因素少，易于控制化學(xué)物之間在人群中測定反應(yīng)測定多種效應(yīng)可進行某些深入的研的聯(lián)合毒性作用對某組人群(如哮喘)

評價宿主特征的作用究(如機制，代謝)

測定在人群的作用的研究是有力的(如性別、年齡、遺傳特人力物力花費較少表示全部的人敏感性能測定效應(yīng)的強度征和飲食等其他因素可調(diào)控)

闡明毒性機制耗資、耗時多耗資多動物暴露與人暴露相關(guān)不能全面反映毒作用多為回顧性，無健較低濃度和較短時的不確定性不能作為毒性評價和康保護間的暴露受控的飼養(yǎng)條件與人的危險性評價的最后依據(jù)難以確定暴露，有限于較少量的人群實際情況不一致難以觀察慢性毒作用混雜暴露問題(一般<50)

暴露的濃度和時間的模可檢測的危險性增限于暫時、微小、式顯著不同于人群的加必需達到2倍以上可逆的效應(yīng)暴露測定指標(biāo)較粗(發(fā)病率，一般不適于研究最

死亡率)

敏感的人群

優(yōu)點缺點毒理學(xué)研究方法的優(yōu)缺點比較流行病學(xué)研究受控的臨第五章環(huán)境污染物的一般毒性及其評價

主講教師：劉薇大連理工大學(xué)環(huán)境學(xué)院生態(tài)毒理學(xué)

(Ecotoxicology)第五章環(huán)境污染物的一般毒性及其評價

主講教師：劉薇生態(tài)一般毒性和特殊毒性一般毒性特殊毒性急性毒性亞慢性毒性和慢性毒性蓄積毒性局部毒性致癌性致突變作用生殖和發(fā)育毒性一般毒性和特殊毒性一般毒性特殊毒性急性毒性致癌性5.1毒性評價的實驗基礎(chǔ)

流行病學(xué)資料和臨床觀察，可以獲得環(huán)境污染物對人類健康的危害。毒理學(xué)實驗為闡明毒性特點、毒作用機制、劑量-反應(yīng)關(guān)系，預(yù)測對人類健康的潛在危害一般規(guī)律，為制訂衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。一般毒性實驗急性毒性實驗亞慢性和慢性毒性實驗

蓄積實驗

5.1毒性評價的實驗基礎(chǔ)流行病學(xué)資料和臨床觀察，可毒理學(xué)試驗?zāi)康?.闡明受試物毒性表現(xiàn)和性質(zhì)2.闡明毒性作用的劑量-反應(yīng)(效應(yīng))3.確定毒作用的靶器官4.闡明毒性機制5.確定損害的可逆性

5.1毒性評價的實驗基礎(chǔ)毒理學(xué)試驗?zāi)康?.闡明受試物毒性表現(xiàn)和性質(zhì)5.1毒性評價一.實驗動物的選擇1.實驗動物(laboratoryanimal)

經(jīng)人工培育，對其攜帶微生物實行控制，遺傳背景明確，來源清楚，可用于科學(xué)研究的動物。Wistar

大鼠豚鼠5.1毒性評價的實驗基礎(chǔ)一.實驗動物的選擇1.實驗動物(laboratoryan2.選擇實驗動物的基本原則1.毒性反應(yīng)及代謝特點與人類相近2.自然壽命適宜3.易于飼養(yǎng)和實驗操作4.經(jīng)濟并易于獲得5.對受試物敏感一.實驗動物的選擇2.選擇實驗動物的基本原則1.毒性反應(yīng)及代謝特點與人類相近一3.毒理學(xué)實驗常用動物主要品系(strain）(1)

近交系動物

采用連續(xù)20代以上兄妹間交配或親子交配而培育的純品系動物。津白、津白165，BALB/C，C3HC57B/6J小鼠等。BALB/cA津白一.實驗動物的選擇3.毒理學(xué)實驗常用動物主要品系(strain）(1)近交系(2)

突變系動物

動物在生長繁殖過程中，通過自然突變或人工定向突變的辦法，使其某個基因發(fā)生突變，并喪失了原有的正常功能。這種突變的基因可以世代相傳并保持遺傳基因特性的品系動物。無胸腺裸鼠一.實驗動物的選擇(2)突變系動物動物在生長繁殖過程中，通過自然突變

兩個不同近交系之間有目的進行交配，所產(chǎn)生的雜交第一代動物。(3)

雜交群動物

5年以上不從外部引進新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所保存繁殖的動物群。

昆明種小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、Wistar大鼠、SD大鼠、青紫藍兔、新西蘭兔等。(4)

封閉群動物一.實驗動物的選擇兩個不同近交系之間有目的進行交配，所產(chǎn)生的雜交第一代4.微生物控制級別(1)

無菌動物

體內(nèi)外均無任何微生物和寄生蟲的動物。(2)無特定病原體動物（SPF）

體內(nèi)無特定的微生物和寄生蟲存在的動物。容許攜帶非特定微生物，但不能攜帶傳染性病原菌。(3)清潔動物

最低限度疾病動物。動物體內(nèi)外不攜帶人畜共患的病原體或動物傳染病病原體?？贵w檢查常發(fā)現(xiàn)腦脊髓質(zhì)炎病毒、鼠肝炎病毒等抗體。但不應(yīng)有臨床癥狀、病理改變及自然死亡。飼養(yǎng)在半屏蔽系統(tǒng)。一.實驗動物的選擇4.微生物控制級別(1)無菌動物一.實驗動物的選擇1.年齡2.性別3.生理狀態(tài)4.健康狀況

5.個體選擇要求一.實驗動物的選擇1.年齡5.個體選擇要求一.實驗動物的選擇可根據(jù)人類實際接觸方式和受試物的理化性質(zhì)等因素，選擇合適的染毒方式。1.經(jīng)口染毒灌胃，喂飼，膠囊2.經(jīng)呼吸道染毒靜式吸入染毒，動式吸入染毒3.經(jīng)皮染毒4.皮下、靜脈注射和腹腔內(nèi)注射

5.其他

二.常用染毒方式可根據(jù)人類實際接觸方式和受試物的理化性質(zhì)等因素，選擇合適的染三.毒理學(xué)試驗中的常用對照組1.未處理對照組(空白對照組)

本底值，質(zhì)量控制2.陰性(溶劑／賦形劑)對照

與染毒組比較的基礎(chǔ)

3.陽性對照

檢測試驗體系的有效性和準(zhǔn)確性4.歷史性對照檢查試驗體系的穩(wěn)定性，即進行實驗室質(zhì)量控制和保證

三.毒理學(xué)試驗中的常用對照組1.未處理對照組(空白對照組)四.受試樣品要求

用同一種、同一批號受試物受試物成分和配方必須固定如存在異構(gòu)體混合物，則要求異構(gòu)體比例必須固定

活性成分的含量和雜質(zhì)的濃度應(yīng)固定受試物保質(zhì)期內(nèi)不發(fā)生分解，摻入到飼料惑溶液中也要求穩(wěn)定四.受試樣品要求用同一種、同一批號受試物五.實驗結(jié)果的判斷1.實驗組與對照組比較有無顯著性差異2.劑量-反應(yīng)關(guān)系和劑量-效應(yīng)關(guān)系3.其他相關(guān)參數(shù)的改變4.是否在“正常”值范圍

五.實驗結(jié)果的判斷1.實驗組與對照組比較有無顯著性差異一.急性毒性

急性毒性(acutetoxicity)指機體一次接觸或在24小時內(nèi)多次接觸化學(xué)物后，短期內(nèi)引起的毒效應(yīng)。死亡行為生理生化指標(biāo)的異常變化

病理學(xué)改變5.1急性毒性及其評價一.急性毒性急性毒性(acutetoxicity)指機急性毒性實驗?zāi)康?/p>

1.致死劑量、急性閾劑量、初步估計對人類毒害的危險性。

2.闡明急性毒性強度、特征、可能的靶器官、致死原因和劑量－反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系。

3.體內(nèi)生物轉(zhuǎn)運和轉(zhuǎn)化，及其動力學(xué)變化。

4.為設(shè)定蓄積性、亞慢性、慢性毒性實驗的染毒劑量、觀察指標(biāo)提供參考依據(jù)。一.急性毒性急性毒性實驗?zāi)康?.致死劑量、急性閾劑量、初步估計對人類急性毒性參數(shù)1.絕對致死劑量或濃度(LDl00/LC100)

2.最小致死劑量或濃度(MLD/MLC)

3.最大耐受劑量或濃度(MTD、LD0/MTC、LC0)

4.半數(shù)致死劑量或濃度(LD50/LC50)

5.急性毒性LOAEL6.急性毒性NOAEL7.急性毒作用帶(Zac)

一.急性毒性急性毒性參數(shù)1.絕對致死劑量或濃度(LDl00/LC10二.急性毒性實驗的動物選擇

健康成年動物未曾交配或受孕

大鼠(180240g)小鼠(1825g)

家兔(22.5kg)貓(1.52.0kg)氣態(tài)毒物的粘膜刺激—貓皮膚的局部刺激作用—豚鼠，家兔過敏反應(yīng)—豚鼠、家兔、狗、小鼠、貓嘔吐反應(yīng)—狗、貓哺乳動物二.急性毒性實驗的動物選擇健康成年動物未曾交配或受孕氣三.急性毒性實驗染毒方式1.經(jīng)口(胃腸道)接觸

(1)一次灌胃體積小鼠0.10.5ml/10g體重大鼠0.51.0ml/100g體重

(2)吞咽膠囊家兔及貓、狗等大動物

實驗動物染毒前應(yīng)禁食，染毒后也應(yīng)繼續(xù)禁食34小時。三.急性毒性實驗染毒方式1.經(jīng)口(胃腸道)接觸實驗動2.經(jīng)呼吸道接觸

常溫、常壓下為氣態(tài)，或以蒸氣態(tài)、氣溶膠、煙、塵狀態(tài)污染生產(chǎn)環(huán)境與生活環(huán)境空氣。①靜式染毒②動式染毒3.經(jīng)皮膚接觸

應(yīng)當(dāng)盡量選擇皮膚解剖、生理與人類較近似的動物為對象。家兔和豚鼠為首選，也可用大鼠代替。

三.急性毒性實驗染毒方式2.經(jīng)呼吸道接觸常溫、常壓下為氣態(tài)，或以3.經(jīng)皮膚接觸四.半數(shù)致死量測定程序1實驗動物

性成熟、健康，雌雄各半2化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和毒性參考資料

3預(yù)試驗

求出全活、全死劑量

4正式實驗在求出全活、全死劑量之間設(shè)5~6個實驗組組距1.2~1.5倍小鼠、大鼠10只/組、家兔46只/組如化合物毒性有性別差異，則應(yīng)分別計算雌、雄性動物各自的LD50(LC50)。四.半數(shù)致死量測定程序1實驗動物性成熟、健康，雌雄各觀察持續(xù)時間和飼養(yǎng)條件

觀察期一般為14天內(nèi)的總死亡數(shù)。速死性毒物求其LD50(LC50)，應(yīng)計算24小時的死亡率。

LD50值的表示應(yīng)注明染毒途徑和觀察時間，以便于在進行毒性比較時有可比性。在觀察期間，應(yīng)保障實驗動物有完全的膳食、充足的飲水及適宜的溫濕度環(huán)境，以防止動物出現(xiàn)非中毒性死亡。四.半數(shù)致死量測定程序觀察持續(xù)時間和飼養(yǎng)條件觀察期一般為14天內(nèi)的總死亡數(shù)。中毒癥狀觀察

應(yīng)詳細(xì)地觀察記錄動物的中毒癥狀、發(fā)生和發(fā)展過程及規(guī)律，死亡前癥狀特點、死亡時間等。很多毒物初期往往初期先出現(xiàn)興奮或抑制現(xiàn)象。應(yīng)注意體重變化。粘膜刺激癥狀，如出汗、流涎，甚至有血性分泌物，瞳孔改變等。四.半數(shù)致死量測定程序中毒癥狀觀察應(yīng)詳細(xì)地觀察記錄動物的中毒癥狀、發(fā)生和發(fā)病理學(xué)檢查和其它指標(biāo)觀察

在觀察期間中毒死亡動物應(yīng)及時解剖，檢查器官有無充血、出血、水腫或其它改變，并對有變化的臟器作病理組織學(xué)檢查。對存活動物在觀察期結(jié)束時，應(yīng)做全部動物解剖，逐一進行病理學(xué)檢查。四.半數(shù)致死量測定程序病理學(xué)檢查和其它指標(biāo)觀察在觀察期間中毒死亡動物應(yīng)及時計算LD50和LD5095%可信限1.霍恩式法2.簡化寇式法3.直接回歸法四.半數(shù)致死量測定程序計算LD50和LD5095%可信限1.霍恩式法四.半數(shù)致五.急性毒性分級單位：mg/kgWHO化學(xué)品毒性分級劇毒<1高毒 1~中等毒50~低毒 500~實際無毒5000~極毒<1劇毒 1~50中等毒51~500低毒 501~5000實際無毒5001~15000無毒 >15000

中國衛(wèi)生部根據(jù)大鼠一次經(jīng)口LD50的急性毒性分級五.急性毒性分級單位：mg/kgWHO化學(xué)品毒性分級劇毒急性毒性閾劑量(濃度)

一次染毒引起某種毒性反應(yīng)的最小劑量，屬于非致死性指標(biāo)。未知毒性污染物：可選擇綜合性、非特異性指標(biāo)。如體重，活動能力，應(yīng)激狀態(tài)、條件反射等。已知毒性比較了解的可選擇最敏感的指標(biāo)刺激性氣體或蒸汽：可選擇眼睛和嗅覺刺激閾濃度。觀察指標(biāo)的選擇急性毒性閾劑量(濃度)一次染毒引起某種毒性反應(yīng)的最小劑量，急性毒性試驗的局限性1.消耗的動物量大2.獲得的信息有限3.測得的LD50僅僅是一個近似值4.在安全性評價中僅評價動物死亡和簡單的癥狀觀察是不夠的，更需要的是生理學(xué)、血液學(xué)及其它化驗檢查所提供的深入細(xì)致的毒性信息。急性毒性試驗的局限性1.消耗的動物量大急性毒性閾劑量實驗方法游泳實驗

反映體力和活動能力刺激閾實驗

反映對上呼吸道、眼睛和口腔等粘膜的刺激作用貓置于染毒柜內(nèi)，加入受試物，觀察癥狀30min癥狀：流淚、流締、噴嚏、嗆咳、流涎等50%實驗動物出現(xiàn)癥狀的最小濃度—刺激閾濃度水槽水溫20℃

動物放入水中，記錄從放入到沉沒5秒所需要的時間記錄游泳速度和游泳姿勢

急性毒性閾劑量實驗方法游泳實驗反映體力和活動能力刺激閾實一.慢性毒性和亞慢性毒性

在日常生活環(huán)境中，人類接觸環(huán)境污染物的濃度遠(yuǎn)低于急性致死濃度，但接觸的時間則較長。為了評價在較長的一段時間內(nèi)反復(fù)接觸低濃度環(huán)境污染物的毒性作用，獲得接近于人類實際接觸條件下的毒性資料，需進行亞慢性或慢性毒性試驗。5.2

環(huán)境污染物的亞慢性、慢性毒性及其評價一.慢性毒性和亞慢性毒性在日常生活環(huán)境中，人類接觸環(huán)亞慢性毒性(subchronictoxicity)

在一段時間內(nèi)（1~3個月）連續(xù)攝入、較大劑量環(huán)境污染物引起的毒性效應(yīng)。慢性毒性(chronictoxicity)

長期連續(xù)、低劑量攝入環(huán)境污染物（6個月~終生）引起的毒性效應(yīng)。5.2

環(huán)境污染物的亞慢性、慢性毒性及其評價亞慢性毒性(subchronictoxicity)慢性毒性二.亞慢性毒性及評價方法1.在急性毒性試驗的基礎(chǔ)上，在較短時間內(nèi)了解受試物對機體長期作用時的主要毒性性質(zhì)和特點、靶器官和最大耐受劑量2.探討敏感指標(biāo)及其劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系3.為慢性毒性試驗設(shè)計提供依據(jù)。亞慢性毒性評價目的二.亞慢性毒性及評價方法1.在急性毒性試驗的基礎(chǔ)上，在較短實驗動物和分組

大鼠或小鼠健康，幼齡每組10~20只雌雄各半染毒途徑染毒劑量和實驗期限1.1/20~1/5LD50范圍內(nèi)設(shè)三個劑量組，設(shè)對照組2.無蓄積作用，排泄快的毒物還可適當(dāng)加大劑量3.低劑量組動物不會產(chǎn)生可觀察到的毒性反應(yīng)4.高劑量組動物出現(xiàn)明顯的中毒反應(yīng)，但不引起動物死亡（或10%）5.1~3個月與人類實際接觸的方式和途徑相同亞慢性毒性試驗二.亞慢性毒性及評價方法實驗動物和分組染毒途徑染毒劑量和實驗期限1.1/20~1/亞慢性毒性實驗觀察指標(biāo)1一般性指標(biāo)

體重、食物利用率、活動能力等指標(biāo)2特異指標(biāo)

特異性反應(yīng),能更確切地闡明受試物引起的有害影響的閾劑量及最大無作用劑量。應(yīng)盡量選用特異指標(biāo)。3血液學(xué)及生化學(xué)指標(biāo)

血常規(guī)，骨髓細(xì)胞成分、血清和尿液生化學(xué)檢查

4有害物質(zhì)在體內(nèi)的分布、代謝及排泄指標(biāo)

5病理組織學(xué)檢查

死亡的動物應(yīng)作病理檢查。實驗結(jié)束時，全部動物進行剖檢，測定臟器系數(shù)，應(yīng)特別注意靶器官的變化。

肝、腎等組織應(yīng)列為常規(guī)檢查項目。二.亞慢性毒性及評價方法亞慢性毒性實驗觀察指標(biāo)1一般性指標(biāo)二.亞慢性毒性及評價試驗結(jié)果評價1

確定毒性作用

闡明亞慢性毒性的性質(zhì)、特點、毒效應(yīng)類型、作用強度和靶器官。2確定毒性作用的敏感指標(biāo)3

中毒閾劑量和最大無作用劑量二.亞慢性毒性及評價方法試驗結(jié)果評價1確定毒性作用二.亞慢性毒性及評價方法慢性毒性實驗的目的

本實驗?zāi)康氖窃u價環(huán)境污染物在長期、小劑量、反復(fù)作用條件下，對機體產(chǎn)生的損害及其特點，確定其慢性毒性閾劑量和最大無作用劑量，為制訂環(huán)境中有害物質(zhì)的最高容許濃度(MAC)和人類每日容許攝入量(ADI)提供科學(xué)依據(jù)。三.慢性毒性及評價方法慢性毒性實驗的目的本實驗?zāi)康氖窃u價環(huán)境污染物在長期、慢性毒性試驗設(shè)計初斷乳的大鼠或小鼠。每組20~40只，雌雄各半。設(shè)3~4個實驗組和一個對照組。實驗動物和分組染毒劑量和實驗期限對照組溶劑對照低劑量組1/100

亞慢性毒性閾劑量不出現(xiàn)中毒反應(yīng)無作用劑量組NOAEL中劑量組1/10

可出現(xiàn)輕微的毒效應(yīng)LOAEL高劑量組1/5

出現(xiàn)明顯的毒效應(yīng)甚至亞致死狀態(tài)實驗期間6~終生實驗結(jié)束后可停止染毒觀察恢復(fù)狀況染毒方式和觀察指標(biāo)

選擇原則同亞慢性試驗，盡量選擇在亞慢性試驗中觀察到的特異和敏感指標(biāo)。三.慢性毒性及評價方法慢性毒性試驗設(shè)計初斷乳的大鼠或小鼠。每組20~40只，雌雄各慢性毒性實驗注意事項

1

控制實驗條件

排除干擾因素對實驗結(jié)果的影響

2

試驗前應(yīng)對觀察指標(biāo)，尤其是血、尿常規(guī)及重點測定的生化指標(biāo)進行正常值測定，篩除個體差異過大的動物

3

染毒期間進行動態(tài)觀察的各項指標(biāo)，應(yīng)與對照組同步測定

4各化驗測定方法應(yīng)精確、可靠、需要進行質(zhì)量控制。

5

應(yīng)重視病理組織學(xué)的檢查。凡試驗期間死亡的動物，都應(yīng)做病理組織學(xué)檢查。三.慢性毒性及評價方法慢性毒性實驗注意事項1控制實驗條件三.慢性毒性及評價方慢性毒性實驗結(jié)果評價

1觀察指標(biāo)與對照組比較，是否超出正常值范圍，是否具有顯著性差異和劑量-效應(yīng)(反應(yīng))關(guān)系

2根據(jù)實驗期間和恢復(fù)期的觀察和檢測結(jié)果，進行全面的綜合分析。結(jié)合受試物的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性，應(yīng)用生物學(xué)和醫(yī)學(xué)理論，闡明慢性毒性的性質(zhì)、特點、毒作用類型、靶器官和中毒機理。

3確定敏感指標(biāo)的慢性毒性閾劑量(LOAEL)和最大無作用劑量(NOAEL)。三.慢性毒性及評價方法慢性毒性實驗結(jié)果評價1觀察指標(biāo)與對照組比較，是否超出正5.3

蓄積毒性

連續(xù)多次攝入的環(huán)境毒物總量（或速度），大于代謝和排泄速度時，毒物或其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)逐漸增加并貯留現(xiàn)象叫做毒物的蓄積作用(Accumulation)。蓄積作用功能蓄積FunctionalAccumulation物質(zhì)蓄積MaterialAccumulation5.3蓄積毒性連續(xù)多次攝入的環(huán)境毒物總量（或速度）蓄積毒性評價方法蓄積系數(shù)法K=LD50(n)LD50(1