DNA重組和基因轉(zhuǎn)移

第七章DNA重組和基因轉(zhuǎn)移

第一節(jié)目的基因與載體的連接一、粘末端DNA片段的連接（一）具有相同粘末端的DNA分子之間的連接

使用堿性磷酸酶處理載體DNA，去掉其5’末端的磷酸基，以防質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。（二）具有不同粘性末端的DNA分子之間的連接

用兩種不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)載體和外源DNA進(jìn)行切割后，在它們兩端會(huì)產(chǎn)生非互補(bǔ)的突出端，經(jīng)DNA連接酶連接后即產(chǎn)生定向重組體。

HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI對(duì)載體酶切HindIIIEcoRI對(duì)基因酶切質(zhì)粒載體的定向重組二、平末端DNA片段的連接1、直接用T4連接酶連接2、同聚物加尾法3、銜接物連接法銜接物是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個(gè)核苷酸組成，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。三、載體與DNA片段酶切位點(diǎn)不匹配的連接

4、DNA接頭連接法

接頭的一端是齊平的，而另一端是某種內(nèi)切酶的粘性末端，先利用齊平末端連接方法將它與平端的外源DNA連接起來(lái)，造成人工粘性末端，即可再與之互補(bǔ)的粘性末端的載體DNA相連接。

所謂載體與DNA片段酶切位點(diǎn)不匹配，指載體與待克隆的DNA片段上的酶切位點(diǎn)不相同，因而用一種或兩種酶切制造不出可互補(bǔ)的粘性末端。

1、按照平末端連接方法加上接頭。2、將凹端變?yōu)槠蕉耍?）使用Klenow酶在4種dNTP存在下，將3′凹端完全補(bǔ)平。（2）用S1核酸酶去除3′突出末端產(chǎn)生平端DNA分子

3、使用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段部分補(bǔ)平3′凹端轉(zhuǎn)變成粘端。TCGAAGCTGATCCTAG載體經(jīng)xhoI酶切形成：外源基因用San3A酶切形成：用Klenow酶部分補(bǔ)平二者的3′凹端，形成：TCGAAGCTGATCCTAGCTTCAGGA這樣，就可以實(shí)現(xiàn)有效重組。3′3′3′3′5′5′5′5′四、cDNA與載體的連接通過(guò)依次加入、連接合成的DNA接頭進(jìn)行cDNA克隆第二節(jié)重重組DNA分分子的篩選與與鑒定外源基因與載載體連接后轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌可能的三種種情況：（1）（2）（3）轉(zhuǎn)化E.coli一、遺傳檢測(cè)測(cè)法（一）根據(jù)載載體表型特征征選擇重組體體分子1、抗藥性標(biāo)記記插入失活篩篩選法例：pBR322如果外源基因因插入到tetr基因內(nèi)部，tetr抗性消失，表表型為不抗四四環(huán)素（tets）、而仍抗氨芐青青霉素（ampr），這樣的轉(zhuǎn)化細(xì)細(xì)胞在含有amp的培養(yǎng)基仍可可生長(zhǎng)，但在在含有四環(huán)素素的培養(yǎng)基上上不能再生長(zhǎng)長(zhǎng)；反之，如如果ampr基因由由于外外源基基因插插入其其內(nèi)部部而失失活，，帶有有重組組DNA分子的的轉(zhuǎn)化化細(xì)胞胞在含含有tet的培養(yǎng)養(yǎng)基平平板上上生長(zhǎng)長(zhǎng)，在在含有有amp的培養(yǎng)養(yǎng)基不不能生生長(zhǎng)。。插入失失活法法篩選選重組組子2、α——互補(bǔ)補(bǔ)例；pUC質(zhì)粒粒在LacZ—的大腸腸桿菌菌中，，在平平板培培養(yǎng)中中，菌菌落是是白色色的。。若在在該細(xì)細(xì)胞中中引入入pUC質(zhì)粒，，其上上有LacZ′，質(zhì)粒和和大腸腸桿菌菌DNA可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)α—互補(bǔ)，，菌落落呈藍(lán)藍(lán)色。。如果在在質(zhì)粒粒的多多克隆隆位點(diǎn)點(diǎn)的某某個(gè)酶酶切點(diǎn)點(diǎn)上克克隆了了外源源基因因，則則LacZ′基因受受到破破壞，，便不不能再再和缺缺陷型型受體體菌中中生成成有活活性的的β-半乳糖糖苷酶酶，因因此，，菌落落呈白白色。。（二））根據(jù)插插入序序列的的表型型特征征選擇擇重組組體進(jìn)入受受體細(xì)細(xì)胞的的重組組DNA分子中中的外外源基基因如如果在在宿主主細(xì)胞胞中能能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)功能能表達(dá)達(dá)，產(chǎn)產(chǎn)生出出有功功能活活性的的基因因產(chǎn)物物，那那么鑒鑒定此此種重重組體體最簡(jiǎn)簡(jiǎn)便的的方法法就是是表型型特征征的直直接選選擇法法。二、物物理檢檢測(cè)法法1、凝膠膠電泳泳檢測(cè)測(cè)法2、R-環(huán)法在臨近近雙鏈鏈DNA變性溫溫度下下和高高濃度度（70%）的甲甲酰胺胺溶液液中，，即所所謂的的R-環(huán)條件件下，，雙鏈鏈的DNA-RNA分子要要比雙雙鏈的的DNA-DNA分子更更為穩(wěn)穩(wěn)定。。因此此，將將RNA和DNA的混合合物置置于這這種條條件下下，RNA便會(huì)同同雙鏈鏈DNA分子中中與之之互補(bǔ)補(bǔ)的序序列退退火形形成穩(wěn)穩(wěn)定的的DNA-RNA雜交分分子，，而另另一條條DNA鏈則成成為單單鏈狀狀態(tài)。。這種種由單單鏈DNA分支和和雙鏈鏈DNA-RNA分支形形成的的“泡泡狀””體，，叫做做R-環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)。三、核核酸雜雜交檢檢測(cè)法法例：原位雜雜交篩篩選重重組體體菌落落(或噬菌菌斑)四、免免疫化化學(xué)檢檢測(cè)法法免疫化化學(xué)檢檢測(cè)法法是利利用抗抗體與與抗原原結(jié)合合的高高度特特異性性來(lái)鑒鑒別基基因的的。如如果某某個(gè)重重組克克隆中中的外外源基基因能能夠表表達(dá)，，在這這個(gè)克克隆中中就存存在著著這個(gè)個(gè)基因因的特特定蛋蛋白，，即可可用特特異性性抗體體來(lái)檢檢測(cè)。。常用用的有有標(biāo)記記抗體體測(cè)定定法和和免疫疫沉淀淀測(cè)定定法兩兩種。轉(zhuǎn)化菌菌落影印平平板置于含含氯仿仿飽合合氣體體的容容器細(xì)菌裂裂解，，抗原原釋放放覆蓋吸吸附有有未經(jīng)經(jīng)標(biāo)記記的抗抗體的的NC膜形成抗抗原抗抗體復(fù)復(fù)合物物將NC膜與I125標(biāo)記的的抗體體溫育育放射自自顯影影與母板板對(duì)照照，挑挑取所所需的的重組組克隆隆標(biāo)記抗抗體測(cè)測(cè)定法法的步步驟：：用免疫疫化學(xué)學(xué)法檢檢測(cè)克克隆在在表達(dá)達(dá)載體體pUC8上的基基因五、DNA-蛋白質(zhì)質(zhì)篩選選法六、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)譯篩篩選法法原理：：外源DNA蛋白質(zhì)質(zhì)翻譯能與某某一特定DNA序列結(jié)結(jié)合作為探探針與與克隆隆群體體雜交交轉(zhuǎn)譯篩篩選法法是通通過(guò)體體外轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)譯的的手段段鑒定定陽(yáng)性性克隆隆的方方法，，可分分為雜雜交抑抑制轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)譯和和雜交交選擇擇轉(zhuǎn)譯譯兩種種方法法。1．雜交交抑制制轉(zhuǎn)譯譯要求：：被研研究的的目的的基因因編碼碼有豐豐富的的mRNA。。DNA蛋白質(zhì)mRNA蛋白質(zhì)×雜交原理：：步驟：：轉(zhuǎn)化菌菌落提取重重組DNA與mRNA總雜交交形成DNA-RNA雜種分分子將總mRNA（（包括DNA-RNA分子提取出出來(lái)體外轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)譯蛋白電電泳放放射自自顯影影（（1））總mRNA體外轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)譯蛋白電電泳放放射自自顯影影（（2））經(jīng)對(duì)比比，（（1））比（（2））中少少了一一種蛋蛋白質(zhì)質(zhì)找到一種種轉(zhuǎn)譯作作用被抑抑制了的的mRNA篩選出重重組菌落落（或噬噬菌斑））2、雜交選擇擇轉(zhuǎn)譯觀察到在這種雜雜交選擇擇的轉(zhuǎn)譯譯中，存存在著一一種特殊殊活躍的的mRNA。重組體庫(kù)庫(kù)提取DNA固定在NC膜上與mRNA或總RNA雜交目的基因因與對(duì)應(yīng)應(yīng)的mRNA雜交，mRNA固定在NC膜上將分離mRNA的進(jìn)行體體外轉(zhuǎn)譯譯凝膠電泳泳或生物物活性檢檢測(cè)找出單菌菌落重組組體第三節(jié)基基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移方法法一、重組DNA導(dǎo)入大腸腸桿菌（一）轉(zhuǎn)化將外源DNA分子導(dǎo)入入某一宿宿主細(xì)菌菌細(xì)胞的的過(guò)程都都叫轉(zhuǎn)化。為了有效效地使細(xì)細(xì)菌吸收收外源的的DNA分子，我我們通常常要對(duì)它它們進(jìn)行行一些物物理或化化學(xué)的處處理，處處理后的的細(xì)胞吸吸收外源源DNA的能力大大大提高高，被稱稱為感受態(tài)細(xì)細(xì)胞。對(duì)于大腸腸桿菌細(xì)細(xì)胞，一一般采用用50mmol/L的CaCl2溶液來(lái)制制備感受受態(tài)細(xì)胞胞。（1）吸吸附階段段：完整整的雙鏈鏈DNA分子吸附附于感受受態(tài)細(xì)胞胞表面。。（2）轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入階段段：雙鏈鏈DNA分子解鏈鏈，以單單鏈形式式進(jìn)入細(xì)細(xì)胞，而而另一鏈鏈則被降降解。（3）自自身穩(wěn)定定階段；；外源質(zhì)質(zhì)粒在細(xì)細(xì)胞內(nèi)又又復(fù)制成成雙鏈環(huán)環(huán)型DNA。。（4）表達(dá)階段段：即目目的基因因隨質(zhì)粒粒的復(fù)制制子一起起復(fù)制，，并被轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)譯。DNA分子轉(zhuǎn)化化的過(guò)程程：質(zhì)粒DNA的大小及及構(gòu)型對(duì)對(duì)轉(zhuǎn)化效效率的影影響：（1）大大?。?0Kb，轉(zhuǎn)化效率率很低（2）構(gòu)構(gòu)型超超螺螺旋＞環(huán)形＞線狀（二）轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染（2）λλ噬菌體體的體外外包裝轉(zhuǎn)染(transfection)：是指感受受態(tài)的受受體細(xì)胞胞捕獲和和表達(dá)以以噬菌體體為載體體的重組組DNA分子的過(guò)過(guò)程。（1）轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染的區(qū)區(qū)別轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：通過(guò)λ噬菌體（（病毒））顆粒感感染宿主主細(xì)胞的的途徑把把外源DNA轉(zhuǎn)移到受受體細(xì)胞的過(guò)過(guò)程。轉(zhuǎn)染：λ噬菌體DNA分子直接接導(dǎo)入受受體細(xì)胞胞的過(guò)程程。體外包裝裝：是指指在體外外模擬λ噬菌體DNA在受體細(xì)細(xì)胞內(nèi)的的一系列列特殊的的包裝反反應(yīng)過(guò)程程，將重重組λ噬菌體DNA分子包裝裝成為成成熟的具具有感染染能力的的λ噬菌體顆顆粒的技技術(shù)。λ噬菌體體的體外外包裝的的原理：：根據(jù)λ噬菌體DNA的體內(nèi)包包裝途徑徑，分別別獲得缺缺失D包裝蛋白白的λ噬菌體突突變株和和缺失E包裝蛋白白的λ噬菌體突突變株。。由于不不具備完完整的包包裝蛋白白，這兩兩種突變變株均不不能單獨(dú)獨(dú)包裝λ噬菌體DNA，，但將兩種種突變株株分別感感染大腸腸桿菌，，從中提提取缺失失蛋白D的包裝物物（含E蛋白）和和缺失E蛋白的包包裝物（（含D蛋白），，兩者混混合后就就能包裝裝λ噬菌體DNA。。二、重組DNA導(dǎo)入植物物細(xì)胞的的方法（一）載載體介導(dǎo)導(dǎo)的轉(zhuǎn)化化方法1、共培養(yǎng)法法(cocultivation)該方法是是Marton等1979年以原生生質(zhì)體為為受體建建立起來(lái)來(lái)的，隨隨后經(jīng)過(guò)過(guò)一系列列的改進(jìn)進(jìn)，現(xiàn)在在是植物物基因工工程中最最常用的的一種轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化方法法。該方方法的主主要原理理是將受受體與供供體在一一起培養(yǎng)養(yǎng)，通過(guò)過(guò)接觸感感染而發(fā)發(fā)生轉(zhuǎn)移移，供體體常用農(nóng)農(nóng)桿菌、、病毒載載體等形形式。（1）原原生質(zhì)體體共培養(yǎng)法法取含重組組Ti質(zhì)粒的農(nóng)農(nóng)桿菌同同剛剛長(zhǎng)長(zhǎng)出細(xì)胞胞壁的原原生質(zhì)體體作短暫暫的共培培養(yǎng)，促促使農(nóng)桿桿菌和植植物細(xì)胞胞之間發(fā)發(fā)生遺傳傳物質(zhì)的的轉(zhuǎn)化。。①?gòu)臒煵莶轃o(wú)菌苗苗中分離離原生質(zhì)質(zhì)體，并并預(yù)培養(yǎng)養(yǎng)24小小時(shí)。②原生質(zhì)質(zhì)體與農(nóng)農(nóng)桿菌混混合培養(yǎng)養(yǎng)，原生生質(zhì)體濃濃度l05／ml、、農(nóng)桿菌l07／ml，，20℃℃下保溫32小時(shí)時(shí)。③沖洗去去游離的的細(xì)菌，，將原生生質(zhì)體培培養(yǎng)在有有抗生素素(250mg／L萬(wàn)古霉素素，200mg／L羧芐青霉霉素，200mg／L鏈霉素)的培養(yǎng)養(yǎng)基中，，這些抗抗生素抑抑制細(xì)菌菌生長(zhǎng)，，而對(duì)原原生質(zhì)體體無(wú)毒害害。④3周后，離離心收集集細(xì)胞團(tuán)團(tuán)，再培培養(yǎng)在無(wú)無(wú)激素培培養(yǎng)基上上，2周內(nèi)，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化的細(xì)細(xì)胞團(tuán)是是激素非非依賴性性生長(zhǎng)細(xì)細(xì)胞團(tuán)，，在該培培養(yǎng)基中中可快速速生長(zhǎng)，，而非轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化的細(xì)細(xì)胞團(tuán)則則生長(zhǎng)很很慢，最最后變褐褐死亡。。煙草原生生質(zhì)體與與Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移移的共培培養(yǎng)法程程序?yàn)椋海?）葉盤(pán)共共培養(yǎng)法法圖該方法最最早由Horsch(1985)首創(chuàng)，用用于煙草草轉(zhuǎn)化。優(yōu)點(diǎn)：適適用性廣廣，對(duì)于于那些能能被農(nóng)桿桿菌感染染的、并并能從葉葉子再生生植株的的各種植植物均適適用。（3）懸懸浮細(xì)胞胞或愈傷傷組織共共培養(yǎng)（4）活體接接種(inoculationinvivo)原則上，，該種共共培養(yǎng)與與原生質(zhì)質(zhì)體共培培養(yǎng)的方方法和步步驟是相相同的，，在供體體上，則則必須是是有侵染染和感染染能力的的載體系系統(tǒng)，如如帶有Ti質(zhì)粒的的根癌癌農(nóng)桿桿菌。。所謂整整體植植株接接種轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法法，是是指人人為地地在整整體植植株上上造成成創(chuàng)傷傷部位位，然然后把把農(nóng)桿桿菌接接種在在創(chuàng)傷傷表面面，或或用針針頭把把農(nóng)桿桿菌注注射到到植物物體內(nèi)內(nèi)，使使農(nóng)桿桿菌按按照天天然的的感染染過(guò)程程在在植物物體內(nèi)內(nèi)進(jìn)行行侵染染，獲獲得轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化的的植物物愈傷傷組織織或轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因植株株。接接種后后2-3周周，切切下接接種處處部分分組織織培養(yǎng)養(yǎng)4周周，可可產(chǎn)生生愈傷傷組織織，進(jìn)進(jìn)一步步通過(guò)過(guò)分化化培養(yǎng)養(yǎng)可獲獲得轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因植株株。2、病毒介介導(dǎo)的的基因因轉(zhuǎn)移移（1）雙鏈鏈DNA病毒轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化載載體這類(lèi)病病毒是是以雙雙鏈DNA作為遺遺傳物物質(zhì)，，在這這類(lèi)病病毒中中，目目前研研究的的最多多的是是花椰椰菜花花葉病病毒（（簡(jiǎn)稱稱CaMV,CaullinusMozicVirus）。（2）單鏈鏈DNA病毒轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化載載體GeNV顧名思思義，，可翻翻譯成成“雙雙聯(lián)體體病毒毒”或或“孿孿生病病毒””。GeNV的感染染范圍圍較廣廣，包包括單單子葉葉和雙雙子葉葉植物物，它它們的的傳播播媒介介是昆昆蟲(chóng)。。（3）單鏈鏈RNA病毒轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化載載體迄今為為止，，還沒(méi)沒(méi)有建建立起起一個(gè)個(gè)完善善的以以植物物RNA病毒為為基因因載體體的基基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化體體系，，但是是RNA病毒仍仍是一一個(gè)很很有希希望作作為基基因工工程載載體的的植物物病毒。。（二））DNA直接導(dǎo)導(dǎo)入法法1、物理理方法法（1））基因因槍法法80年年代末末期，，由康康奈爾爾大學(xué)學(xué)的Sanford最先提提出，，主要要是為為了克克服以以往各各種基基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化技技術(shù)的的局限限。該方法法是利利用一一種物物理儀儀器裝裝置，，將鎢鎢、金金等金金屬微微粒加加速?zèng)_沖擊細(xì)細(xì)胞，，把細(xì)細(xì)胞擊擊孔，，使目目的基基因進(jìn)進(jìn)入受受體。。首先將將鎢、、金微微粒(直徑約約0.4μm，重量約約0.05mg)與供體體DNA溶液(1～2μl)混合并并保溫溫，使使DNA吸附在在金屬屬微粒粒的表表面，，然后后將該該溶液液置于于所謂謂的““基因因槍””儀器器中，，儀器器高壓壓放電電將金金屬微微粒加加速，，直接接噴射射受體體原生生質(zhì)或或細(xì)胞胞，細(xì)細(xì)胞擊擊穿成成孔后后，在在鎢粒粒上的的DNA以及溶溶液中中的DNA都可以以進(jìn)入入受體體細(xì)胞胞。操作技技術(shù)程程序?yàn)闉椋夯驑寴屖疽庖鈭D基因槍槍所用用材料料：（1））鎢粉粉使用用起來(lái)來(lái)經(jīng)濟(jì)濟(jì)實(shí)惠惠，也也可以以得到到較好好的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化效效果；；但容容易被被氧化化，顆顆粒易易聚集集，并并且對(duì)對(duì)植物物細(xì)胞胞的毒毒害也也比金金粉大大。（2））將DNA包被到到微載載體上上所用用的試試劑有有亞精精胺、、CaCl2、乙醇、、聚乙乙二醇醇、異異丙醇醇等，，但多多用前前兩種種。（3））所用用動(dòng)力力系統(tǒng)統(tǒng)：一一類(lèi)以以火藥藥爆炸炸力作作為動(dòng)動(dòng)力加加速微微彈；；另一一類(lèi)以以電弧弧放電電蒸發(fā)發(fā)液滴滴作為為動(dòng)力力；第第三類(lèi)類(lèi)以高高壓蒸蒸汽作作為動(dòng)動(dòng)力。?；驑寴尫ǖ牡奶攸c(diǎn)點(diǎn)：（1））轉(zhuǎn)化化效率率高。。（2））受體體廣泛泛。（3））操作作簡(jiǎn)單單。（2））電激法法(electroperation)電激法法是利利用高高壓電電脈沖沖的作作用對(duì)對(duì)原生生質(zhì)體體或細(xì)細(xì)胞擊擊出微微孔而而使基基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移的的一種種新方方法。。原理：：細(xì)胞生生物學(xué)學(xué)研究究證明明，細(xì)細(xì)胞膜膜的磷磷脂雙雙分子子層可可視為為一種種電容容，其其靜膜膜電位位（Vm）約為l00mV，導(dǎo)電性性很差差。當(dāng)當(dāng)把細(xì)細(xì)胞置置于外外加電電場(chǎng)中中時(shí)，，會(huì)使使膜電電位升升高，，雙分分子層層兩端端電壓壓形成成差勢(shì)勢(shì)，隨隨著外外加電電場(chǎng)電電壓升升高，，細(xì)胞胞膜被被壓縮縮變薄薄，當(dāng)當(dāng)膜電電壓升升到一一定數(shù)數(shù)值時(shí)時(shí)，膜膜被擊擊穿。?？赡鎿魮舸海簱舸┐┬】卓卓稍谠谝欢ǘ〞r(shí)間間內(nèi)復(fù)復(fù)原。。不可逆逆擊穿穿：擊擊穿小小孔不不可修修復(fù)，，處理理細(xì)胞胞成活活率低低。操作程程序：：將盛有有細(xì)胞胞和DNA混合物物的特特制小小容器器置于于電脈脈沖儀儀的正正負(fù)極極之間間，在在0度下加高高壓（（2～4KV）），電脈沖沖10分鐘鐘后，，將待待處理理的細(xì)細(xì)胞轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到到新鮮鮮培養(yǎng)養(yǎng)基中中生長(zhǎng)長(zhǎng)2天天，再再進(jìn)行行篩選選。存存活細(xì)細(xì)胞的的回收收率約約為60%～80%。（3）微注注射法法（micro-injection）微量注注射：：用注注射針針或微微針在在受體體細(xì)胞胞或組組織穿穿刺成成孔，，DNA隨穿刺刺孔進(jìn)進(jìn)入細(xì)細(xì)胞或或隨穿穿刺針針頭——道進(jìn)進(jìn)入。。真正的的顯微微注射射：利利用顯顯微注注射儀儀，通通過(guò)機(jī)機(jī)械方方法把把外源源DNA直接注入細(xì)胞胞質(zhì)或細(xì)胞核核的基因轉(zhuǎn)化化方法。顯微注射技術(shù)術(shù)的關(guān)鍵是原原生質(zhì)體或具具壁細(xì)胞或細(xì)細(xì)胞團(tuán)的固定定。對(duì)于植物物細(xì)胞而言，，首先必須建建立固定細(xì)胞胞技術(shù)，然后后才能進(jìn)行定定位顯微注射射操作。常用用的細(xì)胞固定定方法有3種種：一、瓊脂糖包包埋法二、多聚賴氨氨酸粘連法三、吸管支持持法（4）激光微束法法(lasermicrobeam)（5）超聲波法此方法是利用用直徑很小、、能量很高的的激光微束引引起細(xì)胞膜可可逆性穿孔的的原理，在熒熒光顯微鏡下下找出合適的的細(xì)胞，然后后用激光光源源代替熒光光光源，聚焦后后發(fā)出激光微微束脈沖，造造成膜穿孔，，處于細(xì)胞周周?chē)耐庠碊NA分子隨之進(jìn)入入細(xì)胞?；驹恚菏鞘抢玫吐晱?qiáng)強(qiáng)脈沖超聲波波的物理作用用，擊穿細(xì)胞胞膜造成通道道，使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。利用超聲波處理可可避免脈沖高高壓對(duì)細(xì)胞的的損傷作用，，有利于原生生質(zhì)體的存活活，是一種有有潛力的轉(zhuǎn)化化途徑。（6）離子束法離了束作用在在生物表面后后可引起電子子濺射，離子子束的濺射好好象一把手術(shù)術(shù)刀，對(duì)生物物體進(jìn)行微細(xì)細(xì)加工，使生生物體表面層層層剝離，原原來(lái)不連通的的通道在一定定距離內(nèi)連通通，后來(lái)的離離子就可穿行行較長(zhǎng)的距離離，落在預(yù)定定的位置上。。2．化學(xué)方法（1）PEG法是細(xì)胞融合劑劑，它可以使使細(xì)胞膜之間間或DNA與膜之間形成成分子橋，促促使相互之間間的接觸和粘粘連；還可以以引起膜表面面電荷的紊亂亂，干擾細(xì)胞胞間的識(shí)別，，從而有利于于細(xì)胞膜之間間的融合和外外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體體。(2)脂質(zhì)體體法脂質(zhì)體是由人人工構(gòu)建的磷磷脂雙分子層層組成的膜結(jié)結(jié)構(gòu)，可將DNA包在其內(nèi)，并并通過(guò)脂質(zhì)體體與原生質(zhì)體體的融合或由由于原生質(zhì)體體的吞噬過(guò)程程，把外源DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)內(nèi)。早期：絲氨酸酸磷酸+膽固固醇第二代：二油油酰乙醇胺磷磷脂+膽固醇醇+軟脂酸3、種質(zhì)系統(tǒng)法(germlinetransformationsystem)（1）花粉管通道道法（pollen-tubepathway）在顯花植物中中利用花粉在在柱頭上萌