小鼠糞便細(xì)菌基因組DNA提取方法比較

小鼠糞便細(xì)菌基因組DNA提取方法比較張杰;張曉鵬;李鵬高;趙志強【摘要】TwopretreatmentmethodsofgrindingandboilingandtwoextractionmethodssuchastheimprovedCTABmethodandthekitmethodarecombinedrespectivelytocomparetheeffectofextractingbacterialgenomicDNAfromthemousefeces.TheresultsshowthattheconcentrationandpurityofthegenomicDNAextractedfromthemilledpretreatedsamplesarehigherthanthoseobtainedbytheboilingpretreatedsamples,theintegrityoftheDNAextractedbythegrindingcombinedwiththemodifiedCTABmethodisbetterthanthatbyothermethods,andthegrindingcombinedwiththemodifiedCTABmethodisapracticalandreliablemethodforextractingthegenomicDNAfromthefecalbacteria.%分別將研磨、水煮兩種預(yù)處理方法和改良CTAB法、試劑盒法兩種提取方法進行組合，比較提取小鼠糞便細(xì)菌基因組DNA的效果.結(jié)果發(fā)現(xiàn),研磨預(yù)處理過的樣品提取到的細(xì)菌基因組DNA的濃度和純度均高于水煮預(yù)處理過的樣品,研磨結(jié)合改良CTAB法提取到的DNA完整性好于其他方法,研磨結(jié)合改良CTAB法是一種提取糞便細(xì)菌基因組DNA較為實用可靠的方法.【期刊名稱】《實驗技術(shù)與管理》【年(卷)，期】2017(034)012【總頁數(shù)】5頁(P50-53,57)【關(guān)鍵詞】糞便;細(xì)菌基因組DNA;提取方法【作者】張杰漲曉鵬;李鵬高;趙志強【作者單位】首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院臨床流行病學(xué)北京市重點實驗室，北京100069;首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院臨床流行病學(xué)北京市重點實驗室，北京100069;首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院臨床流行病學(xué)北京市重點實驗室，北京100069;首都醫(yī)科大學(xué)信息中心，北京100069【正文語種】中文【中圖分類】Q933腸道是哺乳動物體內(nèi)最大的消化器官，其中含有數(shù)量巨大的細(xì)菌菌群，形成了極其復(fù)雜的細(xì)菌微生態(tài)系統(tǒng)，腸道微生態(tài)系統(tǒng)中的菌群結(jié)構(gòu)、數(shù)量和種類的變化與機體的健康和疾病有著密切的關(guān)系［1-2］。糞便的主要成分是微生物的菌體和食物殘渣,其中包含著重要的腸道微生物信息，可以間接地反映腸道微生物的變化情況。近年來隨著分子生物學(xué)研究和技術(shù)的發(fā)展，利用分子生物學(xué)技術(shù)和方法從糞便中提取腸道微生物總DNA，并對相關(guān)疾病進行研究取得了許多突破［3-4］。但是糞便中含有的成分非常復(fù)雜，其中含有的色素、多糖和纖維素等物質(zhì)對TaqDNA聚合酶有抑制的作用；脂類、酸類、多酚等有機物在DNA提取過程中很難去除，這些雜質(zhì)不但易導(dǎo)致目標(biāo)DNA的降解，還直接影響到后續(xù)研究的準(zhǔn)確性。因此，以糞便為標(biāo)本提取細(xì)菌基因組DNA進行腸道微生態(tài)研究的關(guān)鍵是能否提取到高質(zhì)量的糞便細(xì)菌基因組DNA［5］。本研究是在已有報道的基礎(chǔ)上比較幾種小鼠糞便細(xì)菌基因組DNA提取方法，旨在保證提取效率的同時得到高質(zhì)量的細(xì)菌基因組DNA,為腸道微生態(tài)系的研究提供實驗基礎(chǔ)。樣品的采集與儲存:BALB/C清潔級小鼠由首都醫(yī)科大學(xué)動物中心提供,3周齡，體重18-22g,直接從小鼠肛門處收集糞便于1.5mL的無菌管中，放入-80°C保存,備用。試劑:三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE,國產(chǎn)）；十二烷基磺酸鈉（SDS,國產(chǎn)）；核糖核酸酶A（RNaseA,Promega公司）；蛋白酶K（Promega公司）；氯化鈉（NaCL,國產(chǎn)）；十六烷基三甲基漠化銨（CTAB,國產(chǎn)）；氯仿（國產(chǎn)分析純）；異丙醇（國產(chǎn)分析純）；Tris酚（國產(chǎn)）；異戊醇（國產(chǎn)分析純）；無水乙醇（國產(chǎn)分析純）；ADNA/HindmDNAMarker（TIANGEN公司）；100bpDNAladderMarker（TIANGEN公司）；Gel-Red核酸染料（Sigma公司）；瓊脂糖（Sigma公司）；熒光定量PCR試劑盒（ABI公司）；引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）；糞便細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型TIANampStoolDNAKit,TIANGEN公司）。儀器:Q5Real-timePCR擴增儀（ABI公司）；電泳儀（Bio-Rad公司）；高速冷凍離心機（Eppendorf公司）；NanoDrop2000紫外分光光度儀（Thermo公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（VILBERLOURMA公司）；漩渦混合器（國產(chǎn)）；電熱恒溫水浴鍋（國產(chǎn)）。方法1——研磨:稱取0.1g小鼠糞便放入滅菌研缽中，在冰上徹底研碎,然后加入1mL無菌雙蒸水徹底重懸,10000r/min、離心10min，取上清待用。方法2——水煮:在0.1g小鼠糞便中加入1mL無菌雙蒸水于1.5mL的EP管中，浸泡10min后充分振蕩搖勻15s；將管放置100C水浴10min；冷卻后10000r/min、離心10min，取上清待用。（1）改良CTAB方法：參照文獻(xiàn)［6］（有改動），分別在預(yù)處理過的500"樣品中加入30|jL、10%SDS,3pL蛋白酶K（20g/L）,4pLRNaseA后混勻,37C水浴1h；每管中加入100pLNaCL（5mol/L）,顛倒混勻后加入80pL的CTAB/NaCL（10%CTAB,0.7mol/LNaCL）,輕輕混勻；放入65C水浴10min；加入等體積酚/氯仿/異戊醇（比例為25:24:1）混合液，混勻后12000r/min、離心10min,取上清；上清液中加入0.6倍體積的異丙醇，輕輕混勻,12000r/min、離心10min,棄上清；沉淀用1mL預(yù)冷的75%乙醇洗滌后,7500r/min離心5min,棄乙醇，在潔凈工作臺中稍加干燥，溶于30pLTE緩沖液中。（2）試劑盒方法：將預(yù)處理好的樣品，分別按照糞便細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）說明書的步驟進行提取。2.3.1細(xì)菌基因組DNA純度和濃度測定分別取2pL提取到的細(xì)菌基因組DNA,在NanoDrop2000紫外分光光度儀上檢測DNA的質(zhì)量濃度及DNA的A260/A280比值。2.3.2細(xì)菌基因組DNA完整性測定分別取5pL提取到的DNA于含Gel-Red核酸染料的0.8%瓊脂糖凝膠中電泳,工作電壓120V,50min后置于凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察、分析結(jié)果。2.3.3熒光定量PCR反應(yīng)使用細(xì)菌16SrDNA基因V3區(qū)特異性引物338-F:5’-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3',548-R:5'-AATACGGAGGGTGCAAGCGT-3’，以提取到的小鼠糞便細(xì)菌基因組DNA為模板，進行細(xì)菌16SrDNA基因熒光定量PCR擴增，每個樣本設(shè)置3次重復(fù)，同時設(shè)置不添加模板的陰性對照組。根據(jù)PowerSYBRGreenmastermix說明書配置熒光定量PCR反應(yīng)體系20pL。反應(yīng)條件：95°C、10min,95°C、15s,58°C、30s、72°C,30s,40個循環(huán);反應(yīng)完成后利用熔解曲線分析產(chǎn)物的特異性，觀察其擴增曲線以及記錄Ct值（反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）；擴增產(chǎn)物在含Gel-Red核酸染料的1%瓊脂糖凝膠中電泳（電壓100V,50min）,結(jié)果于凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察、分析。采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。結(jié)果見表1。由表1可知：采用相同預(yù)處理方法的樣本，改良CTAB法提取到的DNA質(zhì)量濃度c（DNA）明顯高于試劑盒法提取到的；對于采用相同的提取方法、不同預(yù)處理方法的樣本提取到的DNA質(zhì)量濃度不同，與水煮法相比，研磨法能顯著提高小鼠糞便細(xì)菌基因組的c(DNA)；不同方法提取到的細(xì)菌基因組DNA質(zhì)量濃度之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。A260/A280比值是判斷核酸純度的常用指示值,A260代表核酸的吸光度值A(chǔ)280代表蛋白質(zhì)的吸光度值。A260/A280的比值在1.6~1.8之間表示DNA的純度較?,A260/A280<1.6說明樣品中有蛋白質(zhì)污染,A260/A280>1.8說明樣品中有RNA污染。理論上純化的DNA的A260/A280比值在1.8左右。測定結(jié)果表明：相同提取方法，經(jīng)過研磨預(yù)處理后提取到的細(xì)菌基因組的DNA純度好于水煮預(yù)處理的樣本；采用相同預(yù)處理方法,試劑盒法提到的細(xì)菌基因組DNA純度高于改良CTAB法提取到的，但是兩者之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P20.05)。通過瓊脂糖凝膠電泳圖(見圖1)可見:不同方法提取到的DNA均在23kb左右處有清晰條帶；相同預(yù)處理方法的樣品，改良CTAB法提取到的小鼠糞便細(xì)菌基因組DNA條帶較亮；采用相同DNA提取方法，水煮法預(yù)處理過的樣本提取到的細(xì)菌基因組DNA有明顯的拖帶，說明提取到的DNA發(fā)生了降解,DNA分子的完整性變差。利用不同方法提取到的糞便細(xì)菌基因組DNA為模板，采用相同DNA模板量對細(xì)菌16SrDNA基因進行熒光定量PCR擴增。PCR擴增的溶解曲線上顯示每個樣品擴增的16SrDNA基因均為單一峰，特異性較好(見圖2)。圖3的PCR擴增曲線顯示：以研磨結(jié)合改良CTAB法提取到的DNA為模板擴增細(xì)菌16SrDNA基因得到的Ct值最低，與水煮結(jié)合改良CTAB法提取到的DNA擴增得到的Ct值相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),具體結(jié)果見表2。對熒光定量PCR的擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測表明:擴增產(chǎn)物均可以在200bp左右看到細(xì)菌16SrDNA基因的特異性擴增片段，且無干擾性雜帶，重復(fù)性好(見圖4)；研磨結(jié)合CTAB法獲得的DNA擴增產(chǎn)物條帶最亮；經(jīng)過水煮法預(yù)處理的樣品不同提取方法提取到的DNA擴增后的產(chǎn)物條帶均較暗，說明經(jīng)過水煮預(yù)處理的樣品提取到的細(xì)菌基因組DNA濃度較低，質(zhì)量較差。從糞便中有效地提取到高質(zhì)量的細(xì)菌基因組DNA是研究腸道微生態(tài)的基礎(chǔ)和前提。目前，從糞便標(biāo)本中提取細(xì)菌DNA的方法眾多,由于提取機理和步驟的差別，獲得DNA的濃度和純度各不相同，導(dǎo)致在后續(xù)實驗，如PCR擴增、DNA測序等的應(yīng)用效果不同［5-7］。理想的基因組DAN提取方法既要好的DNA的獲得率，又要盡可能地減少DNA的降解［8］。高效穩(wěn)定的細(xì)菌基因組DNA提取方法對后續(xù)分子生物學(xué)的研究有著重要的意義［9］。本實驗的實驗結(jié)果顯示:經(jīng)過不同預(yù)處理的樣本，采用相同的細(xì)菌基因組DNA提取方法提取到的DNA質(zhì)量濃度不同，研磨預(yù)處理后提取到的細(xì)菌基因組DNA質(zhì)量濃度明顯高于經(jīng)水煮后提取到的DNA質(zhì)量濃度。有文獻(xiàn)報道機械破壁對厚壁菌門的破壁效果要優(yōu)于傳統(tǒng)的酶解作用［10］,研磨可以較為徹底地破壞細(xì)菌細(xì)胞壁,使細(xì)胞充分裂解，使更多的DNA游離出來。水煮法是利用物理方法處理蛋白質(zhì)，使其與核酸分離，但是在加熱過程中菌體破裂的比例較小，而且煮沸過程中部分DNA發(fā)生降解［11-12］,所以提取到的DNA質(zhì)量濃度較低。因此研磨法與水煮法相比，研磨法是一種更為有效的提高糞便細(xì)菌基因組DNA濃度的方法。此外細(xì)菌16SrDNA基因熒光定量PCR擴增結(jié)果顯示，經(jīng)過水煮法預(yù)處理過的樣品，提取到的DNA完整性較研磨預(yù)處理后提取到的DNA差。已有的研究法發(fā)現(xiàn)［13］,采用水煮法雖然促使了細(xì)胞膜破裂,釋放出DNA，同時高溫使部分DNA斷裂成小片段。由水煮法處理過的DNA樣品不適用于限制性內(nèi)切酶切分析的實驗，只適用于對DNA要求不高的PCR和RAPD等實驗。由此可知小鼠糞便細(xì)菌基因組DNA提取時研磨預(yù)處理方法優(yōu)于水煮預(yù)處理方法。把經(jīng)過相同預(yù)處理的樣本，采用不同提取方法提取到的細(xì)菌基因組DNA進行綜合比較發(fā)現(xiàn):改良CTAB方法提取到的DNA質(zhì)量濃度明顯高于試劑盒法提取到的DNA質(zhì)量濃度；改良CTAB方法的DNA純度低于試劑盒法提取到的DNA純度。試劑盒的方法操作簡單、用時短，提取到的DNA質(zhì)量穩(wěn)定，但是熒光定量PCR的擴增效果比改良CTAB法的差，而且試劑盒價格較貴,使用次數(shù)有限，試劑盒的質(zhì)量因不同廠家和批次也會有所差異，不適合大量樣本的糞便細(xì)菌基因組DNA的提取。改良的CTAB方法提取到的細(xì)菌基因組DNA條帶完整、較亮，沒有明顯的降解和蛋白質(zhì)污染；以此為模板進行細(xì)菌16SrDNA基因熒光定量PCR擴增，擴增產(chǎn)物條帶清晰，說明改良的CTAB方法提取到的小鼠糞便細(xì)菌基因組DNA能夠滿足下游分子生物學(xué)研究的需要。而且改良CTAB方法在原有的方法上，簡化了操作步驟，減少了有機試劑的使用，縮短了實驗時間，實驗時不需要特殊的儀器設(shè)備，成本較低，適用于大樣本量的糞便細(xì)菌基因組DNA的提取。綜上所述，研磨預(yù)處理方法結(jié)合改良CTAB法是一種提取糞便細(xì)菌基因組DNA較為實用可靠的方法，可以為腸道微生態(tài)的大樣本量研究提供幫助?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】騫宇，趙欣.大鼠糞便中細(xì)菌基金組DNA提取方法的比較[J].食品工業(yè)科技,2014，35(4):166-169.郭政宏，舒邦杰,嚴(yán)亨秀，等.藏山羊糞便總DNA不同提取方法的比較[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016(7):93-96.GerritsenJ,SmidtH,RijkersGE.etal.Intestinalmicrobiotainhumanhealthanddisease:Theimpactofprobiotics[J].Genes&Nutrition,2011,6(3):209-240.吳敏娜，武亞琦，屈艷，等.四種小鼠腸道微生物DNA提取方法比較[J].生態(tài)學(xué)雜志,2015，34(4):1183-1188.鄭吉順，周翔天,陳萌萌，等.介紹一種改良的糞便細(xì)菌基因組DNA提取試驗方法[J].安徽醫(yī)藥,2014，18(1):52-55.宮強，關(guān)道明,王耀兵，等.大腸桿菌總DN