頭孢他啶治療下尿路及男性生殖系感染的療效觀察

1、頭孢他啶治療下尿路及男性生殖系感染的療效觀察 作者：張業(yè)旺 譚強 劉瑞江 徐秀泉 徐希明【摘要】 6?舶被?青霉烷酸(6?APA)是重要的抗生素藥物中間體之一，目前均采用青霉素?；该复倭呀馇嗝顾孬@得。本文介紹近年來青霉素酰化酶催化青霉素水解的研究進展，青霉素?；傅男再|(zhì)及其催化機理，青霉素?；傅墓潭ɑ椒?，青霉素酰化酶反應(yīng)器的設(shè)計，反應(yīng)介質(zhì)工程的研究進展。 【關(guān)鍵詞】 青霉素?；福?6?APA； 雙水相系統(tǒng)； 水?燦謝?相系統(tǒng)； 離子液體； 反應(yīng)器設(shè)計 ABSTRACT As an important pharmaceutical intermediate in the producti

2、on of ?lactam antibiotics, 6?aminopenicillanic acid is the product from enzymatic hydrolysis of penicillin with penicillin acylase. In this article, the recent development concering with the preparation of 6?APA by hydrolysis of penicillin, catalytic mechanism of penicillin acylase, immobilization t

3、echniques and their carriers, two?phase system for hydrolysis of penicillin, the design and optimization of bioreactor are reviewed. KEY WORDS Penicillin acylase; 6?APA; Aqueous two phase system; Biphasic system; Liquid inions; Design of reactor 青霉素?；?penicillin acylase，penicillin amidase，penicilli

4、n amidohydralse，EC 3.5.1.11)可以裂解青霉素獲得重要的醫(yī)藥原料6?舶被?青霉烷酸(6?APA)。在自然界中來源廣泛，細菌、放線菌、酵母和高等真菌都可以產(chǎn)生青霉素?；?。盡管有報道推測青霉素酰化酶是在代謝芳香族化合物作為碳源的過程中具有一定的作用2，但產(chǎn)生的機理仍未明確。論文論文參考網(wǎng)隨著工業(yè)化進程的發(fā)展，環(huán)境污染的加重，生物催化綠色浪潮隨之興起，青霉素酰化酶的應(yīng)用越來越廣泛，圍繞著青霉素?；该复倭呀馇嗝顾刂苽??APA的研究也備受關(guān)注，作為一種重要的工業(yè)酶，青霉素酰化酶在制備6?APA中的應(yīng)用已經(jīng)有近三十年的歷史了。本文對這一方向近年來的發(fā)展做一綜述。 1 酶的性

5、質(zhì)及其催化機理 根據(jù)青霉素?；冈诖呋夥磻?yīng)時所偏愛的底物不同，可將青霉素?；阜譃?類：青霉素G?；?、青霉素V?；负桶逼S西林?；?。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，自然界仍然存在其它種類的青霉素?；福鐝姆啪€菌Streptomyces lavendulae中分離到的青霉素?；缚梢运庖恍┨烊恢咀宓那嗝顾?，因此可以定義為青霉素K?；?。青霉素?；复呋獾牡孜锝Y(jié)構(gòu)非常相近，但是青霉素?；傅慕Y(jié)構(gòu)上差別較大。來源于大腸埃希菌(Escherichia coli)的青霉素G?；妇哂幸粋€20.3ku的亞基和一個68.4ku的亞基4。來源于球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)的青霉

6、素V?；甘撬膫€34.7ku亞基組成的四聚體。這兩類酶都是N末端親核水解酶的大家族成員5，6，N末端親核水解酶的共同點是在N末端具有催化殘基。雖然青霉素V?；傅挠H核殘基是絲氨酸，青霉素G酰化酶的親核殘基是半胱氨酸，但是它們的折疊卻是驚人的相似，都具有一個四層的催化活性核心結(jié)構(gòu)7。 Duggleby等4通過對來源于大腸埃希菌的青霉素G?；傅难芯堪l(fā)現(xiàn)，它具有唯一活性中心，兩個亞基緊密交織在一起，組裝成腎臟形，中間有一凹槽，雜二聚體的大小為7nm5nm5.5nm。兩者之間沒有明顯的分離區(qū)域，亞基之間接觸角痕大，20%為疏水氨基酸，酶與苯乙酸、苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的結(jié)合部位位于底物側(cè)鏈的結(jié)

7、合部位。這些抑制劑的苯基部位直接伸到酶分子疏水袋。Met142，Phe146，Phe57，Trp154，Ile177位于疏水袋兩側(cè)，Ser67封住疏水袋的底部袋口，由Ser1和Asn241的側(cè)鏈和23，69的主鏈氮原子組成。McVey等8采用多底物競爭性抑制，用X晶體衍射測定了底物苯乙酸、3，4二羥基苯乙酸、2，5二羥基苯乙酸、p?蠶躉?苯乙酸等與青霉素酰化酶形成的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，這些復(fù)合物結(jié)構(gòu)揭示了底物結(jié)合區(qū)域構(gòu)象的變化可能作為酶自催化的開關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Arg 263參與了與底物的結(jié)合并協(xié)助Asn 241的定位，Phe 146是底物進入活性中心的開關(guān)，酶活性高度依賴于Asn 241，在催化中

8、心部位，241 Asn會導致形成氧陽離子的洞，而且對底物與Ser 1也起到定位的作用，所以準確地說，青霉素?；傅拇呋钚灾行氖荢er?Asn二聯(lián)體。青霉素?；傅乃馇嗝顾谿的機制是1995年由Duggleby等闡明4，其過程如圖1所示。青霉素?；钢饕善?慚腔?N?材慫堪彼岵謝?發(fā)揮水解?；饔?。酶促水解反應(yīng)是通過酶活性中心和底物分子形成一個四面體中間物進行的，四面體中磺酸基團與半縮醛非常相似。且這一四面體形成和解體是一個可逆的過程，羰基的質(zhì)子化使得其碳原子更容易受到親核進攻。?1?菜堪彼岵謝?的O處于利于進攻羰基碳原子的位置。 絲氨酸的O親核進攻青霉素G的酰胺鍵羰基碳原子后形成一個氧負

9、離子四面體中間物，通過23和69的主要酰胺基團及241 Asn側(cè)鏈的N相互作用從而保持穩(wěn)定，當釋放6?APA時，這個四面體中間物就發(fā)生解體。接著?；甘艿剿肿拥倪M攻而產(chǎn)生另一個四面體中間物，同樣通過23和69的主要酰胺基團與241Asn側(cè)鏈的N相互作用而穩(wěn)定，當苯乙酸被釋放時，同時這個四面體結(jié)構(gòu)發(fā)生解體。 2 青霉素?；傅墓潭ɑ?酶法生產(chǎn)6?APA大多采用固定化酶，固定化酶同游離酶相比具有明顯的優(yōu)點，比如高穩(wěn)定性，可以重復(fù)使用或者連續(xù)使用，容易從反應(yīng)液中分離，可以有效防止對產(chǎn)物的蛋白污染和微生物污染等。固定化酶的性 圖1 青霉素?；复呋馇嗝顾谿機理示意圖4質(zhì)取決于酶本身和固定化載體，

10、兩者相互作用賦予了固定化酶的生物化學、機械以及動力學等性質(zhì)9。酶的固定化方法主要有吸附法、共價耦聯(lián)法、包埋法和交聯(lián)法，這些方法在青霉素?；傅墓潭ɑ芯恐卸加脩?yīng)用，按照載體的類型主要分為有載體固定化和無載體固定化技術(shù)。 在有載體固定化技術(shù)中，由于吸附法特異性低，固定化酶的不夠穩(wěn)定，蛋白質(zhì)容易從載體上脫落，因此在青霉素?；傅墓潭ɑ惺褂迷絹碓缴佟Ｔ诠矁r耦聯(lián)法中，固定化載體是研究的核心內(nèi)容之一，Rhm公司在20世紀70年代推出的Eupergit C是最常用的環(huán)氧樹脂載體，青霉素?；冈谥行曰蛘邏A性的條件下通過親核攻擊使得酶的游離氨基同Eupergit C的環(huán)氧基相連9，獲得的固定化酶穩(wěn)定性很高，

11、可使用800批后仍具有60%的初始活性10。Sephabeads FP?EP是另一類環(huán)氧基載體，在結(jié)構(gòu)上同Eupergit C非常相似，表面的環(huán)氧基密度可高達100mol/ml，這樣酶和載體的相互作用很強，可以大大提高青霉素?；傅姆€(wěn)定性，在45下懸浮8d酶的活力沒有明顯損失11。Amberlite XAD?7是一種多孔聚甲基丙烯酯類樹脂，在激活后具有游離的醛基，可以同酶發(fā)生共價耦聯(lián)12。除了樹脂外，還有醛瓊脂糖凝膠13和明膠殼聚糖14也通常作為青霉素固定化的載體。青霉素?；冈跓o機載體如經(jīng)過活化的硅膠15，16、分子篩等介孔材料1719、硅藻土20等載體上的固定化研究也得到開展，在無機材料上

12、固定化的優(yōu)點是材料便宜易得。 青霉素?；敢部梢酝ㄟ^無載體的固定化技術(shù)來實現(xiàn)，交聯(lián)酶晶體(cross?linked enzyme crystals，CLECs)和交聯(lián)酶聚集體(cross?linked enzyme aggregates，CLEAs)是最常用的兩類固定化技術(shù)。交聯(lián)酶晶體一般分兩步進行，首先是將一定濃度的蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶，然后采用雙功能試劑如戊二醛將酶進行交聯(lián)，在固定化過程中結(jié)晶是獲得交聯(lián)酶晶體的關(guān)鍵。交聯(lián)酶晶體非常穩(wěn)定，青霉素酰化酶的交聯(lián)酶晶體在進行1000批反應(yīng)后仍然保留了70%的初始活性21。由于獲得青霉素酰化酶的晶體難度較大，所以交聯(lián)酶晶體的應(yīng)用受到一定的限制。Cao等22

13、分別采用硫酸銨、叔丁醇和PEG 8000做為沉淀劑，用戊二醛作為交聯(lián)劑制備了青霉素?；附宦?lián)酶聚集體，發(fā)現(xiàn)用叔丁醇做為沉淀劑獲得的交聯(lián)酶聚集體活性最高。Mateo等23采用聚醛葡聚糖作為交聯(lián)劑獲得了高活性的交聯(lián)酶聚集體。交聯(lián)酶晶體和交聯(lián)酶聚集體在有機介質(zhì)中表現(xiàn)出良好的活性，在非水相酶催化中具有良好的應(yīng)用前景，Sheldon在這方面做了詳細綜述24。 3 青霉素?；复呋a(chǎn)6?APA 6?APA是?材邗房股?素工業(yè)中的重要中間體，經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾可以獲得阿莫西林、氨芐西林等重要的抗生素藥物。1970年，Gist?Brocades(后為DSM的子公司)開始化學法生產(chǎn)6?APA，稱為“Delft裂解”

14、，這種化學工藝延續(xù)了1020年，由于使用了大量的有毒害試劑，而且需要-40的低溫，耗能嚴重，已經(jīng)被淘汰。目前，工業(yè)生產(chǎn)6?APA都已采用酶法裂解工藝，年產(chǎn)量已經(jīng)達到20000噸以上25。由于6?APA在?材邗房股?素工業(yè)中的重要作用及其巨大的市場，青霉素?；干a(chǎn)6?APA的新工藝和新技術(shù)不斷涌現(xiàn)。 3.1 兩相系統(tǒng)中裂解青霉素的研究 (1)水?燦謝?相系統(tǒng) 青霉素在發(fā)酵結(jié)束后，需要在有機溶劑體系中且較低pH2.05.5的條件下進行萃取后成鹽，通過結(jié)晶獲得青霉素的鉀鹽或者鈉鹽，再進行溶解后進行酶法裂解。由于這個過程需要進行成鹽結(jié)晶等復(fù)雜的操作，所以研究熱點集中于青霉素萃取后在低的pH下直接在兩

15、相系統(tǒng)中進行酶法裂解，大大簡化了操作工藝流程。兩相系統(tǒng)中青霉素G、6?APA和苯乙酸都會在兩相中進行分配，苯乙酸在有機溶劑中的分配系數(shù)受pH影響很大，所以青霉素的水解平衡依賴于pH。在低的pH下，苯乙酸很容易被萃取到有機相中，6?APA也可以得到結(jié)晶，導致產(chǎn)物的濃度不斷降低，使反應(yīng)向水解的方向進行，這樣可以獲得高的轉(zhuǎn)化率。在正丁醇?菜?雙相系統(tǒng)中進行青霉素G的酶水解，通過多級逆流萃取可以獲得較高收率26，在50mmol/L青霉素G的底物濃度，起始pH為2.9的條件下，6?APA收率可達94%27。pH較低時水解青霉素G將導致青霉素G和產(chǎn)物6?APA的降解；較高的pH則有利于青霉素G和6?APA

16、的穩(wěn)定，pH從3.5提高到5.5，6?APA的降解常數(shù)從8.410-3/h降低到3.610-3/h，半衰期從也從82h提高到192h。同時，青霉素?；冈趐H8.0附近時具有較高的活性，較低的pH并不利于發(fā)揮酶的最大催化效率。另外在雙相系統(tǒng)中萃取青霉素G的有機溶劑如正丁醇或甲基異丁基甲酮(MIBK)可導致酶的變性，在正丁醇飽和的水溶液下青霉素?；笐腋?2d活力下降了58%28。針對青霉素?；傅牟环€(wěn)定問題，采用反相膠團體系，將青霉素?；赴裨贏OT/異辛烷反膠團中，活力與水相相比有提高，水解6h后的轉(zhuǎn)化率可達70%以上29。采用親水化共價交聯(lián)技術(shù)將固定化青霉素?；高M行處理，在酶的周圍制造

17、一個親水的微環(huán)境30，這樣固定化青霉素酰化酶在有機溶劑中的穩(wěn)定性大大提高，選擇甲基異丁基甲酮作為兩相系統(tǒng)中的有機相，在32、pH8.0的條件下懸浮400h，活力僅損失15%，6?APA收率也可達到96%31?？梢灶A(yù)言，兩相系統(tǒng)的發(fā)展將會大大簡化青霉素酰化酶水解青霉素G的傳統(tǒng)工藝，使酶法生產(chǎn)6?APA的成本大大降低。 (2)濁點系統(tǒng) 非離子表面活性劑溶液與離子型表面活性劑溶液性質(zhì)不同，在達到一定的溫度或者有添加物存在的條件下，溶液會自動分相形成表面活性劑濃度很小的稀相(dilute phase)和富含表面活性劑的凝聚層相(surfactant?rich phase)，這個系統(tǒng)稱為濁點系統(tǒng)(clo

18、ud point system)32。采用表面活性劑Tergitol TMN?3形成濁點系統(tǒng)，在控制適當?shù)膒H3.06.0的條件下可以實現(xiàn)將青霉素和6?APA分配于稀相，苯乙酸可以直接提取到凝聚層相，緩解產(chǎn)物的抑制作用，提高6?APA的收率。同時，隨著表面活性劑量的增加，6?APA可以達到91%的收率33。Wang等34用搖瓶模擬了離散逆流反應(yīng)器中青霉素?；杆馇嗝顾氐膶嶒?，青霉素水解和苯乙酸提取可以同時進行。逆流作用形成pH梯度有利于青霉素水解過程的進行，但由于青霉素水解的最佳pH相對較高，產(chǎn)物萃取的最佳pH相對較低，所以要獲得一個具有較高產(chǎn)物濃度，又有較高收率的反應(yīng)是比較困難的。在濁點系

19、統(tǒng)中，影響反應(yīng)的主要因素有初始pH、底物濃度、表面活性劑與水溶液的比例以及固定化酶用量等。平衡pH受初始pH影響較大，對水?燦謝?相兩相系統(tǒng)來說，濁點系統(tǒng)中容易保持相對較高的pH，水相中產(chǎn)物6?APA的濃度較高35，同時青霉素?；冈谳^高的pH條件下也具有較高的穩(wěn)定性36。濁點系統(tǒng)作為新型反應(yīng)體系，具有使用的非離子表面活性劑是綠色溶劑，極性范圍較高，對于中度極性的產(chǎn)物或底物容易進行分離，容易回收利用，商品化非離子表面活性劑較多且價格相對較低37，故濁點系統(tǒng)在青霉素水解中具有一定的工業(yè)應(yīng)用前景38。 (3)雙水相體系 雙水相體系是指某些高聚物之間或者高聚物與無機鹽之間在水中以適當濃度溶解后形成的

20、互補相溶的兩相或者多相體系。雙水相體系已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物大分子物質(zhì)的分離純化，由于雙水相體系具有界面張力小，傳質(zhì)阻力小，能夠快速達到分離平衡，成相的高聚物通常采用PEG，PEG對于酶等生物活性物質(zhì)不存在破壞作用，利用底物、產(chǎn)物的相分配系數(shù)不同來消除產(chǎn)物抑制，提高收率等優(yōu)點，已經(jīng)在生物催化領(lǐng)域得到重視，在生物分離領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。1984年，Andersson等39最早將雙水相體系應(yīng)用于青霉素的酶法水解，在8.9% PEG 20000和7.6%磷酸鉀兩相系統(tǒng)中研究了青霉素?；杆馇嗝顾?，并對酶進行了多次回收使用。利用PEG20000和Dextran T70構(gòu)成的雙水相系統(tǒng)，37條件下，

21、6?APA收率高于90%，由于6?APA可直接從上相進行結(jié)晶，簡化了后期分離純化工藝，最終得到96%純度的6?APA40。采用全細胞青霉素?；复呋馇嗝顾谿可以在PEG6000和磷酸鉀構(gòu)成的雙水相體系中進行，細胞和底物分配在下相，產(chǎn)物都分配在上相，酶無需純化，產(chǎn)物對酶活的抑制作用降低，有效降低生產(chǎn)成本。轉(zhuǎn)化10批次以上細胞的青霉素酰化酶酶活力才開始降低41，全細胞催化制備催化劑比較簡單，但缺點是催化劑的壽命較短，不能長期使用。最近，金科銘等42，43研究了在兩種高聚物(PADB對pH敏感，PNBC對光敏感)中青霉素G的水解，雖然6?APA的收率僅為85%左右，但是由于成相聚合物在反應(yīng)后通過

22、光照和pH變化進行回收，回收率達到了95%98%，這樣降低了成本，使雙水相系統(tǒng)在生產(chǎn)6?APA工藝中極具競爭力。論文參考網(wǎng) 3.2 離子液體系統(tǒng)中裂解青霉素的研究 離子液體是指在室溫或者接近室溫時完全由離子組成的液體物質(zhì)44。離子液體由于沒有蒸氣壓，所以不揮發(fā)，具有較好的熱穩(wěn)定性。一般由有機陽離子和無機陰離子構(gòu)成，改變陰陽離子的組成，可以合成不同性質(zhì)的離子液體。作為一種綠色溶劑，離子液體最近受到廣泛關(guān)注，已經(jīng)作為反應(yīng)介質(zhì)應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化4446。離子液體作為介質(zhì)的生物催化主要以脂肪酶為模型來催化轉(zhuǎn)酯、酯化、水解和氨解等反應(yīng)4749。近來在制備6?APA也有應(yīng)用，采用長鏈咪唑類離子液體C14mim

23、Cl(1?彩?四烷基?3?布諄?咪唑氯鹽)形成反膠團溶液，進行青霉素G酶法水解的研究，發(fā)現(xiàn)在不加底物的情況下，在pH7.0時，離子液體對青霉素?；傅娜芙庑允荂TAB陽離子表面活性劑構(gòu)成的反膠團溶液的2.3倍，酶活力和穩(wěn)定性也比在CTAB膠團溶液高50。Zhang等51制備了六氟化磷鹽bmimPF6、1?捕?3?布諄?咪唑的四氟化硼鹽bminBF4、二氰氨基合1一甲基一3一丁基咪唑bmimdca、omimBF4四種離子液體，在這四種離子液體與水形成的兩相溶液中進行青霉素G的水解，發(fā)現(xiàn)在bmimPF6中酶具有較高的穩(wěn)定性且具有較高的轉(zhuǎn)化率。Basso等52在控制水活度的條件下，研究了青霉素?；?/p>

24、在由兩種陽離子omim、bmim和三種陰離子BF4-、PF6-、CH3OSO3-構(gòu)成六種不同的離子液體中的穩(wěn)定性， 發(fā)現(xiàn)青霉素?；冈趏mimPF6-中有較好的穩(wěn)定性，而且酶的穩(wěn)定性受陰離子的影響較大。 3.3 反應(yīng)器及其它技術(shù) 選擇合適的反應(yīng)器，對提高6?APA的產(chǎn)量和質(zhì)量非常重要。固定化青霉素酰化酶反應(yīng)器通常有攪拌釜式、柱式填充床、中空纖維膜、電滲析耦合反應(yīng)器等，各自特點和優(yōu)缺點在龔俊波等的綜述53中已經(jīng)詳細敘述，在此不再贅述。本文就青霉素酰化酶反應(yīng)器中采用的相關(guān)技術(shù)做一簡單介紹。在電滲析耦合反應(yīng)器中，通過電滲析將產(chǎn)物苯乙酸和6?APA同反應(yīng)溶液分離，降低產(chǎn)物抑制作用，使得水解反應(yīng)速率提高

25、了近兩倍，青霉素G的轉(zhuǎn)化率從94.8%提高到96.1%54。膜分離也是酶法生產(chǎn)6?APA的主要技術(shù)之一，采用耦聯(lián)超濾膜反應(yīng)器進行青霉素G的酶法水解是可行的55，但是耦合膜反應(yīng)器或者僅僅采用膜反應(yīng)器的效果并不理想，特別是在高濃度底物的條件下，轉(zhuǎn)化率較低，膜的成本也較高，所以出現(xiàn)了電膜反應(yīng)器或者將膜反應(yīng)器與電滲析相耦聯(lián)的技術(shù)。Pribyl等56采用離子交換膜設(shè)計了電膜反應(yīng)器，發(fā)現(xiàn)在優(yōu)化條件下相對產(chǎn)率可以提高80%57，該反應(yīng)器可以用于青霉素G的連續(xù)水解中58。 產(chǎn)量超過85%的6?APA主要是采用青霉素G?；杆馇嗝顾谿得到的。但Shewale59指出，如果采用青霉素V酰化酶水解青霉素V來獲得6

26、?APA，則具有更大的優(yōu)勢，因為青霉素V在低pH條件下比青霉素G更穩(wěn)定，能夠避免青霉素V在較低pH條件下從發(fā)酵液中提取時所產(chǎn)生的降解；而且青霉素V?；副惹嗝顾谿酰化酶具有更廣泛的pH適應(yīng)性和更高的穩(wěn)定性，在水解反應(yīng)中還可以得到更高的收率。 4 結(jié)語 由于青霉素類抗生素藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，青霉素?；冈卺t(yī)藥工業(yè)中的重要作用將越來越大。因此，對反應(yīng)器和反應(yīng)介質(zhì)的優(yōu)化和創(chuàng)新的研究將會推動6?APA的生產(chǎn)。篩選性能更優(yōu)越的青霉素?；府a(chǎn)生菌株，進行發(fā)酵工藝優(yōu)化獲得高產(chǎn)也是其中的一個發(fā)展方向6062。隨著酶生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，獲得的青霉素?；阜€(wěn)定性的不斷提高，兩相系統(tǒng)勢必會在工業(yè)中得到應(yīng)用，將導致6

27、?APA的生產(chǎn)成本大大降低。由于6?APA的巨大產(chǎn)量，生產(chǎn)工藝中技術(shù)的任何革新都將給生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟效益。我國是6?APA的生產(chǎn)大國，在生產(chǎn)6?APA的工藝和青霉素?；干掀惹行枰訌娧芯坎⑥D(zhuǎn)化為生產(chǎn)力，這將有利于我國社會經(jīng)濟的發(fā)展?！緟⒖嘉墨I】 1 Sudhakaran V K, Borkar P S. Phenoxymethyl penicillin acylase: Sources and study?A sum up J. Hin Antibiot Bull,1985,27(14):4445.2 Valle F, Balbas P, Merino E, et al. The role

28、 of penicillin amidases in nature and in industry J. Trends Biochem Sci,1991,16(1):3640.3 Arroyo M, Torres?Guzman R, Torres?Bacete J, et al. Chromogenic analogues of penicillin dihydroF and penicillin K for the continuous spectrophotometric determination of aliphatic penicillin acylase activity J. B

29、iotechnol Lett,2002,24(13):10451048.4 Duggleby H J, Tolley S P, Hill C P, et al. Penicillin acylase has a single?amino?acid catalytic center J. Nature,1995,373(6511):264268.5 Suresh C G, Pundle A V, SivaRaman H, et al. Penicillin V acylase crystal structure reveals new Ntn?hydrolase family members J

30、. Nature Struct Biol,1999,6(5):414416.6 McVey C E, Walsh M A, Dodson G G, et al. Crystal structures of penicillin acylase enzyme?substrate complexes: Structural insights into the catalytic mechanism J. J Mol Biol,2001,313(1):139150.7 Oinonen C, Rouvinen J. Structural comparison of Ntn?hydrolases J.

31、Protein Sci,2000,9(12):23292337.8 Tischer W, Kasche V. Immobilized enzymes: crystals or carriers? J. Trends Biotechnol,1999,17(8):326335.9 Mateo C, Fernandez?Lorente G, Abian O, et al. Multifunctional epoxy supports: A new tool to improve the covalent immobilization of proteins. The promotion of phy

32、sical adsorptions of proteins on the supports before their covalent linkage J. Biomacromolecules,2000,1(4):739745.10 Katchalski?Katzir E, Kraemer D M. Eupergit (R) C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential J. J Mol Catal B?Enzym,2000,10(13):157176.11 Mateo C, Abian O, Fernan

33、dez?Lorente G, et al. Epoxy sepabeads: A novel epoxy support for stabilization of industrial enzymes via very intense multipoint covalent attachment J. Biotechnol Prog,2002,18(3):629634.12 Bianchi D, Golini P, Bortolo R, et al. Immobilization of penicillin G acylase on aminoalkylated polyacrylic sup

34、ports J. Enzyme Microb Technol,1996,18(8):592596.13 Guisan J M. Aldehyde?agarose gels as activated supports for immoblization?stablization of enzymes J. Enzyme Microb Technol,1988,10(6):375382.14 van Langen L M, Janssen M H A, Oosthoek N H P, et al. Active site titration as a tool for the evaluation

35、 of immobilization procedures of penicillin acylase J. Biotechnol Bioeng,2002,79(2):224228.15 Calleri E, Temporini C, Massolini G, et al. Penicillin G acylase?based stationary phases: Analytical applications J. J Pharm Biom Anal,2004,35(2):243258.16 Calleri E, Massolini G, Lubda D, et al. Evaluation

36、 of a monolithic epoxy silica support for penicillin G acylase immobilization J. J Chromatogr A,2004,1031(12):93100.17 Jing H, Li X F, Evans D G, et al. A new support for the immobilization of penicillin acylase J. J Mol Catal B?Enzym,2000,11(1):4553.18 高波，朱廣山，付學奇，等. 介孔材料的修飾及固定青霉素?；傅姆€(wěn)定性研究J. 高等學?；瘜W學

37、報，2006，27(10)：18231826.19 高波，朱廣山，付學奇，等. 不同介孔材料固定青霉素?；傅姆€(wěn)定性研究 J. 高等學?；瘜W學報，2005，26(10)：18521854.20 De Martin L, Ebert C, Garau G, et al. Penicillin G amidase in low?water media: immobilisation and control of water activity by means of celite rods J. J Mol Catal B?Enzym,1999,6(4):437445.21 Govardhan C

38、P. Crosslinking of enzymes for improved stability and performance J. Curr Opin Biotechnol,1999,10(4):331335.22 Cao L Q, van Rantwijk F, Sheldon R A. Cross?linked enzyme aggregates: A simple and effective method for the immobilization of penicillin acylase J. Org Lett,2000,2(10):13611364.23 Mateo C,

39、Palomo J M, van Langen L M, et al. A new, mild cross?linking methodology to prepare cross?linked enzyme aggregates J. Biotechnol Bioeng,2004,86(3):273276.24 Sheldon R A, Schoevaart R, Van Langen L M. Cross?linked enzyme aggregates (CLEAs): A novel and versatile method for enzyme immobilization (a re

40、view) J. Biocatal Biotransform,2005,23(34):141147.25 Kallenberg A I, van Rantwijk F, Sheldon R A. Immobilization of penicillin G acylase: The key to optimum performance J. Adv Synth Catal,2005,347(78):905926.26 den Hollander J L, Zomerdijk M, Straathof A J J, et al. Continuous enzymatic penicillin G

41、 hydrolysis in countercurrent water?butyl acetate biphasic systems J. Chem Eng Sci,2002,57(9):15911598.27 Diender M B, Straathof A J, van der Does T, et al. Equilibrium modeling of extractive enzymatic hydrolysis of penicillin G with concomitant 6?aminopenicillanic acid crystallization J. Biotechnol

42、 Bioeng,2002,78(4):395402.28 Ferreira J S, Straathof A J J, Franco T T, et al. Activity and stability of immobilized penicillin amidase at low pH values J. J Mol Catal B?Enzym,2004,27(1):2935.29 何志敏，郭從容，吳金川，等. 反膠團酶促水解青霉素G制備6?APA J. 中國抗生素雜志，1999，24(6)：404407.30 Abian O, Wilson L, Mateo C, et al. Prep

43、aration of artificial hyper?hydrophilic micro?environments (polymeric salts) surrounding enzyme molecules?New enzyme derivatives to be used in any reaction medium J. J Mol Catal B?Enzym,2002,19:295303.31 Abian O, Mateo C, Fernandez?Lorente G, et al. Improving the industrial production of 6?APA: enzy

44、matic hydrolysis of penicillin G in the presence of organic solvents J. Biotechnol Prog,2003,19(6):16391642.32 Saitoh T, Hinze W. Concentration of hydrophobic organic?compounds and extraction of protein using alkylammoniosulfate zwitterionic surfactant mediated phase separations (cloud point extract

45、ions) J. Anal Chem,1991,63(21):25202525.33 Wang Z, Guo Y, Bao D, et al. Direct extraction of phenylacetic acid from immobilised enzymatic hydrolysis of penicillin G with cloud point extraction J. J Chem Technol Biotechnol,2006,81(4):560565.34 Wang Z, Wang L, Xu J H, et al. Enzymatic hydrolysis of pe

46、nicillin G to 6?aminopenicillanic acid in cloud point system with discrete countercurrent experiment J. Enzyme Microb Technol,2007,41(12):121126.35 Wang L, Wang Z, Xu J H, et al. An eco?friendly and sustainable process for enzymatic hydrolysis of penicillin G in cloud point system J. Bioprocess Bios

47、yst Eng,2006,29(3):157162.36 郭雅靜，王志龍，包達，等 . 濁點系統(tǒng)中青霉素水解物系的分配及固定化青霉素酰化酶的穩(wěn)定性J. 化工學報，2006，57(6)：14221425.37 Wang Z. The potential of cloud point system as a novel two?phase partitioning system for biotransformation J. Appl Microbiol Biotechnol,2007,75(1):110.38 王麗，王志龍，包達，等. 非水相青霉素?；复呋磻?yīng)研究進展J. 中國抗生素雜志，2

48、006，31(9)：518524.39 Andersson E, Mattiasson B, Hahn?Haegerdal B. Enzymatic conversion in aqueous two?phase systems: Deacylation of benzylpenicillin to 6?aminopenicillanic acid with penicillin acylase J. Enzyme Microb Technol,1984,6(7):301306.40 Cao X J, Wu X Y, Fonseca L J P, et al. Production of 6?

49、aminopenicillanic acid in aqueous two?phase systems by recombinant Escherichia coli with intracellular penicillin acylase J. Biotechnol Lett,2004,26(2):97101.41 Liao L C, Ho C S, Wu W T. Bioconversion with whole cell penicillin acylase in aqueous two?phase systems J. Process Biochem,1999,34(5):41742

50、0.42 金科銘，曹學君，莊英萍，等. 固定化青霉素?；冈诠饷舾锌稍偕鷥伤囿w系中催化青霉素G為6?APAJ. 華東理工大學學報(自然科學版)，2007，33(3)：318322.43 金科銘，曹學君，莊英萍，等. 固定化青霉素酰化酶在光?pH敏感可回用兩水相中裂解青霉素G為6?APAJ. 中國生物工程雜志，2007，27(10)：5358.44 vanRantwijk F, Sheldon R A. Biocatalysis in Ionic Liquids J. Chem Rev,2007,107(6):27572758.45 Sheldon R A, Lau R M, Sorgedra

51、ger M J, et al. Biocatalysis in ionic liquids J. Green Chem,2002,4(2):147151.46 Sheldon R A, van Rantwijk F, Lau R M. Biotransformations in ionic liquids: An overview M. Ionic Liquids As Green Solvents: Progress And Prospects. vol. 856. Washington: American Chemical Society,2003:192205.47 Lau R M, v

52、an Rantwijk F, Seddon K R, et al. Lipase?catalyzed reactions in ionic liquids J. Org Lett,2000,2(26):41894191.48 Park S, Kazlauskas R J. Improved preparation and use of room?temperature ionic liquids in lipase?catalyzed enantio?and regioselective acylations J. J Org Chem,2001,66(25):83958401.49 Schofer S H, Kaftzik N, Kragl U, et al. Enzyme catalysis in ionic liquids: lipase catalysed kinetic resolution of 1?phenylethanol with improved enantioselectivity J. Chem Comm,2001,2001(5):425426.50 夏寒松，余江，劉會洲. 離子液體反膠團中青霉素酰化酶的水解反應(yīng)特性J. 化工學報，2005，56(10)：19321935.51 Zh