蛋白質分子設計簡課件

第二章

蛋白質分子設計

ChaptertwoProteinDesign

.第二章蛋白質分子設計

Chaptertwo1引言在人體的進化過程中蛋白質執(zhí)行了在人體及體外的許多重要任務：酶是催化化學反應的蛋白質或者核酸分子；抗體起到防護的作用;……從生態(tài)角度，蛋白質也是非常理想的物質:生物合成不需要消耗很多能量專一性很強不產生副作用并且能很快降解.引言在人體的進化過程中蛋白質執(zhí)行了在人體及體外的許多重要任務2蛋白質沒有像化學試劑那樣被普遍應用，其原因:(1)蛋白質分子量非常大(10000-1000000)，不能通過化學方法生產;(2)蛋白質的功能是在生理條件下?lián)]發(fā)的，在其它條件下(如在有機溶劑中)是不穩(wěn)定的;(3)專一性致使其應用范圍受到影響。

蛋白質應用受限的原因.蛋白質沒有像化學試劑那樣被普遍應用，其原因:蛋白質應用受限的3蛋白質設計目前存在的問題1、與天然的蛋白質比較，缺乏結構的獨特性及明顯的功能優(yōu)越性2、三級結構的確定性較差.蛋白質設計目前存在的問題.4計算機模擬突變蛋白質產品功能分析基因構建Pr設計循環(huán)第一節(jié)蛋白質分子設計原理.計算機模擬突變蛋白質產品功能分析基因構建Pr設計循環(huán)第一節(jié)5一、蛋白質分子設計的分類設計的目的主要有兩個：

一是為有目的的蛋白質工程改造提供設計方案和指導性信息，如以此提高蛋白質的熱、酸穩(wěn)定性，增加活性，降低副作用，提高專一性等；

二是探索蛋白質的折疊機理，如簡單蛋白質骨架的從頭設計是研究蛋白質內相互作用力的類型及本質的很好途徑，也為解決蛋白質折疊問題尋找定性和定量的規(guī)律。.一、蛋白質分子設計的分類設計的目的主要有兩個：.6（一）蛋白質分子設計的層次分為兩個層次：

一是在蛋白質三維結構已知基礎上的分子設計；二是在三維結構未知的情況下，借助一級結構序列信息及生物化學性質進行分子設計工作。.（一）蛋白質分子設計的層次分為兩個層次：.7（二）蛋白質分子設計的分類1．定點突變或化學修飾法2．拼接組裝設計法3．從頭設計全新蛋白質.（二）蛋白質分子設計的分類1．定點突變或化學修飾法.8二、蛋白質分子設計的原則1．活性設計2．對專一性的設計3．Scaffold設計(框架)4．疏水基團與親水基團需合理分布5．最優(yōu)的氨基酸側鏈幾何排列.二、蛋白質分子設計的原則1．活性設計.9

蛋白質分子設計原理內核假設。蛋白質的獨特的折疊形式是由蛋白質內核中殘基的相互作用決定。（內部十分保守的區(qū)域）Pr內部都是密堆積（很少有空穴大到水分子可以結合一個水分子或惰性氣體），沒有重疊所有內部的氫鍵都是最大滿足的（主鏈和側鏈）。蛋白質的氫鍵形成涉及一個交換反應，溶劑鍵被蛋白質鍵所取代疏水及親水基團需要合理的分布在溶劑可及表面及不可及表面。分布代表疏水效應的主要驅動力.蛋白質分子設計原理內核假設。蛋白質的獨特的折疊形式是由蛋白10

蛋白質分子設計原理金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。要求圍繞金屬中心放置合適數(shù)目的蛋白質側鏈或溶劑分子，并符合正確的鍵長、鍵角以及整體的幾何。對于金屬Pr，圍繞金屬中心的第二殼層中的相互作用是重要的。氫鍵的第二殼層通常涉及與蛋白質主鏈的相互作用。最優(yōu)的aa側鏈幾何排列。Pr側鏈構象由空間兩個立體因素所決定(一是立體勢壘，二是aa的位置)結構及功能的專一性。這是Pr設計最困難的問題.蛋白質分子設計原理金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾11序列設計設計α螺旋時，應選擇象Leu、Glu等易于形成α螺旋的殘基；設計全β結構時，應選擇Val、Ile等易于形成β折疊片的殘基；而在設計轉角時常選擇Pro-Asn殘基對。

.序列設計設計α螺旋時，應選擇象Leu、Glu等易于形成α螺旋12溶菌酶結構例如:雞卵清蛋白溶菌酶活性分子的設計Cutte成功設計了一個具有明顯的核酸酶活性的34肽，該肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。其主要活性源于二聚體；而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA。.溶菌酶結構例如:雞卵清蛋白溶菌酶活性分子的設計.13設計步驟蛋白質分子設計步驟圖修正設計獲得目標蛋白質序列合成檢測結構信息分析建立結構模型設計目標蛋白質數(shù)據庫.設計步驟蛋白質分子設計步驟圖修正設計獲得目標蛋白質序列合成檢14第二節(jié)基于天然蛋白質結構的分子設計基于天然蛋白質結構的分子設計有兩類：一是進行蛋白質修飾或基因定位突變，即“小改”；二是進行蛋白質分子裁剪拼接，即“中改”。

.第二節(jié)基于天然蛋白質結構的分子設計基于天然蛋白質結構的分子15一、定位突變

基于天然蛋白質結構的蛋白質分子“小改”是指對已知結構的蛋白質進行少數(shù)幾個殘基的修飾、替換或刪除等，這是目前蛋白質工程中最廣泛使用的方法，主要可分為蛋白質修飾和基因定位突變兩類。

.一、定位突變.16（一）定位突變的設計目標及解決方法

定位突變常見的設計目標是提高蛋白質的熱、酸穩(wěn)定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質工程手段進行結構-功能關系的研究等。

.（一）定位突變的設計目標及解決方法定位突變常見的17Hartley等于1986年完成了一個設計目標及解決的辦法：熱穩(wěn)定性對氧化的穩(wěn)定性對重金屬的穩(wěn)定性pH穩(wěn)定性提高酶學性質引入二硫橋，增加內氫鍵數(shù)目，改善內疏水堆積把Cys轉換為Ala或Ser，把Trp轉換為Phe或Tyr替代表面羧基，把Met轉換為Gln、Val、Ile或Leu替換表面荷電基團，His、Cys以及Tyr的置換專一性的改變，增加逆轉數(shù)，改變酸堿度

.Hartley等于1986年完成了一個設計目標及解決的辦法18（二）定位突變的種類要進行基因定位突變，改變DNA核苷酸序列，方法有很多種，如基因的化學合成、基因直接修飾法、盒式突變技術等。根據基因突變的方式，分為以下三類：

插入一個或多個氨基酸殘基；

刪除一個或多個氨基酸殘基；

替換或取代一個或多個氨基酸殘基。要達到基因定位突變的目的，多采用體外重組DNA技術或PCR方法。.（二）定位突變的種類要進行基因定位突19（三）定位突變的程序1．建立所研究蛋白質的結構模型可以通過X射線晶體學、二維核磁共振等測定結構，也可以根據類似物的結構或其他結構預測方法建立起結構模型。.（三）定位突變的程序1．建立所研究蛋白質的結構模型202．找出對所要求的性質有重要影響的位置在改造中如何恰當?shù)剡x擇突變殘基是一個關鍵問題，這不僅需要分析殘基的性質，同時還需要借助于已有的三維結構或分子模型。

.2．找出對所要求的性質有重要影響的位置在改造中如何恰當?shù)剡x擇213．預測突變體的結構

根據所選定的氨基酸殘基位點及突變后的氨基酸種類，利用相關軟件進行突變體的結構預測，將預測的結構與原始的蛋白質結構比較

.3．預測突變體的結構根據所選定的氨基224．構建突變體，獲得突變體蛋白

依據所設計好的突變，利用化學合成或PCR等方法構建突變體。進行基因測序驗證突變體后，將突變體進行表達，純化蛋白質，獲得所設計的新蛋白質。.4．構建突變體，獲得突變體蛋白.235．突變體蛋白質的檢驗測定新蛋白質的序列、三維結構、穩(wěn)定性、催化活性等，并與對應的天然蛋白質進行比較，檢驗突變設計的效果，同時進一步修正設計方案。.5．突變體蛋白質的檢驗測定新蛋白質的序列、三維結構、穩(wěn)定性、24蛋白質中功能殘基的鑒定根據結構信息確定殘基的突變突變方法鑒定突變功能殘基利用蛋白質同源性鑒定功能殘基（四）蛋白質中功能殘基的鑒定.蛋白質中功能根據結構信息利用蛋白質同源性（四）蛋白質中功能殘251．根據結構信息確定殘基的突變最有效最直接的方法AlanFersht和GregWinter等測定了酪氨酰-tRNA合成酶突變體的三維結構，通過分析該酶的Cys35被結構相似的Ser所取代后的結構，發(fā)現(xiàn)Cys35可能與酪氨酰腺苷酸中間體中的3’羥基形成氫鍵，突變效應降低了酶的活性，證實了Cys35在結合腺苷酸部分的作用。.1．根據結構信息確定殘基的突變最有效最直接的方法.262．突變方法鑒定突變功能殘基隨機突變技術刪除分析及連接片段掃描突變

.2．突變方法鑒定突變功能殘基.273．利用蛋白質同源性鑒定突變功能殘基高度保守的殘基與同源蛋白的共同功能以及維持結構有關。非保守殘基是分析的靶位點，特別是對于專一性研究。探測突變蛋白質的結構整體性質，以鑒定突變殘基。

.3．利用蛋白質同源性鑒定突變功能殘基高度保守的殘基與同源蛋白28（五）定位突變的應用RNaseT1的結構改造是分于設計中的一個成功實例T1核糖核酸酶含有104個aa殘基，天然酶有兩對二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個二硫鍵，熱穩(wěn)定性增加。

.（五）定位突變的應用RNaseT1的結構改造是分于設計中的29T4噬菌體溶菌酶圖2-3T4溶菌酶的三維結構（Gassner,etal.1996）紅色強調的為α螺旋結構域核心中被蛋氨酸置換的10個殘基T4溶菌酶的三維結構紅色強調的為α螺旋中被置換的殘基突變引入二硫鍵(Cys54和Cys97)去除Gly或引入Pro

(T)Ser38→Asp和Asn144→Asp

.T4噬菌體溶菌酶圖2-3T4溶菌酶的三維結構（Gassn30例：甲基對硫磷水解酶（Methylparathionhydrolase,MPH）結構和功能的研究

有機磷農藥的長期廣泛使用已經使很多水體及土壤被嚴重污染,而且直接影響到人們的身體健康。有機磷水解酶(OrganophosphorusHydrolase,

OPH)的改造：提高對特定底物的催化效率;擴大底物范圍;增加酶的穩(wěn)定性

DongYJ,2005

.例：甲基對硫磷水解酶（Methylparathionhy31目的和意義

通過對MPH的結晶和三維結構的測定，研究MPH活性中心的結構，并通過定點突變及活性測定來驗證，確定MPH的結構和功能的關系,為MPH的改性和利用提供科學的依據和良好的材料。OPH是目前在各方面研究最為透徹的有機磷農藥降解酶，同時也是應用最為廣泛的農藥降解酶，為此對甲基對硫磷水解酶的深入研究將有利于甲基對硫磷水解酶的廣泛應用。.目的和意義.32載體污染序列的分析在進行序列分析時，首先需確定序列是否含有載體序列的污染，如果含有載體序列，需截去后再進行其他分析。/VecScreen/VecScreen.html在線分析。

MatchtoVector:Strong

Moderate

Weak

Segmentofsuspectorigin:

SegmentsmatchingvectorStrongmatch:

1-113,3838-4071bp。真正的目標序列：114~3,837bp。

.載體污染序列的分析MatchtoVector:Stro331ThenucleotidesequenceincludingmpdfromPseudomonas

sp.WBC-32Plesiomonassp.M6的甲基對硫磷水解酶基因匹配區(qū)為134~1866，Identities=1720bp／1733bp(99％)

CDS:331aa(398-1393bp)3Pseudomonasputida的甲基對硫磷降解蛋白基因匹配區(qū)為168~1393，Identities=1025／1026(99％)CDS:341aa(368-1393bp)

兩個基因的CDS不一致，分別匹配于MPH的398，368-1393bp同源序列搜索（Blastn:114-3837bp）123.1Thenucleotidesequenceincl34甲基對硫磷水解酶基因的分析結論：MPH基因的CDS:398—1393（331aa)以1393位的TGA結束的可能的ORF有八個,MW:34.4kD–ATG:368，398bp典型的啟動子序列結構:TTGCAA-17個氨基酸-TATACT(320-365bp)典型的核糖體結合位點:AGGA(381bp).甲基對硫磷水解酶基因的分析以1393位的TGA結束的可能的O35MPH與OPH的序列比對二者同源性僅為13.6%，確定MPH是一個有別于OPH的蛋白質。二者在功能上的相似性不能用蛋白的一級序列的相似性加以解釋，推測二者功能上的相似性與其一級序列構成的高級結構中活性中心結構的相似性有關。.MPH與OPH的序列比對二者同源性僅為13.6%，確定MPH36MPH信號肽的分析預測：神經網算法結論：信號肽（1-35氨基酸）。

C值表示切割點的可能性，S值表示具有信號肽的可能性.MPH信號肽的分析預測：神經網算法結論：信號肽（1-35氨基37MPH信號肽的分析預測：馬爾可夫算法信號肽的一般結構為：正電荷的n-region；疏水的h-region；中性極性的c-region。

MPH具有典型的信號肽的三部分結構結論：可能的信號肽為1-35氨基酸。.MPH信號肽的分析預測：馬爾可夫算法信號肽的一般結構為：MP38mlmAUMPH的凝膠過濾柱層析圖

.mlmAUMPH的凝膠過濾柱層析圖.39MPH的SDS分析.MPH的SDS分析.40Buffer(ug/ml)MPH(ug/ml)Ni4.1484.370Mg14.34515.060Mn0.0750.497Fe1.1582.388Co0.0500.040Cu10.8129.296Zn0.201272.122MPH中金屬種類及含量的測定MPH的濃度：0.217mg/ml,結論：MPH中含鋅離子.Buffer(ug/ml)MPH(ug/ml)Ni4.1441硒代蛋氨酸MPH的表達純化在誘導表達時添加高濃度的與蛋氨酸有共同的合成途徑的終產物賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸，以及與賴氨酸具有相互協(xié)同作用的苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸來抑制正常菌株中蛋氨酸的合成，迫使細菌利用培養(yǎng)基中外源添加的硒代蛋氨酸，合成硒代蛋氨酸MPH。由于硒代蛋氨酸不穩(wěn)定而易發(fā)生氧化，因此在純化時需要加快速度，并在緩沖液中添加還原劑以保持還原性環(huán)境，如5mM?-巰基乙醇。.硒代蛋氨酸MPH的表達純化.42甲基對硫磷水解酶（MPH）P1晶型的晶體.甲基對硫磷水解酶（MPH）P1晶型的晶體.43甲基對硫磷水解酶（MPH）P43212晶型的晶體.甲基對硫磷水解酶（MPH）P43212晶型的晶體.44硒代蛋氨酸MPH的晶體.硒代蛋氨酸MPH的晶體.45同源二聚體每個亞基含有一個由兩個二價金屬離子組成的中心。Ala36為MPH的N末端第一個氨基酸（不具有1-35個氨基酸序列的結構）。甲基對硫磷水解酶（MPH）三維結構圖.同源二聚體甲基對硫磷水解酶（MPH）三維結構圖.46aba:ThebinuclearmetalcenteroftheOPH;b:ThebinuclearmetalcenteroftheMPH;MPH與OPH雙核金屬中心結構比較.aba:Thebinuclearmetalcente47a:ThesupposedleavinggroupsubsiteoftheMPH;b:TheleavinggroupsubsiteoftheOPH;abMPH與OPH雙核金屬中心附近氨基酸比較推測：Trp179，Phe196，Phe119是MPH底物結合部位的氨基酸.a:Thesupposedleavinggroup48甲基對硫磷水解酶中三個芳香族氨基酸的功能研究在MPH三維結構基礎上可以看出Trp179，Phe196，Phe119的芳香側鏈伸向MPH雙核金屬中心的上方，處于活性中心的入口處，推測為底物結合部位的氨基酸。通過定點突變將以上三個不同位點突變成含有芳香環(huán)的類似氨基酸及不具芳香環(huán)側鏈很小的丙氨酸，從而獲得了針對Trp179，Phe196和Phe119三個位點的六個突變體W179F、W179A、F196W、F196A、F119W和F119A，系統(tǒng)比較了突變體與野生酶的催化動力學特點，以確定三種氨基酸在MPH的結構和功能中的作用。.甲基對硫磷水解酶中三個芳香族在MPH三維結構基礎上49mpd基因表達載體的構建.mpd基因表達載體的構建.50W179F，W179A，F(xiàn)196W和F196A突變體基因的擴增.W179F，W179A，F(xiàn)196W和F196A突變體基因的擴51MPH及其突變體的表達菌株誘導表達產物的SDS分析.MPH及其突變體的表達菌株誘導表達產物的SDS分析52E.coliBL21(DE3)/pET5a-mpd表達產物的SDS分析.E.coliBL21(DE3)/pET5a-mpd表達產物53EnzymeSpecificactivity（U/mg）

Km(uM)

Kcat(s-1)

Kcat/Km(s-1mM-1)

MPH50.5100%37.4100%37.1100%993.3100%W179F34.568.4%48.4129.6%30.682.5%632.663.7%W179A8.416.6%74.6199.6%7.921.3%106.110.7%F196W64.0126.8%50.0133.7%52.8142.3%1056.8106.4%F196A4.89.6%107.4287.2%5.013.5%46.84.7%F119W29.257.8%28.275.5%20.856.1%738.874.4%F119A32.063.3%41.1109.9%23.863.9%578.358.2％MPH及其突變體的比活力及動力學參數(shù)

.EnzymeSpecificactivity（U/mg）

54實驗小結

利用生物信息學手段對MPH的結構基因的編碼序列進行分析，確定MPH是一種結構未知的蛋白質，并在對其性質進行分析預測的基礎上，通過對MPH的純化、結晶獲得P1晶型和P43212晶型兩種單晶以及硒標記MPH的晶體。通過合作利用P43212晶型的晶體解析了MPH的三維結構證實了MPH與OPH功能上的相似性可能與兩種蛋白三維結構的相似性有關的推測。同時，在MPH三維結構的基礎上，推測并通過定點突變及活性測定驗證了Trp179和Phe196屬于MPH活性中心的底物結合部位關鍵氨基酸，Phe119在與底物結合中的作用不明顯。以上對于MPH的結構和功能的關系的研究為MPH的改性和利用提供科學的依據。.實驗小結.55二、蛋白質分子拼接例如，有一種和癌癥的發(fā)病有關的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七個大小和形狀都非常相似的結構域拼接構成的，各結構域之間由柔韌性較大的“鉸鏈”片段相連。研究發(fā)現(xiàn)，癌胚抗原的這種多結構域特征有利于它的細胞識別和粘合作用。

.二、蛋白質分子拼接.56英國劍橋大學的Winter等人利用分子剪裁技術成功地在抗體分子上作了實驗(人源化抗體).英國劍橋大學的Winter等人利用分子剪裁技術成功地在抗體分57單鏈抗體scFv結構/cmbidata/biotech/antibody/antibodyengnieer.htm)抗DON單鏈抗體改體研究DON:小麥鐮刀菌毒素.單鏈抗體scFv結構58單鏈抗體的linker改造GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGSGGGGGGGSGGG

VHVHVHVHVHVHVLVLVLVLVLVL.單鏈抗體的linker改造59

單鏈抗體的改體模型VHVHVHVHVHVHLinker﹥12aaVＬVＬVＬVＬVＬVＬLinkerLinker3-12aa

<3aaVＬVＬVＬVＬVHVHVHVH.單鏈抗體的改體模型VHVHVHVHVHVHLinker﹥60

Linker

XhoⅠSalISalⅠEcoRIXhoⅠ雙酶切differentlength連接ＶＨＶＬ技術路線EcoRI.LinkerXhoⅠEcoRIdifferentl61轉化篩選、檢測

蛋白質的誘導生成

表達載體構建

感受態(tài)細胞的制備純化親和力初步測定.轉化篩選、檢測蛋白質的誘導生成表達載體構建感受態(tài)細62

PCR擴增重鏈、輕鏈策略LinkerVHVLP3P4P5P6P7P8P1P2.PCR擴增重鏈、輕鏈策略Linker63PCR反應體系及反應條件50L反應體系如下：10×TaqPCRBuffer5μLdNTP(2.5mM)3μLForwardPrimer(20mM)1μLReversePrimer(20mM)1μLTemple1μLrTaq0.3μL

AddddH2Otoafinalvolumeof50μLPCR循環(huán)條件為：94℃5min，1個循環(huán)；94℃45s，58℃30s，72℃45s，31個循環(huán)；72℃40s，25個循環(huán)；72℃7min，1個循環(huán)。取PCR產物5μL，1.0％的瓊脂糖電泳檢測。.PCR反應體系及反應條件50L反應體系如下：

64VH和VL的PCR擴增結果

１２３４５９６７８7500150001000025001002505007501000200010002505000.VH和VL的PCR擴增結果１２３４５９６７８7500165菌落PCR重組子驗證123456712345671234567200010007505002501002000200010001000750750500500250250100.菌落PCR重組子驗證166改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達及其純化

1234567897.4KD66.2KD42.7KD31KD.改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達及其純化167改體抗體的ELISA初步測定312456789101112.改體抗體的ELISA初步測定3124567891011168單鏈抗體抗體：是體液免疫應答的主要效應分子。由兩條相同的重鏈（H鏈）和兩條相同的輕鏈（L鏈）組成。雙特異性單鏈抗體的構建與表達.單鏈抗體雙特異性單鏈抗體的構建與表達.69單鏈抗體（scFv）：抗體可變區(qū)的重鏈（VH）與輕鏈（VL）通過一段多個氨基酸殘基構成的彈性短肽（Linker）相連，融合表達出來的抗體片斷。

.單鏈抗體（scFv）：.70雙特異性單鏈抗體能識別兩種抗原并能與之結合的單鏈抗體（或抗體復合物）稱為雙特異性單鏈抗體。本實驗將能夠各自產生抗DON毒素和抗ZEN毒素的單鏈抗體基因，連接融合，表達出能同時與DON和ZEN兩種毒素抗原特異性結合的雙特異性單鏈抗體。ZEN:玉米赤霉烯酮DON:小麥鐮刀菌毒素.雙特異性單鏈抗體ZEN:玉米赤霉烯酮DON:小麥鐮刀菌毒素71技術路線

DON和ZEN抗體基因的提取目的基因片段引物的設計

PCR擴增目的片段

制備感受態(tài)細胞

酶切目的片段、載體，linker連接

轉化連接產物

酶切驗證重組子

表達、純化蛋白.技術路線DON和ZEN抗體基因的提取目的基因72載體的構建Anti-ZENgeneAnti-DONgeneXhoΙEcoRΙSalΙNcoΙ連接

Linker.載體的構建Anti-ZENgeneAnti-DONgen73PCR擴增Anti-DON基因

12M20001000(bp)800bp750250100500.PCR擴增Anti-DON基因174PCR擴增Anti-ZEN基因

M1220001000750500250100(bp)750bp.PCR擴增Anti-ZEN基因M75重組驗證.重組驗證.76PCR驗證以重組質粒為模板，進行Anti-DON基因的PCR分析。.PCR驗證以重組質粒為模板，進行Anti-DON基因的PCR77雙特異性抗體的表達.雙特異性抗體的表達.78我們知道,蛋白質的空間結構受其氨基酸序列控制,而功能又與結構密切相關。

如果能夠找到構造蛋白質結構的方法,我們就能得到具有任意結構和功能的全新蛋白質,這就是蛋白質全新設計問題。第三節(jié)全新蛋白質設計.我們知道,蛋白質的空間結構受其氨基酸序列控制,79

蛋白質從頭設計概念

從頭設計能夠根據生物分子的活性位點特征產生一系列的結構片段，通過連接這些結構片段可以構成一個全新分子；或者在結合腔內對一個已知的結構骨架進行化合物的衍生化。

從頭設計方法可以生成全新的分子結構。.蛋白質從頭設計概念從頭設計能夠根據生物分子的活80全新蛋白質設計包括

一、全新蛋白質設計方法二、蛋白質結構的從頭設計.全新蛋白質設計包括

.81

全新蛋白質設計過程設計目標序列生成結構預測合成構建模型檢測.設計目標序列生成結構預測合成構建模型檢測.82（一）全新蛋白質設計程序模擬分析設計實驗一、全新蛋白質設計方法PDA循環(huán)（ProteinDesignAutomation）.（一）全新蛋白質設計程序模擬分析設計實驗一、全新蛋白83（二）全新蛋白質設計目標的選擇依據設計的目的可以分為：從頭結構設計從頭功能設計.（二）全新蛋白質設計目標的選擇依據設計的目的可以分為：.84從頭結構設計

中心問題：

穩(wěn)定及獨特的三維結構序列；基本障礙：

線性聚合構象熵；解決方法：（1）使相互作用的強度與數(shù)目達到最大；（2）共價交叉連接。.從頭結構設計

中心問題：穩(wěn)定及獨特的三維結構.85從頭設計方法包含的步驟1、活性位點分析：對結合位點的具體的化學信息進行掃描、分析和歸類。這些信息的三維空間相互關系都必須充分考慮。

2、配體分子構建：采用不同的片段選擇和分子構建方法，產生相應的分子結構。

3、評價：使用特定的評分系統(tǒng)將構建的分子與活性位點的匹配性進行排序，可以選擇其中優(yōu)良的結果作為合成實驗的對象。也可以將之做新一輪計算的起點進行進一步的優(yōu)化。.從頭設計方法包含的步驟1、活性位點分析：對結合位點的具體的化86二級模塊單元的自組裝最簡單、最直接的策略—合成單一二級結構單元優(yōu)點

無論是從設計或合成看，是簡單的；容易合成。缺點

涉及蛋白質的穩(wěn)定性；結構的簡單重復。.二級模塊單元的自組裝最簡單、最直接的策略—合成單一二級結構單87二、蛋白質結構的從頭設計（一）蛋白質結構的從頭設計原則1．二級結構的設計原則α螺旋β折疊片轉角2．超二級結構和三級結構的設計原則.二、蛋白質結構的從頭設計（一）蛋白質結構的從頭設計原則.88α螺旋(PHPPH)(Leu、Glu、Met)C端：aa+N端：aa-N帽C帽.α螺旋(PHPPH)C端：aa+N帽C帽.89β折疊片

(HPHPH或PHPHP，5-10aa).β折疊片(HPHPH或PHPHP，5-10aa).90轉角（Pro、Gly中斷α螺旋，Glu中斷β折疊）

.轉角（Pro、Gly中斷α螺旋，Glu中斷β折疊）.91蛋白質的幾種超二級結構

αα、ββ、β-α-β、β-α-β-α-β.蛋白質的幾種超二級結構

αα、ββ、β-α-β、β92從頭設計的三股式β折疊從頭設計的20個氨基酸殘基的三股式β折疊（KortemmeT,etal.1998）（二）蛋白質結構的從頭設計實例結構骨架模板、分級迭代算法1mg/110RMB.從頭設計的三股式β折疊從頭設計的20個氨基酸殘基的三股式β93ββα型異源四聚體的設計歷程結構域替換寡聚化策略異源專一性的計算機重新設計23個氨基酸自動折疊成的鋅指結構（ββα5）的核磁共振（NMR）結構(Struthersetal.,1996,1998)；ββα5同源四聚體衍生物ββαT2的X-射線結構（Alietal.,2004)；ββαT2異源四聚體衍生物ββαhetT1的X-射線結構(Alietal.,2005)..ββα型異源四聚體的設計歷程結構域替換異源專94全新設計的α/β新蛋白Top7（BrianKuhlman,etal.2003）.全新設計的α/β新蛋白Top7（BrianKuhlman95α/β-筒狀蛋白質的全新設計(Offredi1,etal.2003)(A)β-sheetbarrel(紅色)(B)四周環(huán)繞α-helixbarrel(藍色)(C)二者由簡單結構域αβ1、αβ3和βABα（灰色）連接(D)全新α/β-筒狀蛋白質。216aa.α/β-筒狀蛋白質的全新設計(Offredi1,etal9674aa

Degrado設計四螺旋束螺旋（Helix）：Gly-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Lys-Gly；連接（Loop）：Pro-Arg-Arg；肽鏈：NH2-Met-Helix-Loop-Helix-Loop-Helix-Loop-Helix-COOH.74aaDegrado設計四螺旋束螺旋（Helix）：G97四螺旋束.四螺旋束.98舉例Hodges設計（周期性重復七肽）/~jps/coilcoil.html2/.../phyb516/regulatoryproteinsu3.htm3/sc172/sc172_4.html

coiled-coilfrom:/…/phvb516/regulatorvproteinsu3.htm疏水性aa.舉例疏水性aa.99coiled-coil

from:/~ips/coilcoil.html

.coiled-coil

from:cis.poly.100國外的一些大型軟件包主要有SYBYL、BIOSYM等。國內的北京大學化學系（來魯華課題組）有PEPMODS蛋白質分子設計系統(tǒng)中國生物物理研究所（陳潤生課題組）中國科學院上誨生物化學研究所（丁達夫課題組）等設計有PMODELING程序包。.國外的一些大型軟件包主要有SYBYL、BIOSYM等。.101蛋白質全新設計的現(xiàn)狀和前景

現(xiàn)狀

蛋白質全新設計不僅使我們有可能得到自然界不存在的具有全新結構和功能的蛋白質,并且已經成為檢驗蛋白質折疊理論和研究蛋白質質折疊規(guī)律的重要手段。由于我們對蛋白質全新設計的理論基礎即蛋白質折疊規(guī)律的認識還不夠,所以蛋白質全新設計還處在探索階段。.蛋白質全新設計的現(xiàn)狀和前景

現(xiàn)狀.102前景

隨著新實驗技術的發(fā)展,蛋白質全新設計的速度和效率必將得到極大的提高。如組合化學方法應用到蛋白質全新設計中必然能夠大大地縮短設計的周期,并將徹底改變蛋白質全新設計的面貌。.前景隨著新實驗技術的發(fā)展,蛋白質全.103思考題蛋白質分子設計的種類有哪些？各自特點？蛋白質分子設計的原理？蛋白質分子設計的程序？實施蛋白質設計需遵循的原則？.思考題蛋白質分子設計的種類有哪些？各自特點？.104Thanksforyourattention!.Thanksforyourattention!.105第二章

蛋白質分子設計

ChaptertwoProteinDesign

.第二章蛋白質分子設計

Chaptertwo106引言在人體的進化過程中蛋白質執(zhí)行了在人體及體外的許多重要任務：酶是催化化學反應的蛋白質或者核酸分子；抗體起到防護的作用;……從生態(tài)角度，蛋白質也是非常理想的物質:生物合成不需要消耗很多能量專一性很強不產生副作用并且能很快降解.引言在人體的進化過程中蛋白質執(zhí)行了在人體及體外的許多重要任務107蛋白質沒有像化學試劑那樣被普遍應用，其原因:(1)蛋白質分子量非常大(10000-1000000)，不能通過化學方法生產;(2)蛋白質的功能是在生理條件下?lián)]發(fā)的，在其它條件下(如在有機溶劑中)是不穩(wěn)定的;(3)專一性致使其應用范圍受到影響。

蛋白質應用受限的原因.蛋白質沒有像化學試劑那樣被普遍應用，其原因:蛋白質應用受限的108蛋白質設計目前存在的問題1、與天然的蛋白質比較，缺乏結構的獨特性及明顯的功能優(yōu)越性2、三級結構的確定性較差.蛋白質設計目前存在的問題.109計算機模擬突變蛋白質產品功能分析基因構建Pr設計循環(huán)第一節(jié)蛋白質分子設計原理.計算機模擬突變蛋白質產品功能分析基因構建Pr設計循環(huán)第一節(jié)110一、蛋白質分子設計的分類設計的目的主要有兩個：

一是為有目的的蛋白質工程改造提供設計方案和指導性信息，如以此提高蛋白質的熱、酸穩(wěn)定性，增加活性，降低副作用，提高專一性等；

二是探索蛋白質的折疊機理，如簡單蛋白質骨架的從頭設計是研究蛋白質內相互作用力的類型及本質的很好途徑，也為解決蛋白質折疊問題尋找定性和定量的規(guī)律。.一、蛋白質分子設計的分類設計的目的主要有兩個：.111（一）蛋白質分子設計的層次分為兩個層次：

一是在蛋白質三維結構已知基礎上的分子設計；二是在三維結構未知的情況下，借助一級結構序列信息及生物化學性質進行分子設計工作。.（一）蛋白質分子設計的層次分為兩個層次：.112（二）蛋白質分子設計的分類1．定點突變或化學修飾法2．拼接組裝設計法3．從頭設計全新蛋白質.（二）蛋白質分子設計的分類1．定點突變或化學修飾法.113二、蛋白質分子設計的原則1．活性設計2．對專一性的設計3．Scaffold設計(框架)4．疏水基團與親水基團需合理分布5．最優(yōu)的氨基酸側鏈幾何排列.二、蛋白質分子設計的原則1．活性設計.114

蛋白質分子設計原理內核假設。蛋白質的獨特的折疊形式是由蛋白質內核中殘基的相互作用決定。（內部十分保守的區(qū)域）Pr內部都是密堆積（很少有空穴大到水分子可以結合一個水分子或惰性氣體），沒有重疊所有內部的氫鍵都是最大滿足的（主鏈和側鏈）。蛋白質的氫鍵形成涉及一個交換反應，溶劑鍵被蛋白質鍵所取代疏水及親水基團需要合理的分布在溶劑可及表面及不可及表面。分布代表疏水效應的主要驅動力.蛋白質分子設計原理內核假設。蛋白質的獨特的折疊形式是由蛋白115

蛋白質分子設計原理金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。要求圍繞金屬中心放置合適數(shù)目的蛋白質側鏈或溶劑分子，并符合正確的鍵長、鍵角以及整體的幾何。對于金屬Pr，圍繞金屬中心的第二殼層中的相互作用是重要的。氫鍵的第二殼層通常涉及與蛋白質主鏈的相互作用。最優(yōu)的aa側鏈幾何排列。Pr側鏈構象由空間兩個立體因素所決定(一是立體勢壘，二是aa的位置)結構及功能的專一性。這是Pr設計最困難的問題.蛋白質分子設計原理金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾116序列設計設計α螺旋時，應選擇象Leu、Glu等易于形成α螺旋的殘基；設計全β結構時，應選擇Val、Ile等易于形成β折疊片的殘基；而在設計轉角時常選擇Pro-Asn殘基對。

.序列設計設計α螺旋時，應選擇象Leu、Glu等易于形成α螺旋117溶菌酶結構例如:雞卵清蛋白溶菌酶活性分子的設計Cutte成功設計了一個具有明顯的核酸酶活性的34肽，該肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。其主要活性源于二聚體；而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA。.溶菌酶結構例如:雞卵清蛋白溶菌酶活性分子的設計.118設計步驟蛋白質分子設計步驟圖修正設計獲得目標蛋白質序列合成檢測結構信息分析建立結構模型設計目標蛋白質數(shù)據庫.設計步驟蛋白質分子設計步驟圖修正設計獲得目標蛋白質序列合成檢119第二節(jié)基于天然蛋白質結構的分子設計基于天然蛋白質結構的分子設計有兩類：一是進行蛋白質修飾或基因定位突變，即“小改”；二是進行蛋白質分子裁剪拼接，即“中改”。

.第二節(jié)基于天然蛋白質結構的分子設計基于天然蛋白質結構的分子120一、定位突變

基于天然蛋白質結構的蛋白質分子“小改”是指對已知結構的蛋白質進行少數(shù)幾個殘基的修飾、替換或刪除等，這是目前蛋白質工程中最廣泛使用的方法，主要可分為蛋白質修飾和基因定位突變兩類。

.一、定位突變.121（一）定位突變的設計目標及解決方法

定位突變常見的設計目標是提高蛋白質的熱、酸穩(wěn)定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質工程手段進行結構-功能關系的研究等。

.（一）定位突變的設計目標及解決方法定位突變常見的122Hartley等于1986年完成了一個設計目標及解決的辦法：熱穩(wěn)定性對氧化的穩(wěn)定性對重金屬的穩(wěn)定性pH穩(wěn)定性提高酶學性質引入二硫橋，增加內氫鍵數(shù)目，改善內疏水堆積把Cys轉換為Ala或Ser，把Trp轉換為Phe或Tyr替代表面羧基，把Met轉換為Gln、Val、Ile或Leu替換表面荷電基團，His、Cys以及Tyr的置換專一性的改變，增加逆轉數(shù)，改變酸堿度

.Hartley等于1986年完成了一個設計目標及解決的辦法123（二）定位突變的種類要進行基因定位突變，改變DNA核苷酸序列，方法有很多種，如基因的化學合成、基因直接修飾法、盒式突變技術等。根據基因突變的方式，分為以下三類：

插入一個或多個氨基酸殘基；

刪除一個或多個氨基酸殘基；

替換或取代一個或多個氨基酸殘基。要達到基因定位突變的目的，多采用體外重組DNA技術或PCR方法。.（二）定位突變的種類要進行基因定位突124（三）定位突變的程序1．建立所研究蛋白質的結構模型可以通過X射線晶體學、二維核磁共振等測定結構，也可以根據類似物的結構或其他結構預測方法建立起結構模型。.（三）定位突變的程序1．建立所研究蛋白質的結構模型1252．找出對所要求的性質有重要影響的位置在改造中如何恰當?shù)剡x擇突變殘基是一個關鍵問題，這不僅需要分析殘基的性質，同時還需要借助于已有的三維結構或分子模型。

.2．找出對所要求的性質有重要影響的位置在改造中如何恰當?shù)剡x擇1263．預測突變體的結構

根據所選定的氨基酸殘基位點及突變后的氨基酸種類，利用相關軟件進行突變體的結構預測，將預測的結構與原始的蛋白質結構比較

.3．預測突變體的結構根據所選定的氨基1274．構建突變體，獲得突變體蛋白

依據所設計好的突變，利用化學合成或PCR等方法構建突變體。進行基因測序驗證突變體后，將突變體進行表達，純化蛋白質，獲得所設計的新蛋白質。.4．構建突變體，獲得突變體蛋白.1285．突變體蛋白質的檢驗測定新蛋白質的序列、三維結構、穩(wěn)定性、催化活性等，并與對應的天然蛋白質進行比較，檢驗突變設計的效果，同時進一步修正設計方案。.5．突變體蛋白質的檢驗測定新蛋白質的序列、三維結構、穩(wěn)定性、129蛋白質中功能殘基的鑒定根據結構信息確定殘基的突變突變方法鑒定突變功能殘基利用蛋白質同源性鑒定功能殘基（四）蛋白質中功能殘基的鑒定.蛋白質中功能根據結構信息利用蛋白質同源性（四）蛋白質中功能殘1301．根據結構信息確定殘基的突變最有效最直接的方法AlanFersht和GregWinter等測定了酪氨酰-tRNA合成酶突變體的三維結構，通過分析該酶的Cys35被結構相似的Ser所取代后的結構，發(fā)現(xiàn)Cys35可能與酪氨酰腺苷酸中間體中的3’羥基形成氫鍵，突變效應降低了酶的活性，證實了Cys35在結合腺苷酸部分的作用。.1．根據結構信息確定殘基的突變最有效最直接的方法.1312．突變方法鑒定突變功能殘基隨機突變技術刪除分析及連接片段掃描突變

.2．突變方法鑒定突變功能殘基.1323．利用蛋白質同源性鑒定突變功能殘基高度保守的殘基與同源蛋白的共同功能以及維持結構有關。非保守殘基是分析的靶位點，特別是對于專一性研究。探測突變蛋白質的結構整體性質，以鑒定突變殘基。

.3．利用蛋白質同源性鑒定突變功能殘基高度保守的殘基與同源蛋白133（五）定位突變的應用RNaseT1的結構改造是分于設計中的一個成功實例T1核糖核酸酶含有104個aa殘基，天然酶有兩對二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個二硫鍵，熱穩(wěn)定性增加。

.（五）定位突變的應用RNaseT1的結構改造是分于設計中的134T4噬菌體溶菌酶圖2-3T4溶菌酶的三維結構（Gassner,etal.1996）紅色強調的為α螺旋結構域核心中被蛋氨酸置換的10個殘基T4溶菌酶的三維結構紅色強調的為α螺旋中被置換的殘基突變引入二硫鍵(Cys54和Cys97)去除Gly或引入Pro

(T)Ser38→Asp和Asn144→Asp

.T4噬菌體溶菌酶圖2-3T4溶菌酶的三維結構（Gassn135例：甲基對硫磷水解酶（Methylparathionhydrolase,MPH）結構和功能的研究

有機磷農藥的長期廣泛使用已經使很多水體及土壤被嚴重污染,而且直接影響到人們的身體健康。有機磷水解酶(OrganophosphorusHydrolase,

OPH)的改造：提高對特定底物的催化效率;擴大底物范圍;增加酶的穩(wěn)定性

DongYJ,2005

.例：甲基對硫磷水解酶（Methylparathionhy136目的和意義

通過對MPH的結晶和三維結構的測定，研究MPH活性中心的結構，并通過定點突變及活性測定來驗證，確定MPH的結構和功能的關系,為MPH的改性和利用提供科學的依據和良好的材料。OPH是目前在各方面研究最為透徹的有機磷農藥降解酶，同時也是應用最為廣泛的農藥降解酶，為此對甲基對硫磷水解酶的深入研究將有利于甲基對硫磷水解酶的廣泛應用。.目的和意義.137載體污染序列的分析在進行序列分析時，首先需確定序列是否含有載體序列的污染，如果含有載體序列，需截去后再進行其他分析。/VecScreen/VecScreen.html在線分析。

MatchtoVector:Strong

Moderate

Weak

Segmentofsuspectorigin:

SegmentsmatchingvectorStrongmatch:

1-113,3838-4071bp。真正的目標序列：114~3,837bp。

.載體污染序列的分析MatchtoVector:Stro1381ThenucleotidesequenceincludingmpdfromPseudomonas

sp.WBC-32Plesiomonassp.M6的甲基對硫磷水解酶基因匹配區(qū)為134~1866，Identities=1720bp／1733bp(99％)

CDS:331aa(398-1393bp)3Pseudomonasputida的甲基對硫磷降解蛋白基因匹配區(qū)為168~1393，Identities=1025／1026(99％)CDS:341aa(368-1393bp)

兩個基因的CDS不一致，分別匹配于MPH的398，368-1393bp同源序列搜索（Blastn:114-3837bp）123.1Thenucleotidesequenceincl139甲基對硫磷水解酶基因的分析結論：MPH基因的CDS:398—1393（331aa)以1393位的TGA結束的可能的ORF有八個,MW:34.4kD–ATG:368，398bp典型的啟動子序列結構:TTGCAA-17個氨基酸-TATACT(320-365bp)典型的核糖體結合位點:AGGA(381bp).甲基對硫磷水解酶基因的分析以1393位的TGA結束的可能的O140MPH與OPH的序列比對二者同源性僅為13.6%，確定MPH是一個有別于OPH的蛋白質。二者在功能上的相似性不能用蛋白的一級序列的相似性加以解釋，推測二者功能上的相似性與其一級序列構成的高級結構中活性中心結構的相似性有關。.MPH與OPH的序列比對二者同源性僅為13.6%，確定MPH141MPH信號肽的分析預測：神經網算法結論：信號肽（1-35氨基酸）。

C值表示切割點的可能性，S值表示具有信號肽的可能性.MPH信號肽的分析預測：神經網算法結論：信號肽（1-35氨基142MPH信號肽的分析預測：馬爾可夫算法信號肽的一般結構為：正電荷的n-region；疏水的h-region；中性極性的c-region。

MPH具有典型的信號肽的三部分結構結論：可能的信號肽為1-35氨基酸。.MPH信號肽的分析預測：馬爾可夫算法信號肽的一般結構為：MP143mlmAUMPH的凝膠過濾柱層析圖

.mlmAUMPH的凝膠過濾柱層析圖.144MPH的SDS分析.MPH的SDS分析.145Buffer(ug/ml)MPH(ug/ml)Ni4.1484.370Mg14.34515.060Mn0.0750.497Fe1.1582.388Co0.0500.040Cu10.8129.296Zn0.201272.122MPH中金屬種類及含量的測定MPH的濃度：0.217mg/ml,結論：MPH中含鋅離子.Buffer(ug/ml)MPH(ug/ml)Ni4.14146硒代蛋氨酸MPH的表達純化在誘導表達時添加高濃度的與蛋氨酸有共同的合成途徑的終產物賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸，以及與賴氨酸具有相互協(xié)同作用的苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸來抑制正常菌株中蛋氨酸的合成，迫使細菌利用培養(yǎng)基中外源添加的硒代蛋氨酸，合成硒代蛋氨酸MPH。由于硒代蛋氨酸不穩(wěn)定而易發(fā)生氧化，因此在純化時需要加快速度，并在緩沖液中添加還原劑以保持還原性環(huán)境，如5mM?-巰基乙醇。.硒代蛋氨酸MPH的表達純化.147甲基對硫磷水解酶（MPH）P1晶型的晶體.甲基對硫磷水解酶（MPH）P1晶型的晶體.148甲基對硫磷水解酶（MPH）P43212晶型的晶體.甲基對硫磷水解酶（MPH）P43212晶型的晶體.149硒代蛋氨酸MPH的晶體.硒代蛋氨酸MPH的晶體.150同源二聚體每個亞基含有一個由兩個二價金屬離子組成的中心。Ala36為MPH的N末端第一個氨基酸（不具有1-35個氨基酸序列的結構）。甲基對硫磷水解酶（MPH）三維結構圖.同源二聚體甲基對硫磷水解酶（MPH）三維結構圖.151aba:ThebinuclearmetalcenteroftheOPH;b:ThebinuclearmetalcenteroftheMPH;MPH與OPH雙核金屬中心結構比較.aba:Thebinuclearmetalcente152a:ThesupposedleavinggroupsubsiteoftheMPH;b:TheleavinggroupsubsiteoftheOPH;abMPH與OPH雙核金屬中心附近氨基酸比較推測：Trp179，Phe196，Phe119是MPH底物結合部位的氨基酸.a:Thesupposedleavinggroup153甲基對硫磷水解酶中三個芳香族氨基酸的功能研究在MPH三維結構基礎上可以看出Trp179，Phe196，Phe119的芳香側鏈伸向MPH雙核金屬中心的上方，處于活性中心的入口處，推測為底物結合部位的氨基酸。通過定點突變將以上三個不同位點突變成含有芳香環(huán)的類似氨基酸及不具芳香環(huán)側鏈很小的丙氨酸，從而獲得了針對Trp179，Phe196和Phe119三個位點的六個突變體W179F、W179A、F196W、F196A、F119W和F119A，系統(tǒng)比較了突變體與野生酶的催化動力學特點，以確定三種氨基酸在MPH的結構和功能中的作用。.甲基對硫磷水解酶中三個芳香族在MPH三維結構基礎上154mpd基因表達載體的構建.mpd基因表達載體的構建.155W179F，W179A，F(xiàn)196W和F196A突變體基因的擴增.W179F，W179A，F(xiàn)196W和F196A突變體基因的擴156MPH及其突變體的表達菌株誘導表達產物的SDS分析.MPH及其突變體的表達菌株誘導表達產物的SDS分析157E.coliBL21(DE3)/pET5a-mpd表達產物的SDS分析.E.coliBL21(DE3)/pET5a-mpd表達產物158EnzymeSpecificactivity（U/mg）

Km(uM)

Kcat(s-1)

Kcat/Km(s-1mM-1)

MPH50.5100%37.4100%37.1100%993.3100%W179F34.568.4%48.4129.6%30.682.5%632.663.7%W179A8.416.6%74.6199.6%7.921.3%106.110.7%F196W64.0126.8%50.0133.7%52.8142.3%1056.8106.4%F196A4.89.6%107.4287.2%5.013.5%46.84.7%F119W29.257.8%28.275.5%20.856.1%738.874.4%F119A32.063.3%41.1109.9%23.863.9%578.358.2％MPH及其突變體的比活力及動力學參數(shù)

.EnzymeSpecificactivity（U/mg）

159實驗小結

利用生物信息學手段對MPH的結構基因的編碼序列進行分析，確定MPH是一種結構未知的蛋白質，并在對其性質進行分析預測的基礎上，通過對MPH的純化、結晶獲得P1晶型和P43212晶型兩種單晶以及硒標記MPH的晶體。通過合作利用P43212晶型的晶體解析了MPH的三維結構證實了MPH與OPH功能上的相似性可能與兩種蛋白三維結構的相似性有關的推測。同時，在MPH三維結構的基礎上，推測并通過定點突變及活性測定驗證了Trp179和Phe196屬于MPH活性中心的底物結合部位關鍵氨基酸，Phe119在與底物結合中的作用不明顯。以上對于MPH的結構和功能的關系的研究為MPH的改性和利用提供科學的依據。.實驗小結.160二、蛋白質分子拼接例如，有一種和癌癥的發(fā)病有關的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七個大小和形狀都非常相似的結構域拼接構成的，各結構域之間由柔韌性較大的“鉸鏈”片段相連。研究發(fā)現(xiàn)，癌胚抗原的這種多結構域特征有利于它的細胞識別和粘合作用。

.二、蛋白質分子拼接.161英國劍橋大學的Winter等人利用分子剪裁技術成功地在抗體分子上作了實驗(人源化抗體).英國劍橋大學的Winter等人利用分子剪裁技術成功地在抗體分162單鏈抗體scFv結構/cmbidata/biotech/antibody/antibodyengnieer.htm)抗DON單鏈抗體改體研究DON:小麥鐮刀菌毒素.單鏈抗體scFv結構163單鏈抗體的linker改造GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGSGGGGGGGSGGG

VHVHVHVHVHVHVLVLVLVLVLVL.單鏈抗體的linker改造164

單鏈抗體的改體模型VHVHVHVHVHVHLinker﹥12aaVＬVＬVＬVＬVＬVＬLinkerLinker3-12aa

<3aaVＬVＬVＬVＬVHVHVHVH.單鏈抗體的改體模型VHVH