食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件

食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)1主要內(nèi)容第一節(jié)食品毒理學(xué)實驗的原則和局限性

第二節(jié)毒理學(xué)毒性評價試驗的基本目的

第三節(jié)實驗動物的選擇和處理

第四節(jié)食品毒理學(xué)試驗設(shè)計要點

第五節(jié)實驗動物的染毒和處置

第六節(jié)體外試驗在毒理學(xué)中的應(yīng)用主要內(nèi)容第一節(jié)食品毒理學(xué)實驗的原則和局限性2食品毒理學(xué)作為一門實驗科學(xué)，以動物實驗為中心。食品毒理學(xué)研究的主要手段是動物實驗。食品毒理學(xué)動物實驗的設(shè)計、實施、結(jié)果觀察和評價是毒理學(xué)研究的基本方法。食品毒理學(xué)作為一門實驗科學(xué)，以動物實驗為中心。3食品毒理學(xué)研究的主要手段是動物、實驗。

體內(nèi)試驗是以實驗動物為模型，最終目的是通過外源化學(xué)物對實驗動物的毒性反應(yīng)，向人(原型)外推，以期評估外源化學(xué)物對人的危害及危險性。體外實驗主要用于篩選和預(yù)測急性毒性和機(jī)制研究。食品毒理學(xué)研究的主要手段是動物、實驗。4以科學(xué)研究為目的而進(jìn)行科學(xué)飼養(yǎng)繁殖的動物稱為實驗動物?！飳嶒瀯游锓N類：常見包括：大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、狗、貓、猴、小型豬、雞、青蛙、蟾蜍、魚類等。以科學(xué)研究為目的而進(jìn)行科學(xué)飼養(yǎng)繁殖的動物稱5豚鼠：特點是毛短而光滑，生長快，抗病力強(qiáng)，繁殖性能好。廣泛用于藥物學(xué)、傳染病學(xué)、免疫學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、耳科學(xué)等各項醫(yī)學(xué)及生物學(xué)的研究中。

豚鼠：特點是毛短而光滑，生長快，抗病力強(qiáng)，繁殖性能好。廣泛用6SD大鼠：白色，產(chǎn)仔多，生長發(fā)育較Wistar大鼠為快，對疾病的抵抗力尤以呼吸道疾病的抵抗力強(qiáng)。自發(fā)腫瘤發(fā)生率較低，對性激素感受性高。SD大鼠：白色，產(chǎn)仔多，生長發(fā)育較Wistar大鼠為快，對疾7BALB/c小鼠：對致癌因子敏感，對放射性照射極為敏感。生產(chǎn)性能良好，繁殖期長，廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、核醫(yī)學(xué)和單克隆抗體等研究。BALB/c小鼠：對致癌因子敏感，對放射性照射極為敏感。生產(chǎn)8食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件9意義:實驗動物是生命科學(xué)（生物、醫(yī)學(xué)、食品等）研究的重要基礎(chǔ)和支撐條件，在科研、教學(xué)、生產(chǎn)、檢定、安全評價和成果評定中都離不開實驗動物，被稱為“活的儀器、活試劑”。英國一位科學(xué)家曾這樣比喻：“在生命科學(xué)研究中使用實驗動物就象在分析化學(xué)中使用分析天平一樣重要”。意義:10

落戶武漢大學(xué)實驗動物中心的慰靈碑，旨在紀(jì)念在抗非典疫苗和藥物實驗中為人類健康獻(xiàn)身的38只恒河猴

落戶武漢大學(xué)實驗動物中心的慰靈碑，旨在紀(jì)念在11第一節(jié)食品毒理學(xué)實驗的原則和局限性

食品毒理學(xué)實驗的原則化學(xué)物在實驗動物產(chǎn)生的作用，可以外推于人實驗動物必須暴露于高劑量成年的健康實驗動物(雄性和雌性未孕)和人可能的暴露途徑是基本的選擇代表性、可重復(fù)性第一節(jié)食品毒理學(xué)實驗的原則和局限性食品毒理學(xué)實驗的原12化學(xué)物在實驗動物產(chǎn)生的作用，可以外推于人①人是最敏感的動物物種；②人和實驗動物的生物學(xué)過程包括化學(xué)物的代謝，與體重(或體表面積)相關(guān)。這兩個假設(shè)也是全部實驗生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的前提。以單位體表面積計算在人產(chǎn)生毒作用的劑量和實驗動物通常相近似。而以體重計算則人通常比實驗動物敏感，差別可能達(dá)10倍。因此可以利用安全系數(shù)來計算人的相對安全劑量?；瘜W(xué)物在實驗動物產(chǎn)生的作用，可以外推于人13第二個原則是實驗動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對人潛在危害的必需的和可靠的方法。毒理學(xué)試驗中，一般要設(shè)3個或3個以上劑量組，以觀察劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系，確定受試化學(xué)物引起毒效應(yīng)及其毒性參數(shù)。引起毒效應(yīng)的最低劑量(LOAEL)與人的暴露劑量接近時，說明該化學(xué)物不安全。當(dāng)該劑量與人的暴露劑量有很大的距離(幾十倍，幾百倍或以上)，才認(rèn)為具有一定安全性，此距離越大，安全性越可靠。第二個原則是實驗動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對人潛在危害的14第三個原則，成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物和人可能的暴露途徑是基本的選擇。不能重復(fù)的實驗結(jié)果是沒有任何科學(xué)價值的。選用成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物是為了使實驗結(jié)果具有代表性和可重復(fù)性。以成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物作為一般人群的代表性實驗?zāi)Ｐ?，而將幼年和老年動物、妊娠的雌性動物、疾病狀態(tài)作為特殊情況另作研究。這樣可降低實驗對象的多樣性，減少實驗誤差。第三個原則，成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物和人可15

食品毒理學(xué)實驗的局限性用實驗動物的毒理學(xué)實驗資料外推到人群接觸的安全性時，會有很大的不確定性實驗動物和人對外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感性不同，有時甚至存在著質(zhì)的差別高劑量向低劑量外推的不確定性小數(shù)量實驗動物到大量人群外推的不確定性成年健康動物與不同的人種、種族，而且包括年老體弱及患病的個體之間的易感性不同食品毒理學(xué)實驗的局限性16首先，實驗動物和人對外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感性不同，有時甚至存在著質(zhì)的差別。雖然在毒理學(xué)實驗中通過用兩種或兩種以上的動物，并盡可能選擇與人對毒物反應(yīng)相似的動物，但要完全避免物種差異是不可能的。而且在動物實驗中，可觀察到體征(sign)，而沒有癥狀(symptom)。實驗動物不能述說涉及主觀感覺的毒效應(yīng)，如疼痛、腹脹、疲乏、頭暈、眼花、耳鳴等，這些毒效應(yīng)就難以或不可能發(fā)現(xiàn)。首先，實驗動物和人對外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感性不同，有時甚至存在17第二，高劑量向低劑量外推的不確定性

在毒理學(xué)實驗中，為了尋求毒作用的靶器官，并能在相對少量的動物上就能得到劑量-反應(yīng)或劑量-效應(yīng)關(guān)系，往往選用較大的染毒劑量，這一劑量通常要比人實際接觸的劑量大得多。有些化學(xué)物在高劑量和低劑量的毒性作用規(guī)律并不一定一致，如大劑量下出現(xiàn)的反應(yīng)有可能是由于化學(xué)物在體內(nèi)超過了機(jī)體的代謝能力，這就存在高劑量向低劑量外推的不確定性。第二，高劑量向低劑量外推的不確定性18第三，毒理學(xué)實驗所用動物數(shù)量有限，那些發(fā)生率很低的毒性反應(yīng)，在少量動物中難以發(fā)現(xiàn)。而化學(xué)物一旦進(jìn)入市場，接觸人群往往會很大。這就存在小數(shù)量實驗動物到大量人群外推的不確定性。第三，毒理學(xué)實驗所用動物數(shù)量有限，那些發(fā)生率很低的毒性19四，實驗動物一般都是實驗室培育的品系，一般選用成年健康動物，反應(yīng)較單一，而接觸人群可以是不同的人種、種族，而且包括年老體弱及患病的個體，在對外源化學(xué)物毒性反應(yīng)的易感性上存在很大差異。四，實驗動物一般都是實驗室培育的品系，一般選用成年健康動物，20第二節(jié)毒理學(xué)毒性評價試驗的基本目的

包括以下幾點：受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究，可以得到該受試物的多種毒性參數(shù)確定毒作用的靶器官確定損害的可逆性第二節(jié)毒理學(xué)毒性評價試驗的基本目的包括以下幾點：21 1.受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)。在急性和慢性毒性試驗中，觀察受試物對機(jī)體的有害作用，對有害作用的觀察應(yīng)該是對每個實驗動物進(jìn)行全面的逐項的觀察和記錄。發(fā)現(xiàn)有害作用是進(jìn)行劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究的前提。 1.受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)。在急性和慢性毒性試驗中，觀22 2.劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究。劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究是毒性評價和安全性評價的基礎(chǔ)。在急性(致死性)毒性試驗中，應(yīng)該得到LD50（半數(shù)致死劑量/濃度），也可以得到LD01（最小致死劑量或濃度）和MTD（最大耐受劑量或濃度）。在急性非致死性毒性試驗中，可應(yīng)該得到急性可觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)和未觀察到有害作用的劑量(NOAEL)。在亞急性、亞慢性及慢性毒性試驗中，可得到相應(yīng)的LOAEL和NOAEL。在致突變、致癌和致畸等特殊毒性試驗中，劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究將為確定受試物是否具有這些特殊毒性提供依據(jù)。在致畸試驗也可得到LOAEL和NOAEL；在致突變、致癌試驗中，盡管認(rèn)為是無閾值的，但也可得到表觀的LOAEL和NOAEL。 2.劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究。劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究是毒性23

3.確定毒作用的靶器官。確定受試物有害作用的靶器官，是毒理學(xué)研究的重要目的，以闡明受試物毒作用的特點，并為進(jìn)一步的機(jī)制研究和毒性防治提供線索。 3.確定毒作用的靶器官。確定受試物有害作用的靶器官，是毒244.確定損害的可逆性。一旦確認(rèn)有害作用存在，就應(yīng)研究停止接觸后該損害是否可逆和消失，器官和組織功能是否能恢復(fù)，還是像化學(xué)致癌作用那樣停止接觸后損害繼續(xù)發(fā)展？毒性的可逆性關(guān)系到對人的危害評價，如果受損的器官組織能夠修復(fù)并恢復(fù)正常功能，則可能接受較高危險性的接觸水平。4.確定損害的可逆性。25描述性動物毒性實驗1、急性致死性毒性實驗2、皮膚和眼刺激試驗3、致敏試驗4、亞急性（重復(fù)劑量）毒性試驗5、亞慢性毒性試驗6、慢性毒性試驗7、發(fā)育和生殖毒性試驗8、致突變試驗描述性動物毒性實驗1、急性致死性毒性實驗26急性致死性毒性實驗 對新化合物首先進(jìn)行的第一個試驗，是使用一種或一種以上的動物，通過一種或一種以上的途徑（其中一種途徑為經(jīng)口途徑，或其他有意攝入的途徑）測定LD50和其他毒效應(yīng)的試驗。最常使用的動物是小鼠和大鼠，但有時也用家兔和狗。受試動物包括雌雄兩性成年動物，染毒前往往隔夜禁食。記錄一次染毒后14天內(nèi)動物死亡的數(shù)目。除死亡和體重改變外，每天還要觀察受試動物的中毒癥狀、活動狀況、行為改變、患病情況、食物利用率等。急性致死性毒性實驗27亞慢性毒性試驗 染毒期限有時不同，最常采納的實驗期限是90天。最主要目的是確定“無可觀察到作用劑量（NOAEL）”，并進(jìn)一步確認(rèn)重復(fù)染毒情況下，受試物毒作用的特異靶器官。除受試物種的NOAEL外，還可獲得“觀察到有害作用的最小劑量（LOAEL）”。 亞慢性毒性試驗一般選擇2種動物（大鼠和狗），采用與預(yù)定實際接觸相一致的染毒途徑（常為經(jīng)口途徑）。亞慢性毒性試驗28慢性毒性試驗 除了實驗期限超過3個月以外，長期或慢性毒性試驗的進(jìn)行在其他方面都類似于亞慢性實驗。慢性毒性試驗染毒期間對嚙齒類一般為6個月至2年的時間，對非嚙齒類通常為1年甚至更長。染毒持續(xù)時間在某種程度上取決于人類實際接觸時間。 目的是評價化學(xué)物的蓄積毒性。慢性毒性試驗29致突變試驗致突變作用是化學(xué)物引起細(xì)胞核遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的能力。這種改變是可以通過細(xì)胞分裂傳遞給下一代細(xì)胞的。突變可以發(fā)生于兩種類型的細(xì)胞，產(chǎn)生本質(zhì)上不同的后果。生殖細(xì)胞突變：引起精細(xì)胞和卵細(xì)胞的DNA損傷，并可通過減數(shù)分裂將突變遺傳到子代細(xì)胞。體細(xì)胞突變是指發(fā)生在精、卵細(xì)胞以外所有其他種類細(xì)胞的突變。體細(xì)胞突變是不遺傳的，但可以通過有絲分裂將遺傳缺陷傳遞給同一組織的其他細(xì)胞，也可能引起細(xì)胞死亡。致突變試驗30第三節(jié)實驗動物的選擇和處理

1、實驗動物物種的選擇基本原則

選擇對受試物在代謝、生物化學(xué)和毒理學(xué)特征與人最接近的物種自然壽命不太長的物種易于飼養(yǎng)和實驗操作的物種經(jīng)濟(jì)并易于獲得的物種第三節(jié)實驗動物的選擇和處理1、實驗動物物種的選擇31

目前常規(guī)選擇物種的方式是利用兩個物種，一種是嚙齒類，另一種是非嚙齒類。系統(tǒng)毒性研究最常用的嚙齒類是大鼠和小鼠，非嚙齒類是狗。豚鼠常用于皮膚刺激試驗和致敏試驗。兔常用于皮膚刺激試驗和眼刺激試驗。遺傳毒理學(xué)試驗多用小鼠，致癌試驗常用大鼠和小鼠，致畸試驗常用大鼠、小鼠和兔。遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗常用母雞。目前常規(guī)選擇物種的方式是利用兩個物種，一種是嚙齒類，另一種32常用實驗動物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)常用實驗動物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)33食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件342、實驗動物品系的選擇品系(strain)指用計劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一群動物。

實驗動物按遺傳學(xué)控制分類可分為：①近交系：指全同胞兄妹或親子之間連續(xù)交配20代以上而培育的純品系動物。如小鼠有津白I、津白Ⅱ、615，DBA／1和DBA／2，BALB/C，C3H，C57B／6J，A和A／He等。②雜交群動物(雜交1代，F(xiàn)1)，指兩個不同的近交系之間有目的進(jìn)行交配，所產(chǎn)生的第一代動物。③封閉群：一個種群在五年以上不從外部引進(jìn)新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所隨機(jī)交配繁殖的動物群。如昆明種小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、F344大鼠、Wistar大鼠、SD(Sprague-Dauley)大鼠等。

2、實驗動物品系的選擇35根據(jù)實驗動物遺傳的均一性排序，近交系最高、雜交群次之、封閉群較低。不同品系實驗動物對外源化學(xué)物毒性反應(yīng)有差別，所以毒理學(xué)研究要選擇適宜的品系，對某種外源化學(xué)物毒理學(xué)系列研究中應(yīng)固定使用同一品系動物，以求研究結(jié)果的穩(wěn)定性。根據(jù)實驗動物遺傳的均一性排序，近交系最高、雜交群次之、封閉群36對于毒性試驗及毒理學(xué)研究應(yīng)盡可能使用二級(或二級以上)的動物。對于毒性試驗及毒理學(xué)研究應(yīng)盡可能使用二級(或二級以上)的動物37I級：CV(conventionalanimal)開放系統(tǒng)，普通飼養(yǎng)，大批生產(chǎn)，成本低，是最低級別的實驗動物。CV廣泛應(yīng)用于教學(xué)、預(yù)試驗及一些要求不嚴(yán)的短期試驗，生物制品生產(chǎn)。嚴(yán)格意義上講，CV不適合于科學(xué)研究。盡管如此，CV祖先來自于無特定病原體動物(SPF)，剖腹產(chǎn)后普通化，即開放飼養(yǎng)。CV在飼料配方，飲水，室內(nèi)溫、濕度、光照、噪聲仍應(yīng)符合國家標(biāo)準(zhǔn)。市售和來歷不明的動物為“無證動物”，試驗結(jié)果不予承認(rèn)。I級：CV(conventionalanimal)開放系38II級：CL（Cleananimal）親代是SPF或GF，屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)。質(zhì)量控制要求介于CV與SPF之間。國外無此級別，國外一般均采用SPF或GF。國內(nèi)由于發(fā)展水平條件所限，作為一種過渡，暫可作為標(biāo)準(zhǔn)實驗動物用于一般的科學(xué)研究。屏障系統(tǒng)：空氣經(jīng)過一定的過濾凈化，飼養(yǎng)環(huán)境保持正壓，進(jìn)入系統(tǒng)的一切物品：飼料、飲水、用具等均需經(jīng)嚴(yán)格滅菌處理。工作人員進(jìn)出消毒，衣、帽、手套、口罩均需消毒。飲水除高壓消毒外，還應(yīng)酸化和過濾凈化。II級：CL（Cleananimal）親代是SPF或GF，39III級：SPF(specificpathogenfreeanimal)屬健康無病動物，動物質(zhì)量高，適合長期慢性實驗，并能取得可靠實驗結(jié)果。廣泛應(yīng)用于藥學(xué)、毒理學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、傳染病學(xué)、多種診斷和疫苗生產(chǎn)，以及生物制品鑒定中。III級：SPF(specificpathogenfr40IV級：GF(germfreeanimal)GF:

無菌剖腹產(chǎn)，在絕對隔離器中養(yǎng)育。（塑料薄膜無菌隔離器）應(yīng)用：①在實驗動物領(lǐng)域應(yīng)用；②在免疫學(xué)方面應(yīng)用：是研究免疫發(fā)生機(jī)理與生產(chǎn)高效優(yōu)質(zhì)疫苗的最理想動物。③用于微生物學(xué)研究：研究微生態(tài)學(xué)的最理想的動物模型。④腫瘤學(xué)研究：是研究致癌機(jī)理，防癌、抗癌藥物篩選的理想動物。IV級：GF(germfreeanimal)GF:41⑤營養(yǎng)學(xué)研究：是研究營養(yǎng)學(xué)的良好模型。GF動物不僅用來觀察腸道內(nèi)細(xì)菌對代謝的影響，還用于研究限制采食，對壽命，免疫力的影響，無菌動物對諸多營養(yǎng)機(jī)理的分析將起到更重要的作用。⑥毒理與藥理學(xué)研究：最適合于進(jìn)行慢性毒性實驗，適合于新藥毒性及安全性評估。在微生態(tài)制劑、生物制品、抗菌素試驗研究方面具有明顯優(yōu)勢。⑦老年醫(yī)學(xué)：無菌動物是最理想的衰老模型，無菌動物壽命明顯延長。⑧其次：在放射醫(yī)學(xué)、口腔醫(yī)學(xué)、軍事、航天、環(huán)境醫(yī)學(xué)等方面都有廣泛應(yīng)用。⑤營養(yǎng)學(xué)研究：是研究營養(yǎng)學(xué)的良好模型。GF動物不僅用來觀察腸424、個體選擇性別

如果已知不同性別的動物對受試物敏感性不同，應(yīng)選擇敏感的性別。如對性別差異不清楚，則應(yīng)選用雌雄兩種性別。如實驗中發(fā)現(xiàn)存在性別差異，則應(yīng)將不同性別動物的實驗結(jié)果分別統(tǒng)計分析。年齡和體重在幼年期和老年期，對外源化學(xué)物的生物轉(zhuǎn)運(yùn)和生物轉(zhuǎn)化，靶器官和受體的敏感性均與成年期不同。毒理學(xué)試驗選用實驗動物的年齡取決于試驗的類型。4、個體選擇43生理狀態(tài)妊娠影響體重及其他指標(biāo)的檢測結(jié)果，且性激素對外源化學(xué)物代謝轉(zhuǎn)化有影響，應(yīng)選用未產(chǎn)未孕的雌性動物。健康狀況應(yīng)選用健康動物：發(fā)育正常、體形健壯，無外觀畸形，被毛濃密、有光澤、順貼而不蓬亂，行動靈活、反應(yīng)敏捷，眼睛明亮有神，表皮無潰瘍和結(jié)癡，天然孔道干凈無分泌物等。 為確保選擇健康動物，一般在實驗前觀察5～7天。對于大鼠和狗的亞慢性和慢性試驗，可在實驗前采血進(jìn)行血液學(xué)和血液生化學(xué)檢查，異常的動物應(yīng)剔除；對狗應(yīng)常規(guī)驅(qū)除腸道寄生蟲。生理狀態(tài)妊娠影響體重及其他指標(biāo)的檢測結(jié)果，且性激素44五、實驗動物喂養(yǎng)環(huán)境實驗動物喂養(yǎng)室室溫應(yīng)控制在（22±3）℃，家兔可控制在（20±3）℃，相對濕度30%~70%，無對流風(fēng)。人工晝夜周期，即使動物處于人工調(diào)控的12小時白晝(早6點至晚6點)及12小時黑夜(晚6點至次日早6點)，以穩(wěn)定其生物時間節(jié)律。五、實驗動物喂養(yǎng)環(huán)境實驗動物喂養(yǎng)室室溫應(yīng)控制在（22±3）℃45第四節(jié)食品毒理學(xué)試驗設(shè)計要點一、體內(nèi)毒理學(xué)試驗設(shè)計

1.劑量分組一般至少要設(shè)3個劑量組(即高劑量組、中劑量組、低劑量組)。高劑量組應(yīng)出現(xiàn)明確的有害作用，低劑量組應(yīng)不出現(xiàn)任何可觀察到的有害作用(即相當(dāng)于NOAEL)，但低劑量組劑量應(yīng)當(dāng)高于人可能的接觸劑量，至少等于人可能的接觸劑量。中劑量組的劑量介于高劑量組和低劑量組之間，應(yīng)出現(xiàn)輕微的毒性效應(yīng)(即相當(dāng)于LOAEL)。第四節(jié)食品毒理學(xué)試驗設(shè)計要點一、體內(nèi)毒理學(xué)試驗設(shè)計461）急性毒性實驗

查閱文獻(xiàn)，找出與受試化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化合物的毒性資料，并以其LD50(LC50)值作為受試化合物的預(yù)其毒性中值；但應(yīng)注意，一定是相同動物種系和相同接觸途徑。以此預(yù)期毒性中值為待測化合物的中間劑量組，再上下各推一到兩個劑量組做預(yù)試驗。每個劑量組間的組距可以大些，有利于找出受試化合物的致死劑量范圍。初起組距可用劑量間的4倍差，即以log4(log4＝0.6)來劃分各組劑量。一般設(shè)置57個劑量組即可，它即符合統(tǒng)計計算要求又可節(jié)省人力和財力。每個劑量組的動物數(shù)，小鼠不少于10只、大鼠68只、家兔46只，若設(shè)計采用霍恩氏法計算LD50時，動物數(shù)可減少。每組動物應(yīng)雌雄各半；如化合物毒性有性別差異，則應(yīng)分別求雌、雄性動物各自的LD50(LC50)。1）急性毒性實驗472）亞慢性毒性實驗亞慢性試驗的上限劑量，需控制在實驗動物接觸受試化合物的整個過程中，不發(fā)生死亡或僅有個別動物死亡，但有明顯的中毒效應(yīng)，或靶器官出現(xiàn)典型的損傷。此劑量的確定可參考兩個數(shù)值，一是以急性毒性的閾劑量為亞慢性試驗的最高劑量；一是以此化合物L(fēng)D50的1/201/5為最高劑量?；衔飦喡远拘栽囼瀾?yīng)求出其劑量－反應(yīng)關(guān)系，為此，亞慢性試驗至少應(yīng)設(shè)計三個染毒劑量組及一個正常動物對照組，必要時再加一個受試化合物的溶劑對照組。最低劑量組的劑量應(yīng)相當(dāng)于亞慢性的閾劑量水平或未觀察到作用水平，中間劑量組動物以出現(xiàn)輕微中毒效應(yīng)為度。2）亞慢性毒性實驗483）慢性毒性實驗

為制定外來化合物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)而進(jìn)行慢性毒性試驗時，一般設(shè)3個染毒劑量組和1個對照組，必要時另設(shè)一個溶劑對照組，即無作用劑量組、閾劑量組、發(fā)生比較輕微毒性效應(yīng)的劑量組(此為最高劑量組)。以求出明確的劑量－反應(yīng)關(guān)系。染毒組劑量的選擇可參考三組數(shù)據(jù)。一是以亞慢性閾劑量為出發(fā)點，即以亞慢性閾劑量或其1/51/2劑量為慢性毒性試驗的最高劑量，以這一閾劑量的1/501/10為慢性毒性試驗的預(yù)計閾劑量組，并以其1/100為預(yù)計的慢性無作用劑量組；一是以急性毒性的LD50劑量為出發(fā)點，即以LD50的1/10劑量為慢性試驗的最高劑量。以LD50的1/100為預(yù)計慢性閾劑量，以LD50的1/1000為預(yù)計的無作用劑量組。各染毒劑量組之間的劑量間距應(yīng)當(dāng)大些，有利于求出劑量-反應(yīng)關(guān)系，也有助于排除實驗動物個體敏感性差異。組間劑量差一般以510倍為宜，最低不小于兩倍。3）慢性毒性實驗49毒理學(xué)試驗常用的對照有4種：

未處理對照組不施加任何處理因素。陰性(溶劑／賦形劑)對照不給處理因素但給以必須的實驗因素(溶劑／賦形劑)，以排除此實驗因素(溶劑／賦形劑)的影響，陽性對照用已知的陽性物(如致突變物)檢測試驗體系的有效性。陽性對照組最好與受試物用相同的溶劑、染毒途徑及采樣時間。歷史性對照由本實驗室過去多次實驗的對照組數(shù)據(jù)組成，上述三種對照都可構(gòu)成相應(yīng)的歷史對照。

毒理學(xué)試驗常用的對照有4種：50各組動物數(shù)應(yīng)考慮到統(tǒng)計學(xué)的要求。試驗期限某些試驗(如致畸試驗和多代生殖試驗)的試驗期限是由受試實驗動物物種或品系而決定的。而其他毒性試驗的期限在某種程度上由定義所決定。各組動物數(shù)應(yīng)考慮到統(tǒng)計學(xué)的要求。51急性毒性是一次或1天內(nèi)多次染毒觀察14天。一般要求計算兩周內(nèi)的總死亡數(shù)。對于一些速死性化合物求其LD50(LC50)也可僅計算24小時的死亡率，有些速殺性化合物的24小時LD50與兩周LD50值往往沒有差別。但應(yīng)注明是多少時間的LD50值，以便于在進(jìn)行毒性比較時有共同的基礎(chǔ)。急性毒性是一次或1天內(nèi)多次染毒觀察14天。一般要求計算52亞慢性毒性試驗規(guī)定為染毒持續(xù)至實驗動物壽命的10％，對大鼠和小鼠為90天，對狗應(yīng)為1年。一般認(rèn)為在環(huán)境毒理學(xué)與食品毒理學(xué)中所要求的連續(xù)接觸為3～6個月，而在工業(yè)毒理學(xué)中認(rèn)為1～3月即可。慢性毒性試驗／致癌試驗一般規(guī)定為持續(xù)至實驗動物壽命的大部分。又可分為兩類，即規(guī)定試驗期限的試驗，或直到最敏感的組死亡率達(dá)到某一水平(通常為80％)的試驗。一般認(rèn)為工業(yè)毒理學(xué)慢性試驗動物染毒6個月或更長時間；而環(huán)境毒理學(xué)與食品毒理學(xué)則要求實驗動物染毒1年以上或2年。也有學(xué)者主張動物終生接觸外來化合物才能全面反映外來化合物的慢性毒性效應(yīng)，以及求出閾劑量或無作用劑量。亞慢性毒性試驗規(guī)定為染毒持續(xù)至實驗動物壽命的10％，對53二、體外毒理學(xué)試驗設(shè)計測定受試物溶解性試驗最高劑量的推薦大多數(shù)情況下，可溶性受試物的試驗上限應(yīng)該是：(1)對哺乳動物細(xì)胞為10mmol/L或5mg/ml。(2)對細(xì)菌試驗為5mg/平板。

代謝活化常規(guī)使用Aroclor1254（多氯聯(lián)苯1254）預(yù)處理的雄性成年大鼠肝勻漿90000g離心上清液(S9)，及相應(yīng)的輔因子(NADPH再生系統(tǒng))。

陽性對照陽性對照的劑量應(yīng)選擇其劑量-反應(yīng)的直線部分。重復(fù)可疑結(jié)果則應(yīng)重復(fù)實驗，最好改變劑量范圍／劑量間隔、改變S9濃度或改變實驗方法進(jìn)行重復(fù)。

二、體外毒理學(xué)試驗設(shè)計測定受試物溶解性54第五節(jié)實驗動物的染毒和處置

一、動物實驗前的準(zhǔn)備購進(jìn)之后，應(yīng)雌雄分開飼養(yǎng)進(jìn)行5～7天的檢疫實驗動物的標(biāo)記嚙齒動物染色法苦味酸(黃色)、品紅(紅色)的酒精飽和溶液在動物被毛上染色嚙齒動物剪耳法

狗等大動物掛牌法

分組按性別、體重順序編號，隨機(jī)分組

第五節(jié)實驗動物的染毒和處置一、動物實驗前的準(zhǔn)備55二、受試物和樣品的準(zhǔn)備了解受試物的純度、雜質(zhì)成分、化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)檢索相似化合物的毒性資料，以作參考受試物應(yīng)一次備齊全部實驗的用量所需受試物總量＝(A×B×C×D)×1.2式中：A為每組動物數(shù)；B為各處理組的劑量之和(如0.1+0.3+1.0mg/kg＝1.4mg/kg)；C為染毒次數(shù)(通常為天)；D為動物的平均體重；1.2為安全因子，防止損耗。二、受試物和樣品的準(zhǔn)備56將受試物制備成一定的劑型常制備成水溶液、油溶液或混懸液。溶劑或助溶劑應(yīng)該是無毒的，與受試物不起反應(yīng)，受試物在溶液中應(yīng)穩(wěn)定。水溶性受試物水、等滲鹽水水不溶性受試物溶于或懸浮于適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中各種染毒途徑的最大容積，以受試的實驗動物物種或制劑來確定。一般規(guī)定，染毒最大容積為：①經(jīng)口20ml/kg(對空腹動物)；②經(jīng)皮2ml/kg(根據(jù)體表面積計算，限于染毒的準(zhǔn)確性)；③靜脈1ml/kg(5分鐘以上)；④肌肉注射0.5ml/kg(一個部位)；⑤每眼0.01ml；⑥直腸0.5ml/kg；⑦陰道：大鼠0.2m1，兔1ml；⑧吸入2mg/L；⑨鼻：猴或狗每鼻孔0.1ml。

將受試物制備成一定的劑型常制備成水溶液、油溶液57三、染毒途徑最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。經(jīng)口(胃腸道)染毒

常用有灌胃、喂飼和吞咽膠囊等方式。

灌胃：將受試物配制成溶液或混懸液，以注射器經(jīng)導(dǎo)管注入胃內(nèi)。吞咽膠囊：將一定劑量的受試物裝入膠囊中，放至狗的舌后部，迫使動物咽下。喂飼：將受試物摻入動物飼料或飲水中供實驗動物自行攝入。

三、染毒途徑58

經(jīng)呼吸道染毒

經(jīng)呼吸道染毒可分為吸入染毒和氣管內(nèi)注入。

靜式吸入染毒：將一定數(shù)量的嚙齒類動物放在密閉的染毒柜中，加入易揮發(fā)的液態(tài)受試物或氣態(tài)受試物使成一定濃度。動式吸入染毒：由染毒柜、機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)和配氣系統(tǒng)三部分構(gòu)成。又分為整體接觸和口鼻接觸兩種。氣管內(nèi)注入：實驗動物在麻醉后，將受試物注入氣管，使之分布至兩肺。

經(jīng)呼吸道染毒

經(jīng)呼吸道染毒可分為吸入染毒和氣59經(jīng)皮膚染毒

經(jīng)皮染毒毒性試驗皮膚刺激和致敏試驗

試驗前用機(jī)械法(剃毛)或化學(xué)法(硫化鈉或硫化鋇)脫毛。不應(yīng)損傷脫毛區(qū)的表皮，脫毛區(qū)面積不大于動物體表面積的10％～15％。經(jīng)皮膚染毒60注射染毒

注射用藥品，應(yīng)以注射途徑染毒，對大小鼠可用靜脈注射，對非嚙齒類可模擬臨床用藥途徑。應(yīng)調(diào)整受試物的pH及滲透壓，pH應(yīng)5～8，最好是等滲溶液。靜脈注射應(yīng)控制速度。注射染毒61四、癥狀觀察急性毒性試驗應(yīng)詳細(xì)地觀察動物的中毒癥狀、發(fā)生和發(fā)展過程及規(guī)律，死亡前癥狀特點、死亡時間等等。

化合物經(jīng)口急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)四、癥狀觀察化合物經(jīng)口急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)62工業(yè)毒物急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)毒物急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)63亞慢性試驗觀察指標(biāo)1、一般性指標(biāo)1）.一般綜合性觀察指標(biāo)①動物體重②食物利用率③癥狀④臟器系數(shù)2）.一般化驗指標(biāo)主要指血象和肝、腎功能的檢測，在亞慢性試驗中研究外來化合物對實驗動物的毒性作用。2、病理學(xué)檢查慢性試驗其中包括體重、食物攝取、臨床癥狀、行為、血象和血液化學(xué)、尿的性狀及生化成分以及重點觀察在亞慢性毒性試驗中已經(jīng)顯現(xiàn)的陽性指標(biāo)。亞慢性試驗觀察指標(biāo)64五、實驗動物處死及生物標(biāo)本采集實驗動物處死方法

大小鼠可用頸椎脫臼法，然后股動脈放血。兔、豚鼠、狗等一般用股動脈放血處死。血液采集不影響動物生理功能的最大取血量為其總血量(50ml/kg體重)的10％。尿液采集

大小鼠可用代謝籠，下部有糞尿分離器。狗可用接尿法或?qū)蚍?。五、實驗動物處死及生物?biāo)本采集65病理解剖和標(biāo)本留取

毒性病理學(xué)檢查是毒理學(xué)試驗重要的組成部分，病理學(xué)研究有助于確定有害作用和靶器官。

大體解剖：在實驗動物處死后半小時內(nèi)進(jìn)行。觀察有關(guān)臟器的外形和表面情況、顏色、邊界和大小、質(zhì)地、切面。對指定的臟器稱重，并計算臟器系數(shù)。

組織病理學(xué)檢查：對指定的器官或組織用鋒利的刀剪取材，應(yīng)統(tǒng)一取材部位。組織塊一般在10倍體積的10％福爾馬林中固定，此后常規(guī)制片(組織石蠟包埋、切片、HE染色)。應(yīng)詳細(xì)記錄顯微鏡下觀察到的病變，并做出病理診斷。病理解剖和標(biāo)本留取

毒性病理學(xué)檢查是毒理學(xué)試驗重66食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件67第六節(jié)體外試驗在毒理學(xué)中的應(yīng)用

體外試驗?zāi)Ｐ?invitrotest)在判斷外源化學(xué)物及其制品和混合物等對人類健康是否具有損害作用過程中也起著重要的作用。原因：量大全世界每年約有千種以上的新化合物作為商品進(jìn)入人類的環(huán)境。而且在現(xiàn)有的化合物中，還有相當(dāng)數(shù)量沒有進(jìn)行必要的毒理學(xué)評價。節(jié)省時間和經(jīng)費動物保護(hù)主義運(yùn)動的興起生物技術(shù)為毒性試驗和研究提供的新方法和工具

第六節(jié)體外試驗在毒理學(xué)中的應(yīng)用

體外試驗?zāi)Ｐ?inv68一、概述

(一)分類依據(jù)體外試驗在決策過程中所起的作用將其分為3類：①篩選試驗僅提供決策過程的最初的資料②附加試驗為協(xié)作部門或法律部門的最終決策過程提供有用的資料③替代試驗在大量實驗的基礎(chǔ)上，使體外毒性試驗?zāi)芴娲w動物試驗一、概述

(一)分類69(二)基本原理體外試驗的基本原理是——所觀察到的毒理學(xué)效應(yīng)均是毒物和／或反應(yīng)活性代謝產(chǎn)物在敏感性細(xì)胞上或敏感細(xì)胞內(nèi)某一分子靶部位作用的結(jié)果?；谏鲜鲈?，體外試驗?zāi)Ｐ腿〔姆秶軐挕?二)基本原理70(三)體外試驗的優(yōu)缺點體外毒性試驗系統(tǒng)的優(yōu)點能控制環(huán)境因素可排除相互作用的系統(tǒng)如免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響每一劑量水平可利用大量的生物樣品，如細(xì)胞，細(xì)胞器等試驗間的誤差較少可同時和／或反復(fù)多次取樣可做成復(fù)雜的互相作用的試驗系統(tǒng)，如復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)等較為快速和經(jīng)濟(jì)需要較小量的受試化合物產(chǎn)生較小量的有毒廢物可以利用人體細(xì)胞減少整體動物的使用

(三)體外試驗的優(yōu)缺點71其中特別值得一提的優(yōu)點是體外試驗的簡便和易于利用人體細(xì)胞。體外毒性試驗結(jié)果可迅速得出，將減少了解新化學(xué)物毒理學(xué)資料所需的時間，最終可以縮短從新化學(xué)物的合成到產(chǎn)品進(jìn)人市場的時間過程。此外，對鑒定毒理學(xué)資料有問題的新化學(xué)物，可及時終止開發(fā)，減少由資源到產(chǎn)品的投入。在毒理學(xué)整體試驗中禁止直接進(jìn)行人體試驗。目前主要是將動物試驗結(jié)果外推至人類，物種間差異為其不確定因素之一。在體外試驗中，利用人體細(xì)胞組織進(jìn)行試驗，可較好地解決物種差異的問題。

其中特別值得一提的優(yōu)點是體外試驗的簡便和易于利用人體細(xì)胞。72不足之處：①體外到體內(nèi)外推的問題體外試驗是依據(jù)毒性作用的始發(fā)階段及繼續(xù)發(fā)生的分子與細(xì)胞反應(yīng)，其與整體系統(tǒng)有差異。另一方面，體外毒性試驗中缺乏毒理學(xué)反應(yīng)的調(diào)控因素。②體外毒性試驗難以預(yù)測慢性毒性因為，慢性毒性病理過程的機(jī)理所知甚少，缺乏發(fā)展體外試驗的理論依據(jù)，再者，某些體外系統(tǒng)仍難以達(dá)到長期維持生理狀態(tài)的要求。不足之處：73二、體外試驗系統(tǒng)(一)臟器灌流肝臟灌流是毒理學(xué)中研究外源化合物對肝臟損傷及代謝的常見方法。在灌流液中加入外源化學(xué)物，此外要維持灌流液的pH值、氧含量，還要控制適宜的灌流液流速。需指出肝灌流時間不能過久，以4h之內(nèi)為宜，否則肝細(xì)胞的功能與生存不能維持。腸灌流利用某一部分小腸體外灌流可以研究一些化合物的吸收及動力學(xué)過程。膈肌-膈神經(jīng)標(biāo)本

取完整的大鼠膈肌-膈神經(jīng)置于恒溫灌流液中，在幾小時之內(nèi)可維持基本正常的神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)。

二、體外試驗系統(tǒng)(一)臟器灌流74(二)臟器切片肝臟、腎臟、腦部及心均可以制備切片。需注意切片中的細(xì)胞需保持完好的細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞之間的交流。優(yōu)點是保持了細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)，其操作也比臟器灌流容易。不足之處是切片內(nèi)的細(xì)胞易于缺氧，且受試物也不易均勻到達(dá)細(xì)胞內(nèi)。(二)臟器切片75(三)原代細(xì)胞培養(yǎng)肝細(xì)胞原代培養(yǎng)一般認(rèn)為，用原代肝細(xì)胞培養(yǎng)篩檢與鑒定是否化學(xué)物具有肝臟毒性較為可靠，與體內(nèi)試驗相符合。巨噬細(xì)胞可以用于多種體外試驗。淋巴細(xì)胞多用小動脈脾臟分離淋巴細(xì)胞或進(jìn)一步分離T、B淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫毒理研究。腦細(xì)胞分離的新鮮腦細(xì)胞有助于研究外源化學(xué)物對神經(jīng)系統(tǒng)損傷的評價與探討其機(jī)理。心肌細(xì)胞用于毒理學(xué)研究的報道目前還較少。

(三)原代細(xì)胞培養(yǎng)76(四)細(xì)胞培養(yǎng)

1.腎細(xì)胞由于腎小管，尤其是腎近曲管是腎臟重要的功能單位，目前已經(jīng)建立了幾種腎近曲管細(xì)胞株系用于毒理學(xué)研究。2.胚胎細(xì)胞利用胚胎細(xì)胞體外培養(yǎng)，篩檢和研究外源化學(xué)物的毒性效應(yīng)。人胚主動脈平滑肌細(xì)胞也可作為標(biāo)本傳代培養(yǎng)研究金屬的毒理。(四)細(xì)胞培養(yǎng)77(五)組織勻漿制備組織勻漿是用物理學(xué)方法使細(xì)胞壁破壞，細(xì)胞組成成分與細(xì)胞間質(zhì)混合形成混懸液。利用勻漿為標(biāo)本主要是研究外源化學(xué)物對細(xì)胞酶系統(tǒng)的毒理作用。最常使用的是腦勻漿、肝勻漿。(五)組織勻漿78(六)亞細(xì)胞組分

將細(xì)胞中各亞細(xì)胞組分分離和純化，對于深入研究外源化學(xué)物的靶位點、探討化學(xué)物毒性效應(yīng)的機(jī)理均十分重要。

細(xì)胞膜紅細(xì)胞、肺巨噬細(xì)胞、肺細(xì)胞、突觸小體等均可制備膜標(biāo)本。使用細(xì)胞膜可以進(jìn)行很多的毒理試驗，尤其是在探討化學(xué)物中毒機(jī)理方面。微粒體(microsome)

尤其是肝細(xì)胞制備的微粒體常作為毒理學(xué)研究的標(biāo)本，這是由于肝臟代謝酶系主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，即肝細(xì)胞的亞細(xì)胞組分分離后的微粒體中。線粒體(mitochondria)

它是細(xì)胞中進(jìn)行呼吸作用的主要場所。

(六)亞細(xì)胞組分79(七)酶

外源化學(xué)物對機(jī)體的毒性效應(yīng)，往往表現(xiàn)某種或某些酶的活性變化上，即可以利用標(biāo)志酶活性的變化反映化學(xué)物所損傷的靶器官。在體外毒理學(xué)中則主要是定量研究外源化學(xué)物對靶酶作用的特征、性質(zhì)和機(jī)理。(七)酶

80食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)81主要內(nèi)容第一節(jié)食品毒理學(xué)實驗的原則和局限性

第二節(jié)毒理學(xué)毒性評價試驗的基本目的

第三節(jié)實驗動物的選擇和處理

第四節(jié)食品毒理學(xué)試驗設(shè)計要點

第五節(jié)實驗動物的染毒和處置

第六節(jié)體外試驗在毒理學(xué)中的應(yīng)用主要內(nèi)容第一節(jié)食品毒理學(xué)實驗的原則和局限性82食品毒理學(xué)作為一門實驗科學(xué)，以動物實驗為中心。食品毒理學(xué)研究的主要手段是動物實驗。食品毒理學(xué)動物實驗的設(shè)計、實施、結(jié)果觀察和評價是毒理學(xué)研究的基本方法。食品毒理學(xué)作為一門實驗科學(xué)，以動物實驗為中心。83食品毒理學(xué)研究的主要手段是動物、實驗。

體內(nèi)試驗是以實驗動物為模型，最終目的是通過外源化學(xué)物對實驗動物的毒性反應(yīng)，向人(原型)外推，以期評估外源化學(xué)物對人的危害及危險性。體外實驗主要用于篩選和預(yù)測急性毒性和機(jī)制研究。食品毒理學(xué)研究的主要手段是動物、實驗。84以科學(xué)研究為目的而進(jìn)行科學(xué)飼養(yǎng)繁殖的動物稱為實驗動物。★實驗動物種類：常見包括：大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、狗、貓、猴、小型豬、雞、青蛙、蟾蜍、魚類等。以科學(xué)研究為目的而進(jìn)行科學(xué)飼養(yǎng)繁殖的動物稱85豚鼠：特點是毛短而光滑，生長快，抗病力強(qiáng)，繁殖性能好。廣泛用于藥物學(xué)、傳染病學(xué)、免疫學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、耳科學(xué)等各項醫(yī)學(xué)及生物學(xué)的研究中。

豚鼠：特點是毛短而光滑，生長快，抗病力強(qiáng)，繁殖性能好。廣泛用86SD大鼠：白色，產(chǎn)仔多，生長發(fā)育較Wistar大鼠為快，對疾病的抵抗力尤以呼吸道疾病的抵抗力強(qiáng)。自發(fā)腫瘤發(fā)生率較低，對性激素感受性高。SD大鼠：白色，產(chǎn)仔多，生長發(fā)育較Wistar大鼠為快，對疾87BALB/c小鼠：對致癌因子敏感，對放射性照射極為敏感。生產(chǎn)性能良好，繁殖期長，廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、核醫(yī)學(xué)和單克隆抗體等研究。BALB/c小鼠：對致癌因子敏感，對放射性照射極為敏感。生產(chǎn)88食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件89意義:實驗動物是生命科學(xué)（生物、醫(yī)學(xué)、食品等）研究的重要基礎(chǔ)和支撐條件，在科研、教學(xué)、生產(chǎn)、檢定、安全評價和成果評定中都離不開實驗動物，被稱為“活的儀器、活試劑”。英國一位科學(xué)家曾這樣比喻：“在生命科學(xué)研究中使用實驗動物就象在分析化學(xué)中使用分析天平一樣重要”。意義:90

落戶武漢大學(xué)實驗動物中心的慰靈碑，旨在紀(jì)念在抗非典疫苗和藥物實驗中為人類健康獻(xiàn)身的38只恒河猴

落戶武漢大學(xué)實驗動物中心的慰靈碑，旨在紀(jì)念在91第一節(jié)食品毒理學(xué)實驗的原則和局限性

食品毒理學(xué)實驗的原則化學(xué)物在實驗動物產(chǎn)生的作用，可以外推于人實驗動物必須暴露于高劑量成年的健康實驗動物(雄性和雌性未孕)和人可能的暴露途徑是基本的選擇代表性、可重復(fù)性第一節(jié)食品毒理學(xué)實驗的原則和局限性食品毒理學(xué)實驗的原92化學(xué)物在實驗動物產(chǎn)生的作用，可以外推于人①人是最敏感的動物物種；②人和實驗動物的生物學(xué)過程包括化學(xué)物的代謝，與體重(或體表面積)相關(guān)。這兩個假設(shè)也是全部實驗生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的前提。以單位體表面積計算在人產(chǎn)生毒作用的劑量和實驗動物通常相近似。而以體重計算則人通常比實驗動物敏感，差別可能達(dá)10倍。因此可以利用安全系數(shù)來計算人的相對安全劑量?；瘜W(xué)物在實驗動物產(chǎn)生的作用，可以外推于人93第二個原則是實驗動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對人潛在危害的必需的和可靠的方法。毒理學(xué)試驗中，一般要設(shè)3個或3個以上劑量組，以觀察劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系，確定受試化學(xué)物引起毒效應(yīng)及其毒性參數(shù)。引起毒效應(yīng)的最低劑量(LOAEL)與人的暴露劑量接近時，說明該化學(xué)物不安全。當(dāng)該劑量與人的暴露劑量有很大的距離(幾十倍，幾百倍或以上)，才認(rèn)為具有一定安全性，此距離越大，安全性越可靠。第二個原則是實驗動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對人潛在危害的94第三個原則，成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物和人可能的暴露途徑是基本的選擇。不能重復(fù)的實驗結(jié)果是沒有任何科學(xué)價值的。選用成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物是為了使實驗結(jié)果具有代表性和可重復(fù)性。以成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物作為一般人群的代表性實驗?zāi)Ｐ?，而將幼年和老年動物、妊娠的雌性動物、疾病狀態(tài)作為特殊情況另作研究。這樣可降低實驗對象的多樣性，減少實驗誤差。第三個原則，成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物和人可95

食品毒理學(xué)實驗的局限性用實驗動物的毒理學(xué)實驗資料外推到人群接觸的安全性時，會有很大的不確定性實驗動物和人對外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感性不同，有時甚至存在著質(zhì)的差別高劑量向低劑量外推的不確定性小數(shù)量實驗動物到大量人群外推的不確定性成年健康動物與不同的人種、種族，而且包括年老體弱及患病的個體之間的易感性不同食品毒理學(xué)實驗的局限性96首先，實驗動物和人對外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感性不同，有時甚至存在著質(zhì)的差別。雖然在毒理學(xué)實驗中通過用兩種或兩種以上的動物，并盡可能選擇與人對毒物反應(yīng)相似的動物，但要完全避免物種差異是不可能的。而且在動物實驗中，可觀察到體征(sign)，而沒有癥狀(symptom)。實驗動物不能述說涉及主觀感覺的毒效應(yīng)，如疼痛、腹脹、疲乏、頭暈、眼花、耳鳴等，這些毒效應(yīng)就難以或不可能發(fā)現(xiàn)。首先，實驗動物和人對外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感性不同，有時甚至存在97第二，高劑量向低劑量外推的不確定性

在毒理學(xué)實驗中，為了尋求毒作用的靶器官，并能在相對少量的動物上就能得到劑量-反應(yīng)或劑量-效應(yīng)關(guān)系，往往選用較大的染毒劑量，這一劑量通常要比人實際接觸的劑量大得多。有些化學(xué)物在高劑量和低劑量的毒性作用規(guī)律并不一定一致，如大劑量下出現(xiàn)的反應(yīng)有可能是由于化學(xué)物在體內(nèi)超過了機(jī)體的代謝能力，這就存在高劑量向低劑量外推的不確定性。第二，高劑量向低劑量外推的不確定性98第三，毒理學(xué)實驗所用動物數(shù)量有限，那些發(fā)生率很低的毒性反應(yīng)，在少量動物中難以發(fā)現(xiàn)。而化學(xué)物一旦進(jìn)入市場，接觸人群往往會很大。這就存在小數(shù)量實驗動物到大量人群外推的不確定性。第三，毒理學(xué)實驗所用動物數(shù)量有限，那些發(fā)生率很低的毒性99四，實驗動物一般都是實驗室培育的品系，一般選用成年健康動物，反應(yīng)較單一，而接觸人群可以是不同的人種、種族，而且包括年老體弱及患病的個體，在對外源化學(xué)物毒性反應(yīng)的易感性上存在很大差異。四，實驗動物一般都是實驗室培育的品系，一般選用成年健康動物，100第二節(jié)毒理學(xué)毒性評價試驗的基本目的

包括以下幾點：受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究，可以得到該受試物的多種毒性參數(shù)確定毒作用的靶器官確定損害的可逆性第二節(jié)毒理學(xué)毒性評價試驗的基本目的包括以下幾點：101 1.受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)。在急性和慢性毒性試驗中，觀察受試物對機(jī)體的有害作用，對有害作用的觀察應(yīng)該是對每個實驗動物進(jìn)行全面的逐項的觀察和記錄。發(fā)現(xiàn)有害作用是進(jìn)行劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究的前提。 1.受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)。在急性和慢性毒性試驗中，觀102 2.劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究。劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究是毒性評價和安全性評價的基礎(chǔ)。在急性(致死性)毒性試驗中，應(yīng)該得到LD50（半數(shù)致死劑量/濃度），也可以得到LD01（最小致死劑量或濃度）和MTD（最大耐受劑量或濃度）。在急性非致死性毒性試驗中，可應(yīng)該得到急性可觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)和未觀察到有害作用的劑量(NOAEL)。在亞急性、亞慢性及慢性毒性試驗中，可得到相應(yīng)的LOAEL和NOAEL。在致突變、致癌和致畸等特殊毒性試驗中，劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究將為確定受試物是否具有這些特殊毒性提供依據(jù)。在致畸試驗也可得到LOAEL和NOAEL；在致突變、致癌試驗中，盡管認(rèn)為是無閾值的，但也可得到表觀的LOAEL和NOAEL。 2.劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究。劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究是毒性103

3.確定毒作用的靶器官。確定受試物有害作用的靶器官，是毒理學(xué)研究的重要目的，以闡明受試物毒作用的特點，并為進(jìn)一步的機(jī)制研究和毒性防治提供線索。 3.確定毒作用的靶器官。確定受試物有害作用的靶器官，是毒1044.確定損害的可逆性。一旦確認(rèn)有害作用存在，就應(yīng)研究停止接觸后該損害是否可逆和消失，器官和組織功能是否能恢復(fù)，還是像化學(xué)致癌作用那樣停止接觸后損害繼續(xù)發(fā)展？毒性的可逆性關(guān)系到對人的危害評價，如果受損的器官組織能夠修復(fù)并恢復(fù)正常功能，則可能接受較高危險性的接觸水平。4.確定損害的可逆性。105描述性動物毒性實驗1、急性致死性毒性實驗2、皮膚和眼刺激試驗3、致敏試驗4、亞急性（重復(fù)劑量）毒性試驗5、亞慢性毒性試驗6、慢性毒性試驗7、發(fā)育和生殖毒性試驗8、致突變試驗描述性動物毒性實驗1、急性致死性毒性實驗106急性致死性毒性實驗 對新化合物首先進(jìn)行的第一個試驗，是使用一種或一種以上的動物，通過一種或一種以上的途徑（其中一種途徑為經(jīng)口途徑，或其他有意攝入的途徑）測定LD50和其他毒效應(yīng)的試驗。最常使用的動物是小鼠和大鼠，但有時也用家兔和狗。受試動物包括雌雄兩性成年動物，染毒前往往隔夜禁食。記錄一次染毒后14天內(nèi)動物死亡的數(shù)目。除死亡和體重改變外，每天還要觀察受試動物的中毒癥狀、活動狀況、行為改變、患病情況、食物利用率等。急性致死性毒性實驗107亞慢性毒性試驗 染毒期限有時不同，最常采納的實驗期限是90天。最主要目的是確定“無可觀察到作用劑量（NOAEL）”，并進(jìn)一步確認(rèn)重復(fù)染毒情況下，受試物毒作用的特異靶器官。除受試物種的NOAEL外，還可獲得“觀察到有害作用的最小劑量（LOAEL）”。 亞慢性毒性試驗一般選擇2種動物（大鼠和狗），采用與預(yù)定實際接觸相一致的染毒途徑（常為經(jīng)口途徑）。亞慢性毒性試驗108慢性毒性試驗 除了實驗期限超過3個月以外，長期或慢性毒性試驗的進(jìn)行在其他方面都類似于亞慢性實驗。慢性毒性試驗染毒期間對嚙齒類一般為6個月至2年的時間，對非嚙齒類通常為1年甚至更長。染毒持續(xù)時間在某種程度上取決于人類實際接觸時間。 目的是評價化學(xué)物的蓄積毒性。慢性毒性試驗109致突變試驗致突變作用是化學(xué)物引起細(xì)胞核遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的能力。這種改變是可以通過細(xì)胞分裂傳遞給下一代細(xì)胞的。突變可以發(fā)生于兩種類型的細(xì)胞，產(chǎn)生本質(zhì)上不同的后果。生殖細(xì)胞突變：引起精細(xì)胞和卵細(xì)胞的DNA損傷，并可通過減數(shù)分裂將突變遺傳到子代細(xì)胞。體細(xì)胞突變是指發(fā)生在精、卵細(xì)胞以外所有其他種類細(xì)胞的突變。體細(xì)胞突變是不遺傳的，但可以通過有絲分裂將遺傳缺陷傳遞給同一組織的其他細(xì)胞，也可能引起細(xì)胞死亡。致突變試驗110第三節(jié)實驗動物的選擇和處理

1、實驗動物物種的選擇基本原則

選擇對受試物在代謝、生物化學(xué)和毒理學(xué)特征與人最接近的物種自然壽命不太長的物種易于飼養(yǎng)和實驗操作的物種經(jīng)濟(jì)并易于獲得的物種第三節(jié)實驗動物的選擇和處理1、實驗動物物種的選擇111

目前常規(guī)選擇物種的方式是利用兩個物種，一種是嚙齒類，另一種是非嚙齒類。系統(tǒng)毒性研究最常用的嚙齒類是大鼠和小鼠，非嚙齒類是狗。豚鼠常用于皮膚刺激試驗和致敏試驗。兔常用于皮膚刺激試驗和眼刺激試驗。遺傳毒理學(xué)試驗多用小鼠，致癌試驗常用大鼠和小鼠，致畸試驗常用大鼠、小鼠和兔。遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗常用母雞。目前常規(guī)選擇物種的方式是利用兩個物種，一種是嚙齒類，另一種112常用實驗動物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)常用實驗動物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)113食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)課件1142、實驗動物品系的選擇品系(strain)指用計劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一群動物。

實驗動物按遺傳學(xué)控制分類可分為：①近交系：指全同胞兄妹或親子之間連續(xù)交配20代以上而培育的純品系動物。如小鼠有津白I、津白Ⅱ、615，DBA／1和DBA／2，BALB/C，C3H，C57B／6J，A和A／He等。②雜交群動物(雜交1代，F(xiàn)1)，指兩個不同的近交系之間有目的進(jìn)行交配，所產(chǎn)生的第一代動物。③封閉群：一個種群在五年以上不從外部引進(jìn)新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所隨機(jī)交配繁殖的動物群。如昆明種小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、F344大鼠、Wistar大鼠、SD(Sprague-Dauley)大鼠等。

2、實驗動物品系的選擇115根據(jù)實驗動物遺傳的均一性排序，近交系最高、雜交群次之、封閉群較低。不同品系實驗動物對外源化學(xué)物毒性反應(yīng)有差別，所以毒理學(xué)研究要選擇適宜的品系，對某種外源化學(xué)物毒理學(xué)系列研究中應(yīng)固定使用同一品系動物，以求研究結(jié)果的穩(wěn)定性。根據(jù)實驗動物遺傳的均一性排序，近交系最高、雜交群次之、封閉群116對于毒性試驗及毒理學(xué)研究應(yīng)盡可能使用二級(或二級以上)的動物。對于毒性試驗及毒理學(xué)研究應(yīng)盡可能使用二級(或二級以上)的動物117I級：CV(conventionalanimal)開放系統(tǒng)，普通飼養(yǎng)，大批生產(chǎn)，成本低，是最低級別的實驗動物。CV廣泛應(yīng)用于教學(xué)、預(yù)試驗及一些要求不嚴(yán)的短期試驗，生物制品生產(chǎn)。嚴(yán)格意義上講，CV不適合于科學(xué)研究。盡管如此，CV祖先來自于無特定病原體動物(SPF)，剖腹產(chǎn)后普通化，即開放飼養(yǎng)。CV在飼料配方，飲水，室內(nèi)溫、濕度、光照、噪聲仍應(yīng)符合國家標(biāo)準(zhǔn)。市售和來歷不明的動物為“無證動物”，試驗結(jié)果不予承認(rèn)。I級：CV(conventionalanimal)開放系118II級：CL（Cleananimal）親代是SPF或GF，屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)。質(zhì)量控制要求介于CV與SPF之間。國外無此級別，國外一般均采用SPF或GF。國內(nèi)由于發(fā)展水平條件所限，作為一種過渡，暫可作為標(biāo)準(zhǔn)實驗動物用于一般的科學(xué)研究。屏障系統(tǒng)：空氣經(jīng)過一定的過濾凈化，飼養(yǎng)環(huán)境保持正壓，進(jìn)入系統(tǒng)的一切物品：飼料、飲水、用具等均需經(jīng)嚴(yán)格滅菌處理。工作人員進(jìn)出消毒，衣、帽、手套、口罩均需消毒。飲水除高壓消毒外，還應(yīng)酸化和過濾凈化。II級：CL（Cleananimal）親代是SPF或GF，119III級：SPF(specificpathogenfreeanimal)屬健康無病動物，動物質(zhì)量高，適合長期慢性實驗，并能取得可靠實驗結(jié)果。廣泛應(yīng)用于藥學(xué)、毒理學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、傳染病學(xué)、多種診斷和疫苗生產(chǎn)，以及生物制品鑒定中。III級：SPF(specificpathogenfr120IV級：GF(germfreeanimal)GF:

無菌剖腹產(chǎn)，在絕對隔離器中養(yǎng)育。（塑料薄膜無菌隔離器）應(yīng)用：①在實驗動物領(lǐng)域應(yīng)用；②在免疫學(xué)方面應(yīng)用：是研究免疫發(fā)生機(jī)理與生產(chǎn)高效優(yōu)質(zhì)疫苗的最理想動物。③用于微生物學(xué)研究：研究微生態(tài)學(xué)的最理想的動物模型。④腫瘤學(xué)研究：是研究致癌機(jī)理，防癌、抗癌藥物篩選的理想動物。IV級：GF(germfreeanimal)GF:121⑤營養(yǎng)學(xué)研究：是研究營養(yǎng)學(xué)的良好模型。GF動物不僅用來觀察腸道內(nèi)細(xì)菌對代謝的影響，還用于研究限制采食，對壽命，免疫力的影響，無菌動物對諸多營養(yǎng)機(jī)理的分析將起到更重要的作用。⑥毒理與藥理學(xué)研究：最適合于進(jìn)行慢性毒性實驗，適合于新藥毒性及安全性評估。在微生態(tài)制劑、生物制品、抗菌素試驗研究方面具有明顯優(yōu)勢。⑦老年醫(yī)學(xué)：無菌動物是最理想的衰老模型，無菌動物壽命明顯延長。⑧其次：在放射醫(yī)學(xué)、口腔醫(yī)學(xué)、軍事、航天、環(huán)境醫(yī)學(xué)等方面都有廣泛應(yīng)用。⑤營養(yǎng)學(xué)研究：是研究營養(yǎng)學(xué)的良好模型。GF動物不僅用來觀察腸1224、個體選擇性別

如果已知不同性別的動物對受試物敏感性不同，應(yīng)選擇敏感的性別。如對性別差異不清楚，則應(yīng)選用雌雄兩種性別。如實驗中發(fā)現(xiàn)存在性別差異，則應(yīng)將不同性別動物的實驗結(jié)果分別統(tǒng)計分析。年齡和體重在幼年期和老年期，對外源化學(xué)物的生物轉(zhuǎn)運(yùn)和生物轉(zhuǎn)化，靶器官和受體的敏感性均與成年期不同。毒理學(xué)試驗選用實驗動物的年齡取決于試驗的類型。4、個體選擇123生理狀態(tài)妊娠影響體重及其他指標(biāo)的檢測結(jié)果，且性激素對外源化學(xué)物代謝轉(zhuǎn)化有影響，應(yīng)選用未產(chǎn)未孕的雌性動物。健康狀況應(yīng)選用健康動物：發(fā)育正常、體形健壯，無外觀畸形，被毛濃密、有光澤、順貼而不蓬亂，行動靈活、反應(yīng)敏捷，眼睛明亮有神，表皮無潰瘍和結(jié)癡，天然孔道干凈無分泌物等。 為確保選擇健康動物，一般在實驗前觀察5～7天。對于大鼠和狗的亞慢性和慢性試驗，可在實驗前采血進(jìn)行血液學(xué)和血液生化學(xué)檢查，異常的動物應(yīng)剔除；對狗應(yīng)常規(guī)驅(qū)除腸道寄生蟲。生理狀態(tài)妊娠影響體重及其他指標(biāo)的檢測結(jié)果，且性激素124五、實驗動物喂養(yǎng)環(huán)境實驗動物喂養(yǎng)室室溫應(yīng)控制在（22±3）℃，家兔可控制在（20±3）℃，相對濕度30%~70%，無對流風(fēng)。人工晝夜周期，即使動物處于人工調(diào)控的12小時白晝(早6點至晚6點)及12小時黑夜(晚6點至次日早6點)，以穩(wěn)定其生物時間節(jié)律。五、實驗動物喂養(yǎng)環(huán)境實驗動物喂養(yǎng)室室溫應(yīng)控制在（22±3）℃125第四節(jié)食品毒理學(xué)試驗設(shè)計要點一、體內(nèi)毒理學(xué)試驗設(shè)計

1.劑量分組一般至少要設(shè)3個劑量組(即高劑量組、中劑量組、低劑量組)。高劑量組應(yīng)出現(xiàn)明確的有害作用，低劑量組應(yīng)不出現(xiàn)任何可觀察到的有害作用(即相當(dāng)于NOAEL)，但低劑量組劑量應(yīng)當(dāng)高于人可能的接觸劑量，至少等于人可能的接觸劑量。中劑量組的劑量介于高劑量組和低劑量組之間，應(yīng)出現(xiàn)輕微的毒性效應(yīng)(即相當(dāng)于LOAEL)。第四節(jié)食品毒理學(xué)試驗設(shè)計要點一、體內(nèi)毒理學(xué)試驗設(shè)計1261）急性毒性實驗

查閱文獻(xiàn)，找出與受試化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化合物的毒性資料，并以其LD50(LC50)值作為受試化合物的預(yù)其毒性中值；但應(yīng)注意，一定是相同動物種系和相同接觸途徑。以此預(yù)期毒性中值為待測化合物的中間劑量組，再上下各推一到兩個劑量組做預(yù)試驗。每個劑量組間的組距可以大些，有利于找出受試化合物的致死劑量范圍。初起組距可用劑量間的4倍差，即以log4(log4＝0.6)來劃分各組劑量。一般設(shè)置57個劑量組即可，它即符合統(tǒng)計計算要求又可節(jié)省人力和財力。每個劑量組的動物數(shù)，小鼠不少于10只、大鼠68只、家兔46只，若設(shè)計采用霍恩氏法計算LD50時，動物數(shù)可減少。每組動物應(yīng)雌雄各半；如化合物毒性有性別差異，則應(yīng)分別求雌、雄性動物各自的LD50(LC50)。1）急性毒性實驗1272）亞慢性毒性實驗亞慢性試驗的上限劑量，需控制在實驗動物接觸受試化合物的整個過程中，不發(fā)生死亡或僅有個別動物死亡，但有明顯的中毒效應(yīng)，或靶器官出現(xiàn)典型的損傷。此劑量的確定可參考兩個數(shù)值，一是以急性毒性的閾劑量為亞慢性試驗的最高劑量；一是以此化合物L(fēng)D50的1/201/5為最高劑量?；衔飦喡远拘栽囼瀾?yīng)求出其劑量－反應(yīng)關(guān)系，為此，亞慢性試驗至少應(yīng)設(shè)計三個染毒劑量組及一個正常動物對照組，必要時再加一個受試化合物的溶劑對照組。最低劑量組的劑量應(yīng)相當(dāng)于亞慢性的閾劑量水平或未觀察到作用水平，中間劑量組動物以出現(xiàn)輕微中毒效應(yīng)為度。2）亞慢性毒性實驗1283）慢性毒性實驗

為制定外來化合物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)而進(jìn)行慢性毒性試驗時，一般設(shè)3個染毒劑量組和1個對照組，必要時另設(shè)一個溶劑對照組，即無作用劑量組、閾劑量組、發(fā)生比較輕微毒性效應(yīng)的劑量組(此為最高劑量組)。以求出明確的劑量－反應(yīng)關(guān)系。染毒組劑量的選擇可參考三組數(shù)據(jù)。一是以亞慢性閾劑量為出發(fā)點，即以亞慢性閾劑量或其1/51/2劑量為慢性毒性試驗的最高劑量，以這一閾劑量的1/501/10為慢性毒性試驗的預(yù)計閾劑量組，并以其1/100為預(yù)計的慢性無作用劑量組；一是以急性毒性的LD50劑量為出發(fā)點，即以LD50的1/10劑量為慢性試驗的最高劑量。以LD50的1/100為預(yù)計慢性閾劑量，以LD50的1/1000為預(yù)計的無作用劑量組。各染毒劑量組之間的劑量間距應(yīng)當(dāng)大些，有利于求出劑量-反應(yīng)關(guān)系，也有助于排除實驗動物個體敏感性差異。組間劑量差一般以510倍為宜，最低不小于兩倍。3）慢性毒性實驗129毒理學(xué)試驗常用的對照有4種：

未處理對照組不施加任何處理因素。陰性(溶劑／賦形劑)對照不給處理因素但給以必須的實驗因素(溶劑／賦形劑)，以排除此實驗因素(溶劑／賦形劑)的影響，陽性對照用已知的陽性物(如致突變物)檢測試驗體系的有效性。陽性對照組最好與受試物用相同的溶劑、染毒途徑及采樣時間。歷史性對照由本實驗室過去多次實驗的對照組數(shù)據(jù)組成，上述三種對照都可構(gòu)成相應(yīng)的歷史對照。

毒理學(xué)試驗常用的對照有4種：130各組動物數(shù)應(yīng)考慮到統(tǒng)計學(xué)的要求。試驗期限某些試驗(如致畸試驗和多代生殖試驗)的試驗期限是由受試實驗動物物種或品系而決定的。而其他毒性試驗的期限在某種程度上由定義所決定。各組動物數(shù)應(yīng)考慮到統(tǒng)計學(xué)的要求。131急性毒性是一次或1天內(nèi)多次染毒觀察14天。一般要求計算兩周內(nèi)的總死亡數(shù)。對于一些速死性化合物求其LD50(LC50)也可僅計算24小時的死亡率，有些速殺性化合物的24小時LD50與兩周LD50值往往沒有差別。但應(yīng)注明是多少時間的LD50值，以便于在進(jìn)行毒性比較時有共同的基礎(chǔ)。急性毒性是一次或1天內(nèi)多次染毒觀察14天。一般要求計算132亞慢性毒性試驗規(guī)定為染毒持續(xù)至實驗動物壽命的10％，對大鼠和小鼠為90天，對狗應(yīng)為1年。一般認(rèn)為在環(huán)境毒理學(xué)與食品毒理學(xué)中所要求的連續(xù)接觸為3～6個月，而在工業(yè)毒理學(xué)中認(rèn)為1～3月即可。慢性毒性試驗／致癌試驗一般規(guī)定為持續(xù)至實驗動物壽命的大部分。又可分為兩類，即規(guī)定試驗期限的試驗，或直到最敏感的組死亡率達(dá)到某一水平(通常為80％)的試驗。一般認(rèn)為工業(yè)毒理學(xué)慢性試驗動物染毒6個月或更長時間；而環(huán)境毒理學(xué)與食品毒理學(xué)則要求實驗動物染毒1年以上或2年。也有學(xué)者主張動物終生接觸外來化合物才能全面反映外來化合物的慢性毒性效應(yīng)，以及求出閾劑量或無作用劑量。亞慢性毒性試驗規(guī)定為染毒持續(xù)至實驗動物壽命的10％，對133二、體外毒理學(xué)試驗設(shè)計測定受試物溶解性試驗最高劑量的推薦大多數(shù)情況下，可溶性受試物的試驗上限應(yīng)該是：(1)對哺乳動物細(xì)胞為10mmol/L或5mg/ml。(2)對細(xì)菌試驗為5mg/平板。

代謝活化常規(guī)使用Aroclor1254（多氯聯(lián)苯1254）預(yù)處理的雄性成年大鼠肝勻漿90000g離心上清液(S9)，及相應(yīng)的輔因子(NADPH再生系統(tǒng))。

陽性對照陽性對照的劑量應(yīng)選擇其劑量-反應(yīng)的直線部分。重復(fù)可疑結(jié)果則應(yīng)重復(fù)實驗，最好改變劑量范圍／劑量間隔、改變S9濃度或改變實驗方法進(jìn)行重復(fù)。

二、體外毒理學(xué)試驗設(shè)計測定受試物溶解性134第五節(jié)實驗動物的染毒和處置

一、動物實驗前的準(zhǔn)備購進(jìn)之后，應(yīng)雌雄分開飼養(yǎng)進(jìn)行5～7天的檢疫實驗動物的標(biāo)記嚙齒動物染色法苦味酸(黃色)、品紅(紅色)的酒精飽和溶液在動物被毛上染色嚙齒動物剪耳法

狗等大動物掛牌法

分組按性別、體重順序編號，隨機(jī)分組

第五節(jié)實驗動物的染毒和處置一、動物實驗前的準(zhǔn)備135二、受試物和樣品的準(zhǔn)備了解受試物的純度、雜質(zhì)成分、化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)檢索相似化合物的毒性資料，以作參考受試物應(yīng)一次備齊全部實驗的用量所需受試物總量＝(A×B×C×D)×1.2式中：A為每組動物數(shù)；B為各處理組的劑量之和(如0.1+0.3+1.0mg/kg＝1.4mg/kg)；C為染毒次數(shù)(通常為天)；D為動物的平均體重；1.2為安全因子，防止損耗。二、受試物和樣品的準(zhǔn)備136將受試物制備成一定的劑型常制備成水溶液、油溶液或混懸液。溶劑或助溶劑應(yīng)該是無毒的，與受試物不起反應(yīng)，受試物在溶液中應(yīng)穩(wěn)定。水溶性受試物水、等滲鹽水水不溶性受試物溶于或懸浮于適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中各種染毒途徑的最大容積，以受試的實驗動物物種或制劑來確定。一般規(guī)定，染毒最大容積為：①經(jīng)口20ml/kg(對空腹動物)；②經(jīng)皮2ml/kg(根據(jù)體表面積計算，限于染毒的準(zhǔn)確性)；③靜脈1ml/kg(5分鐘以上)；④肌肉注射0.5ml/kg(一個部位)；⑤每眼0.01ml；⑥直腸0.5ml/kg；⑦陰道：大鼠0.2m1，兔1ml；⑧吸入2mg/L；⑨鼻：猴或狗每鼻孔0.1ml。

將受試物制備成一定的劑型常制備成水溶液、油溶液137三、染毒途徑最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。經(jīng)口(胃腸道)染毒

常用有灌胃、喂飼和吞咽膠囊等方式。

灌胃：將受試物配制成溶液或混懸液，以注射器經(jīng)導(dǎo)管注入胃內(nèi)。吞咽膠囊：將一定劑量的受試物裝入膠囊中，放至狗的舌后部，迫使動物咽下。喂飼：將受試物摻入動物飼料或飲水中供實驗動物自行攝入。

三、染毒途徑138

經(jīng)呼吸道染毒

經(jīng)呼吸道染毒可分為吸入染毒和氣管內(nèi)注入。

靜式吸入染毒：將一定數(shù)量的嚙齒類動物放在密閉的染毒柜中，加入易揮發(fā)的液態(tài)受試物或氣態(tài)受試物使成一定濃度。動式吸入染毒：由染毒柜、機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)和配氣系統(tǒng)三部分構(gòu)成。又分為整體接觸和口鼻接觸兩種。氣管內(nèi)注入：實驗動物在麻醉后，將受試物注入氣管，使之分布至兩肺。

經(jīng)呼吸道染毒

經(jīng)呼吸道染毒可分為吸入染毒和氣139經(jīng)皮膚染毒

經(jīng)皮染毒毒性試驗皮膚刺激和致敏試驗

試驗前用機(jī)械法(剃毛)或化學(xué)法(硫化鈉或硫化鋇)脫毛。不應(yīng)損傷脫毛區(qū)的表皮，脫毛區(qū)面積不大于動物體表面積的10％～15％。經(jīng)皮膚染毒140注射染毒

注射用藥品，應(yīng)以注射途徑染毒，對大小鼠可用靜脈注射，對非嚙齒類可模擬臨床用藥途徑。應(yīng)調(diào)整受試物的pH及滲透壓，pH應(yīng)5～8，最好是等滲溶液。靜脈注射應(yīng)控制速度。注射染毒141四、癥狀觀察急性毒性試驗應(yīng)詳細(xì)地觀察動物的中毒癥狀、發(fā)生和發(fā)展過程及規(guī)律，死亡前癥狀特點、死亡時間等等。

化合物經(jīng)口急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)四、癥狀觀察化合物經(jīng)口急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)142工業(yè)毒物急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)毒物急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)143亞慢性試驗觀察指標(biāo)1、一般性指標(biāo)1）.一般綜合性觀察指標(biāo)①動物體重②食物利用率③癥狀④臟器系數(shù)2）.一般化驗指標(biāo)主要指血象和肝、腎功能的檢測，在亞慢性試驗中研究外來化合物對實驗動物的毒性作用。2、病理學(xué)檢查慢性試驗其中包括體重、食物攝取、臨床癥狀、行為、血象和血液化學(xué)、尿的性狀及生化成分以及重點觀察在亞慢性毒性試驗中已經(jīng)顯現(xiàn)的陽性指標(biāo)。亞慢性試驗觀察指標(biāo)144五、實驗動物處死及生物標(biāo)本采集實驗動物處死方法

大小鼠可用頸椎脫臼法，然后股動脈放血。兔、豚鼠、狗等一般用股動脈放血處死。血液采集不影響動物生理功能的最大取血量為其