用鹽酸胍裂解細(xì)胞課件

朱德裕核酸的制備及基因組文庫的構(gòu)建朱德裕核酸的制備及基因組文庫的構(gòu)建一、核酸制備的基本原理二、核酸制備的基本方法三、質(zhì)粒DNA的制備四、基因組DNA的制備五、RNA的制備六、基因組、cDNA文庫的構(gòu)建主要內(nèi)容一、核酸制備的基本原理主要內(nèi)容一、核酸制備的基本原理DNA主要存于細(xì)胞核中，其它如線粒體和質(zhì)體等，也含有少量DNA。RNA主要存于細(xì)胞質(zhì)中，其它如線粒體和核仁等也含有RNA。在生物體中，DNA和RNA都一般以核蛋白的形式存在。核酸不溶于一般有機(jī)溶劑。一、核酸制備的基本原理DNA主要存于細(xì)胞核中，其它如線粒體和原核細(xì)胞與真核細(xì)胞原核細(xì)胞與真核細(xì)胞菌毛原核細(xì)胞簡示圖原核細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)有細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核糖體，以及由一條裸露的

DNA雙鏈所構(gòu)成的擬核。擬核沒有與細(xì)胞質(zhì)部分相隔開的界膜（核膜），這是與真核細(xì)胞的主要區(qū)別。真核細(xì)胞中只有植物細(xì)胞有細(xì)胞壁。原核細(xì)胞中的DNA沒有組蛋白(histone)與之結(jié)合。無有絲分裂(mitosis)和減數(shù)分裂(meiosis),DNA復(fù)制后，細(xì)胞隨即分裂為二。擬核核糖體菌毛原核細(xì)胞簡示圖原核細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)有細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、真核細(xì)胞簡示圖真核細(xì)胞含有細(xì)胞核。DNA與組蛋白等蛋白質(zhì)共同組成染色體結(jié)構(gòu)，在核內(nèi)可看到核仁。真核生物進(jìn)行有性繁殖，并進(jìn)行有絲分裂。也有些真核生物的細(xì)胞也能進(jìn)行無絲分裂，如人的肝臟細(xì)胞。

真核細(xì)胞簡示圖真核細(xì)胞含有細(xì)胞核。DNA與組蛋白等蛋白質(zhì)共同核酸制備的基本原理1、細(xì)胞破碎2、將核蛋白解聯(lián)，即利用解聯(lián)劑將核蛋白裂解為核酸和蛋白。3、精致純化核酸注意事項(xiàng)：操作過程應(yīng)避免核酸的降解，包括化學(xué)因素（如過酸過堿），物理因素（如強(qiáng)烈振蕩、高溫、輻射等），生物酶等核酸制備的基本原理1、細(xì)胞破碎二、核酸制備的基本方法（一）細(xì)胞破碎1、物理方法機(jī)械碾碎：對于動物組織（如鼠肝），一般多采用勻漿的方法。組織搗碎器：是一種劇烈的破碎的方法，必須保持低溫，時間不宜太長。超聲波：借助超聲波的振動力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器的有效方法。壓榨法：是一種溫和、徹底破碎細(xì)胞的方法。即用高壓迫使幾十毫升細(xì)胞懸液通過一個小于細(xì)胞直徑的小孔，使細(xì)胞被擠壓破碎。二、核酸制備的基本方法（一）細(xì)胞破碎2、溶脹和自溶溶脹：在低滲溶液（如低濃度的稀鹽溶液中），由于存在滲透壓差，溶劑分子將大量進(jìn)入細(xì)胞，致使細(xì)胞膜膨脹破裂。自溶：細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身所具有的各種水解酶作用下，發(fā)生溶解。應(yīng)用此法要特別小心，防止目的核酸被分解。3、化學(xué)處理用脂溶性的溶劑（如丙酮、氯仿、甲苯等）或表明活性劑（SDS）處理細(xì)胞時，可使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)部分溶解，導(dǎo)致細(xì)胞破碎。4、生物酶降解如溶菌酶等生物酶有降解細(xì)胞壁的功能。在用此法處理細(xì)菌細(xì)胞時，先是細(xì)胞壁消融，然后是滲透壓引起的細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞破碎。2、溶脹和自溶各種組織細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法

應(yīng)用1勻漿法機(jī)體軟組織2搗碎法動物韌性組織3研磨法細(xì)菌、酵母4超聲法細(xì)胞混懸液5反復(fù)凍融法培養(yǎng)細(xì)胞6冷熱交替法細(xì)菌、病毒7高壓破碎細(xì)菌、細(xì)胞8有機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母9去垢劑組織、培養(yǎng)細(xì)胞10酶解法細(xì)菌、酵母各種組織細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法應(yīng)用1勻漿法機(jī)體軟組織2搗簡單介紹幾種常用的細(xì)胞破碎儀器簡單介紹幾種常用的細(xì)胞破碎儀器（二）核酸提取1、陰離子去污劑（SDS）法:

SDS（sodiumdodecylsulfate）即十二烷基硫酸鈉，是一種有效的細(xì)胞消溶劑、核酸酶抑制和蛋白變性劑。利用SDS的非極性基團(tuán)破壞蛋白分子的次級鍵，使蛋白變性，使核蛋白解聯(lián)。應(yīng)注意的是：變性后蛋白仍在溶液中，可在室溫條件下加入1/2體積飽和硫酸銨使蛋白沉淀。（二）核酸提取1、陰離子去污劑（SDS）法:2、酚抽提法:

酚作為蛋白變性劑，同時抑制了DNase的降解作用。現(xiàn)有許多派生的方法。（1）酚水法一般向溶液中加入等體積用水或緩沖溶液飽和的重蒸酚（除去氧化物醌），在室溫下或低溫下?lián)u動混合。變性蛋白分子表面由于含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶，從而變性蛋白分子（以及細(xì)胞殘?jiān)┤苡诜酉?，而核酸和多糖溶于水相。其中間為不溶性變性蛋白質(zhì)。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，直至中間層無明顯變性蛋白為止。然后合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀核酸。此法的特點(diǎn)是使提取的DNA保持天然狀態(tài)。酚抽提法示意圖受pH影響很大，若pH為中性偏酸，利于RNA的抽提；若pH略偏堿，利于DNA的抽提。例如，DNA在水飽和酚的酸性條件下容易留在有機(jī)相。因此，DNA和RNA的酚抽提法的pH值是不同的。2、酚抽提法:酚抽提法示意圖受pH影響很大，若pH為中性偏酸（2）酚/氯仿法：由于酚水法中的缺點(diǎn)是：能溶解10-15%的水，從而溶解一部分核酸。因此，加入氯仿。氯仿的作用是：克服酚的缺點(diǎn)，加速有機(jī)相與水相分層。另外，最后用氯仿抽提還可去除核酸溶液中的跡量酚（酚易溶于氯仿中）。該法中也常加入異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。（3）熱酚法此法系向抽提液中加入熱酚，于65度水浴振蕩抽提，離心去酚后，再反復(fù)抽提3-4次（加熱時間不要超過10min）。目前該法已成為由動物和細(xì)菌細(xì)胞制備RNA的標(biāo)準(zhǔn)方法。（4）SDS-酚法酚與SDS結(jié)合，是適用范圍最廣的方法之一。（2）酚/氯仿法：由于酚水法中的缺點(diǎn)是：能溶解10-15%的PhaseLockGel?-酚/氯仿抽提核酸的最佳伴侶對于核酸純化，常使用酚/氯仿抽提。然而，實(shí)驗(yàn)中常需要面對不同相層的不穩(wěn)定。為避免將蛋白雜質(zhì)或有機(jī)相連同上清水相一起吸出，我們往往會棄去一部分上清，這樣會造成相當(dāng)一部分樣品損失，特別是小體積的酚抽。反之，如果不小心混入了有機(jī)相，又會對下游實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生抑制作用。國內(nèi)天根（Tiangen）公司有個產(chǎn)品：PhaseLockGel?(PLG)。只需將酚氯仿和樣品的混合物加入預(yù)裝有PLG的管子里，離心，PLG化合物就會在水相和有機(jī)相之間形成一層致密的固體，將中間層的蛋白雜質(zhì)和下層有機(jī)相完全鎖在固體之下，這樣，全部水相樣品可輕松吸出，完全不用擔(dān)心混入雜質(zhì)，也不用擔(dān)心酚氯仿會不小心流出來。PhaseLockGel?-酚/氯仿抽提核酸的最佳伴3、濃鹽法:高濃度的鹽可以破壞核酸和蛋白質(zhì)之間的次級鍵，使核蛋白解聯(lián)。一般先用1MNaCl或1MNaClO4進(jìn)行抽提，再加入氯仿/異戊醇（起消泡作用），變性蛋白停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中，然后用2倍體積95%乙醇可將DNA鈉鹽沉淀出來。該法對核酸的損傷較小，但去除蛋白不夠徹底，常與其它方法結(jié)合使用。如經(jīng)高氯酸鈉處理后，采用CsCl密度梯度離心，便可將蛋白全部去除。3、濃鹽法:高濃度的鹽可以破壞核酸和蛋白質(zhì)之間的次級鍵，使核4、高通量的RNA分離技術(shù):（1）微量移液法借助毛細(xì)管或微量移液管直接提取細(xì)胞的內(nèi)含物，進(jìn)行RNA的抽提。（2）激光微解剖法將被冷凍或被石蠟包埋的組織切成薄片，然后所需部位被激光解剖下來，再利用黏膜吸附，轉(zhuǎn)移到RNA提取液。（3）原生質(zhì)體分離法此法首先將熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，用酶處理破壁后，通過紫外照射使那些表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞產(chǎn)生熒光，再通過熒光感受分離儀將其分離出來，進(jìn)而制得RNA。4、高通量的RNA分離技術(shù):（1）微量移液法借助毛細(xì)管或（三）核酸的濃縮和沉淀1、核酸的濃縮DNA含量低且容積大時，需濃縮。（1）真空干燥法此法比較溫和，適用于小量樣品的濃縮（2）丁醇抽提濃縮法丁醇能吸收大量水，而DNA不溶于丁醇。（3）聚乙二醇（PEG）吸收沉淀法。將DNA溶液裝入透析袋，包埋在PEG中，PEG吸水液化，DNA溶液體積減小。（三）核酸的濃縮和沉淀1、核酸的濃縮2、核酸的沉淀核酸是多聚陰陽離子的水溶性化合物，它與鈉、鉀、鎂形成的鹽在多種有機(jī)溶劑中不溶解，也不會變性。（1）常用于沉淀核酸的鹽類：NaAC，NaCl，KAC，MgCl2等。（2）沉淀核酸的有機(jī)溶劑：乙醇，異丙醇，PEG等。（3）離心2、核酸的沉淀（四）核酸的純化核酸純化的方法很多，如酚/氯仿抽提法、超速離心、柱層析、免疫沉淀、凝膠電泳等。柱層析法以硅基質(zhì)作為填充層析柱的樹脂，DNA在高鹽的條件下，DNA的磷酸二酯骨架脫水，通過暴露的磷酸鹽殘基與硅基質(zhì)結(jié)合，而蛋白等雜質(zhì)不能結(jié)合到柱上，可用75%的乙醇洗去雜質(zhì)；而在低鹽條件下，DNA又可從柱子上釋放處理，所以可通過再加入TE或水，離心洗脫。（四）核酸的純化核酸純化的方法很多，如酚/氯仿抽提法、超速討論核酸的分離與鑒定討論核酸的分離與鑒定質(zhì)粒DNA制備

質(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于基因組（大環(huán)狀DNA）并能自我復(fù)制的小環(huán)狀DNA分子

其大小范圍從lkb至200kb以上不等。

這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于細(xì)菌基因組DNA之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒DNA制備質(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于

質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)．質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

分子量相對較小共價(jià)閉合分子雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有更強(qiáng)的抗切割和抗變性能力質(zhì)粒上的元件包括啟動子，多克隆位點(diǎn)，終止密碼，融合Tag，篩選標(biāo)記/報(bào)告基因等

質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分子量相對較小具有更強(qiáng)的抗切割和抗變性能力質(zhì)

細(xì)菌收集純化質(zhì)粒DNA細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌裂解質(zhì)粒DNA的提取和純化

細(xì)菌收集純化質(zhì)粒DNA細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌裂解質(zhì)粒DNA的提取和純化質(zhì)粒DNA的提取和純化

一、細(xì)菌的培養(yǎng)(bacterialculture)l

先分離單個菌落，接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)菌的生長，質(zhì)粒DNA也在自主復(fù)制。質(zhì)粒DNA的提取和純化

一、細(xì)菌的培養(yǎng)(bacteria二、細(xì)菌的收集(bacterialcollection)

細(xì)胞生長過程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒DNA的純度，離心棄上清，細(xì)菌沉淀最好用STE或生理鹽水懸浮，漂洗l-2次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細(xì)去除干凈。二、細(xì)菌的收集(bacterialcollection)

三、細(xì)菌裂解細(xì)胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿裂解法，有機(jī)溶劑法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)、宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇。

三、細(xì)菌裂解細(xì)胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿裂大質(zhì)粒（>15kb）的處理方法：

采用溫和處理方法，使用蔗糖、溶菌酶、EDTA，后再使用SDS裂解，使plasmid損傷減少小質(zhì)粒（<15kb）的處理方法：

無需特殊處理，堿裂解方法等均可使用大質(zhì)粒（>15kb）的處理方法：1.在NaOH存在的強(qiáng)堿性（pH12.0～12.6）條件下，用堿和SDS破壞細(xì)胞壁和裂解細(xì)胞，并使細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA。2.在pHl2.0-12.6堿性環(huán)境中，大分子量細(xì)菌基因組DNA完全變性，而共價(jià)閉環(huán)(CC)質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈不會完全分離。3.將pH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，大部分基因組DNA（無法復(fù)性）和蛋白質(zhì)形成沉淀，而CC質(zhì)粒DNA復(fù)性，仍然為可溶狀態(tài)。4.經(jīng)離心分離，質(zhì)粒DNA保留在上清液中。5.再用酚/氯仿抽提或柱層析法進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。堿裂解法原理1.在NaOH存在的強(qiáng)堿性（pH12.0～12.6）條件下，1~4ml培養(yǎng)細(xì)菌收集細(xì)菌菌體重懸細(xì)菌破裂溶解、染色體基因組和蛋白質(zhì)變性、質(zhì)粒變性變性的細(xì)菌基因組形成網(wǎng)狀、蛋白質(zhì)變性、質(zhì)粒復(fù)性SolutionISolutionIISolutionIII進(jìn)一步分離、純化質(zhì)粒DNA堿裂解法提取質(zhì)粒的試劑及主要成分50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0,100ug/mlRNAse0.2MNaOH/1%SDS（要柔和）4M鹽酸胍，0.75MKAc，用HAc調(diào)pH為4~4.5。堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。1~4ml培養(yǎng)細(xì)菌收集細(xì)菌菌體重懸細(xì)菌破裂溶解、染色體基因組質(zhì)粒DNA的進(jìn)一步純化

1.

CsCl-EB法

2.聚乙二醇沉淀法

3.

柱層析法4.酚/氯仿法質(zhì)粒DNA的進(jìn)一步純化1.CsCl-EB法CsCl-EB密度梯度離心法EB插入相鄰的堿基之間，降低了DNA的浮力密度。在過量EB存在下，蛋白質(zhì)的密度最小位于最上層；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中間。CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。純度可達(dá)100%。CsCl-EB密度梯度離心法EB插入相鄰的堿基之間，降低了簡單介紹利用試劑盒提取質(zhì)粒DNA簡單介紹利用試劑盒提取質(zhì)粒DNA建立基因組文庫；克隆特定的基因；用Southern印跡檢測某一基因的存在和拷貝數(shù)；用PCR反應(yīng)檢測基因的存在及突變等.從細(xì)胞或組織中提取的基因組DNA的目的基因組DNA

的制備建立基因組文庫；從細(xì)胞或組織中提取的基因組DNA的1、DNA樣品準(zhǔn)備

常見的標(biāo)本：血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等生物組織：

最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存－70℃或液氮基因組DNA的制備步驟1、DNA樣品準(zhǔn)備基因組DNA的制備步驟2、DNA提取（1）酚抽提法：

首先用EDTA、SDS（對于細(xì)菌也可用溶菌酶）、蛋白酶K溶液破碎細(xì)胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris飽和酚或酚-氯仿抽提DNA，然后0.1倍體積的3MNaAC和2.5倍體積的100%乙醇沉淀DNA,并用70%乙醇除去DNA沉淀中的鹽離子。最后將基因組DNA溶解在TE緩沖液中，使其終濃度為~1mg/ml，置4C保存。一些RNA，尤其是mRNA會在苯酚處理過程中去除，但大多數(shù)RNA和DNA一起保留在水相，因此最有效去除RNA污染的方法就是加RNAse。2、DNA提取一些RNA，尤其是mRNA會在苯酚處理過程中去（2）

甲酰胺解聚法：破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA。高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物，可以使蛋白質(zhì)變性。減少了酚多次抽提的步驟甲酰胺解聚法適用于從標(biāo)本中制備高分子量的DNA樣品?？傻肈NA200kb左右。（2）甲酰胺解聚法：（3）玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細(xì)胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DAN沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。（4）

表面活性劑快速制備法：用TritonX-100或NP40表面活性劑破碎細(xì)胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。（3）玻璃棒纏繞法：方法包括透析、層析、電泳及選擇性沉淀。電泳法簡單、快速，是DNA樣品純化最重要的方法。瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺電泳。3、DNA的純化方法包括透析、層析、電泳及選擇性沉淀。3、DNA的純化4、DNA的濃縮1、

固體聚乙二醇（PEG）濃縮：2、

丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會。因此重復(fù)幾次可顯著減少DNA體積。5、DNA的檢測溴乙錠染色：在254nm紫外光下檢測，如需回收最好在300nm紫外光下割膠，否則易使嘌呤斷鏈，在1cm寬帶上可檢到10ngDNA。銀染法：Ag+與DNA形成復(fù)合物，在甲醛還原下可染成黑褐色，靈敏度高200倍，但不能回收。4、DNA的濃縮1、

固體聚乙二醇（PEG）濃縮：5、DN6、DNA的回收由于基因組DNA片段大，在離心過柱時可能被“扯斷”，因此常規(guī)的離心過柱的方法并不適合大片段DNA的回收。經(jīng)典方法是電洗脫。其原理是是將含DNA片斷的凝膠放在一個用半透膜隔離的空間中，通過電泳的電流使得DNA離開凝膠進(jìn)入液相，回收液相后純化沉淀其中的DNA分子。低熔點(diǎn)瓊脂糖（需加熱到65°溶解）和瓊脂糖酶消化也是常用方法，均使DNA溶回溶液，然后使用酚抽提法回收DNA。另外還有玻璃珠洗脫法或者其它純化填料。玻璃珠洗脫法是將瓊脂糖凝膠溶于高濃度的碘化鈉溶液，然后加入玻璃珠結(jié)合DNA，經(jīng)分離、洗滌后，在低鹽緩沖液中將DNA洗脫下。6、DNA的回收由于基因組DNA片段大，在離心過柱時可能被“(1)防止內(nèi)源性DNase

裂解緩沖液中的EDTA使DNA免遭DNase的降解。(2)保證得到高分子量的基因組DNA

在制備基因組DNA過程中應(yīng)減少物理機(jī)械作用，防止基因組DNA的損傷。(3)保證基因組DNA不被蛋白質(zhì)所污染，否則將影響限制性內(nèi)切酶對DNA的酶切作用。高純度DNA的OD260/OD280

值大于1.7。制備基因組DNA時應(yīng)注意(1)防止內(nèi)源性DNase制備基因組DNA時應(yīng)注意哺乳動物基因組DNA1,6.DNA/HindIII;2,3.大鼠基因組DNA；4,5.小鼠基因組DNA基因組DNA的檢測細(xì)菌基因組DNA1.1KbPlusDNALadder;2,3.M.sm基因組DNA123123456哺乳動物基因組DNA基因組DNA的檢測細(xì)菌基因組DN討論細(xì)菌基因組DNA的提取討論細(xì)菌基因組DNA的提取磁珠法DNA提取

其原理是磁珠表面帶有特定活性基團(tuán)，在特定的條件下能夠與目的物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合，同時利用磁珠自身的磁性，在外磁場的作用下可以方便的實(shí)現(xiàn)定向移動與富集，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物質(zhì)的分離純化。適用于不同的標(biāo)本類型及標(biāo)本量。如全血、血漿、咽拭子、組織、痰、腦脊液等生物標(biāo)本。磁珠法DNA提取其原理是磁珠表面帶有特定活性基團(tuán)，在特定的RNA的提取每個細(xì)胞的RNA量約為5~10μg。RNA可分為：80%-85%rRNA（核糖體RNA）、10%-15%tRNA、1%-5%mRNA、前體RNA；

其它RNA：hnRNA（不均一核RNA）、snRNA、snoRNA…等RNA的提取每個細(xì)胞的RNA量約為5~10μg。RNA的提取在操作程序上雖然與DNA的提取大致相同，但由于RNA極易被RNA酶降解。RNase除胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中。RNase分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定，去除變性劑后，RNase的活性又可恢復(fù)。Rnase不需要二價(jià)陽離子激活。因此在具體操作上有許多需要特別注意的地方，而去除RNase的污染及強(qiáng)有力地抑制其活性是RNA制備成功與否的關(guān)鍵。RNA的提取在操作程序上雖然與DNA的提取大致相同，但由于R必須在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活胞內(nèi)RNase的活性。內(nèi)源性RNA酶外源性RNA酶主要來源：被污染的緩沖液細(xì)菌或微生物污染，高壓不能去除RNA酶，必須丟棄自動移液裝置必須在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活胞內(nèi)RNase制備RNA時，最重要的是使RNase滅活：所有容器都要經(jīng)過高溫處理，不能高溫高壓的用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）處理。設(shè)置專門RNA移液、電泳裝置。所用化學(xué)試劑為RNasefree的。加入強(qiáng)變性劑（如胍鹽）使RNase失活；在RNA的反應(yīng)體系內(nèi)加入RNase的抑制劑（如RNasin)制備RNA時，最重要的是使RNase滅活：變性劑(denaturant)選擇性地使用RNase的變性劑（如酚、氯仿及強(qiáng)烈的胍類變性劑，最強(qiáng)的是異硫氰酸胍和鹽酸胍，使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成隨機(jī)卷曲狀態(tài)。）使用蛋白酶使用陰離子去污劑如SDS、十二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉RNA酶變性劑和抑制劑變性劑(denaturant)RNA酶變性劑和抑制劑RNA酶抑制劑(RNaseinhibitor)DEPC（焦碳酸二乙酯）高度活化的烷基化試劑，破壞RNA酶活性。用來滅活緩沖液或器皿中的RNA酶。DEPC非選擇性的修飾蛋白質(zhì)和RNA，且與一些緩沖液不相容，故在分離和純化RNA的過程中不使用DEPC。RNA酶的蛋白抑制劑，該類蛋白質(zhì)可與RNA酶結(jié)合形成非共價(jià)復(fù)合物從而抑制RNA酶活。商品化的RNA酶蛋白抑制劑的名稱各異（如RNAsin等）。聯(lián)合使用RNase的特異抑制劑（如DEPC與RNasin等）能極大地防止內(nèi)源性RNase對RNA的降解。注意：DEPC是潛在的致癌劑，須小心操作。RNA酶抑制劑(RNaseinhibitor)DEPC（焦還原劑加入β-疏基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑可以還原RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活。還原劑加入β-疏基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑可以還原異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法首先以含異硫氰酸胍、β-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的變性溶液裂解細(xì)胞。然后在pH4.0的條件下，酚/氯仿抽提細(xì)胞裂解溶液。最后通過異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌而獲得總RNA。在酸性條件下，加入氯仿后，DNA未能進(jìn)入水相，而RNA在水相，離心吸取上清RNA，就去除了DNA。當(dāng)然也可用RNAsefree的DNase處理。本法具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效及提取的RNA質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)。異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法首先以含異硫氰酸胍、β-疏基乙醇和商品化的單相裂解試劑法分RNA本法是異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的改進(jìn)方案。以異硫氰酸胍-酚的單相裂解液裂解細(xì)胞，再加入氯仿后形成兩相。變性的DNA與蛋白質(zhì)介于兩相的交界面，可使用乙醇和異丙醇分級沉淀出來。保留于上層水相的RNA，通過異丙醇沉淀與75%乙醇洗滌而制備。商品化的單相裂解試劑法分RNA本法是異硫氰酸胍-酚-氯仿一步TRIzol試劑(Invitrogen公司)的主要成分為異硫氰酸胍、-巰基乙醇、十二烷基肌氨酸鈉和苯酚。用TRIzol試劑處理細(xì)胞或勻漿組織氯仿萃取蛋白質(zhì)沉淀RNA洗滌RNA沉淀用RNase-freeddH2O溶解RNA，并置-20C保存檢測RNA(加５lRNA到１%瓊脂糖凝膠中)用TRIzol試劑制備總RNATRIzol試劑(Invitrogen公司)的主要成為防止單鏈RNA形成空間結(jié)構(gòu)，需用變性的瓊脂糖凝膠即甲醛-瓊脂糖凝膠分離RNA分子。為防止外源性RNase的污染，所用的倒膠槽、梳子、電泳槽等需要用DEPC或

H2O2處理；所用緩沖液用

0.1%DEPC的來配制。RNA瓊脂糖凝膠電泳為防止單鏈RNA形成空間結(jié)構(gòu)，需用變性的瓊脂糖凝RNAMarkers(0.28-6.58kb);2.小鼠腦組織中的總RNA;3.大鼠腦組織中的總RNA123RNAMarkers(0.5-9.0kb);2.大腸桿菌總RNA18SrRNA28SrRNA16SrRNA23SrRNA1.5kb3.0kb6.58kb4.98kb121.90kb1.38kb3.64kb2.60kb0.96kb0.62kb0.28kbRNAMarkers(0.28-6.58kb);1直接裂解過柱法

加入足量緩沖液RLT或RLC。劇烈渦旋裂解細(xì)胞，記住加入BME。將溶液轉(zhuǎn)移到置于收集管中的QIAshredder旋轉(zhuǎn)柱中，最大速度離心2min，丟棄柱子，收集下液。加0.5體積的乙醇（96-100%）至澄清的溶液中，上下吹吸混勻，然后轉(zhuǎn)移到RNeasy旋轉(zhuǎn)柱中。離心丟掉流動的液體部分。加緩沖液RW1到RNeasy旋轉(zhuǎn)柱中，離心對旋轉(zhuǎn)柱膜進(jìn)行清洗。丟掉流動的液體部分。加緩沖液RPE到RNeasy旋轉(zhuǎn)柱中，離心對旋轉(zhuǎn)柱膜進(jìn)行清洗。丟掉流動的液體部分。將RNeasy旋轉(zhuǎn)柱置于新的1.5ml收集管中。在旋轉(zhuǎn)柱中直接加30-50μl無RNase的水。離心收集下液，即為提取的RNA。

目前較先進(jìn)的方法，采用裂解液（不含苯酚，氯仿）直接裂解，RNA/DNA同時過柱子，然后在柱子上面直接分離RNA/DNA。商業(yè)化有QiagenRNeasyPlantMiniKit

。直接裂解過柱法加入足量緩沖液RLT或RLC。劇烈渦旋裂解細(xì)mRNA的分離純化除血紅蛋白及組蛋白的mRNA外，絕大多數(shù)mRNA在其3′末端帶有長短不同的poly（A）尾巴。利用堿基配對原則，通過oligo（dT）-纖維素或poly（U）-瓊脂糖凝膠的親和層析，可以很容易地從總RNA制品中分離純化mRNA。mRNA的分離純化除血紅蛋白及組蛋白的mRNA外，絕大多數(shù)mDNA的短期貯存：4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA，pH8）緩沖液中。DNA的長期貯存：在70％乙醇，或在DNA溶液中加一滴氯仿，-70℃保存。RNA的貯存：溶于0.3mol/L的醋酸鈉溶液或雙蒸水，也可溶于70%的乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中，在-70℃保存。核酸的貯存DNA的短期貯存：4℃或-20℃存放于TE（tris和EDT基因組文庫的構(gòu)建定義：某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體儲存于某一受體菌的群體中，這個群體就稱為該生物基因組的文庫(genomiclibrary)目的：a）分離有用的目的基因

b）保存某種生物的全部基因基因組文庫的構(gòu)建定義：某種生物基因組的全部遺傳信息通基因組文庫或cDNA文庫用于基因克隆的DNA材料的來源從特定組織提取的染色體基因組DNA---基因組文庫mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA拷貝----cDNA文庫用于基因克隆的DNA材料的選擇如果研究的目標(biāo)是弄清一種蛋白質(zhì)的氨基酸順序，可以根據(jù)克隆的cDNA分子的核苷酸序列的結(jié)構(gòu)直接推導(dǎo)出來；如果要研究的是控制基因表達(dá)活動的調(diào)控序列，或是在mRNA中不存在的某種特定序列，有關(guān)這類的信息就只能從染色體基因組DNA中獲得。

基因組文庫或cDNA文庫用于基因克隆的DNA材料的來源相對于cDNA文庫，基因組文庫的優(yōu)點(diǎn)：cDNA克隆只能反映著mRNA的分子結(jié)構(gòu)，沒有包括基因組的間隔序列，

cDNA文庫中，不同克隆的分布狀態(tài)總是反映著mRNA的分布狀態(tài)，即：高豐度mRNA的cDNA克隆，所占比例較高，分離基因容易；低豐度mRNA的cDNA克隆，所占比例較低，分離基因困難；從cDNA克隆中，不能克隆到基因組DNA中的非轉(zhuǎn)錄區(qū)段的序列，不能用于研究基因編碼區(qū)外側(cè)的調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能。相對于cDNA文庫，基因組文庫的優(yōu)點(diǎn)：基因組、cDNA文庫的構(gòu)建流程組織可克隆之DNA載體DNAcDNAmRNA部分酶解DNADNA長度分級雙鏈cDNADNA與載體連接

引入宿主細(xì)胞鑒定文庫的完備性擴(kuò)增后供長期儲存篩選出所需要的克隆基因組、cDNA文庫的構(gòu)建流程組織可克隆之DNA載體DNAc基因組DNA文庫的構(gòu)建簡圖限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝基因組DNA文庫的構(gòu)建簡圖限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)基因組文庫構(gòu)建步驟一、基因組DNA的提取染色體DNA、

質(zhì)粒DNA二、基因組DNA的不完全酶切1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶當(dāng)識別序列為4個和6個堿基時，它們分別平均在每256個和4096個堿基中會出現(xiàn)一個識別位點(diǎn)（44=256，46=4096）2.分離目的酶切片段大小的確定

a)克隆單個基因：<10kbb)克隆基因族：<20kb3、克隆片段的大小與構(gòu)建文庫克隆子的關(guān)系基因組文庫構(gòu)建步驟一、基因組DNA的提取

1975年，L.Clarke和J.Carbon提出了一種計(jì)算一個完全基因文庫需要實(shí)際克隆數(shù)的公式。

文庫實(shí)際克隆子數(shù)N＝ｌｎ（１－ｐ）ｌｎ（１－ｆ）ｆ＝DNA片段平均長度基因組ＤＮＡ的總長要求：構(gòu)建的基因組文庫含目的DNA片段（基因）的幾率（ｐ）>99%

對于人-珠蛋白基因（1.5kb）的例子，N值應(yīng)是：ｌｎ（１－0.99）

N=ｌｎ[1-（1.5100/3106）]=9.21061975年，L.Clarke和J.Car基因組大?。盖衅未笮。膸炜寺∽訑?shù)的關(guān)系基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：除盡可能高的完備性外，理想的基因文庫還應(yīng)具備：克隆總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力；載體的裝載量必須大于基因的長度；含有相鄰DNA片段的重組克隆之間，需存在足夠長度的重疊區(qū)，以利于克隆排序；克隆片段易于從載體分子上完整卸下；重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選。基因組大?。盖衅未笮。膸炜寺∽訑?shù)的關(guān)系基因文庫的質(zhì)量三、酶切片段與克隆載體連接１、酶切片段的分離與純化１）低熔點(diǎn)瓊脂糖回收目的片段２）試劑盒回收目的片段２、酶切片段與克隆載體連接

重要的是克隆載體的選擇

除質(zhì)粒(<10kb)、噬菌體載體(<20kb)、粘粒(Cosmid)（<40kb）外，還有酵母人工染色體（YeastArtificialChromosome，YAC)（100-2000kb），細(xì)菌人工染色體（BAC)、噬菌體P1克隆系統(tǒng)以及哺乳動物人工染色體（MAC)等載體。三、酶切片段與克隆載體連接１、酶切片段的分離與純化２、酶切片’’四、重組ＤＮＡ轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞１、根據(jù)克隆載體的性質(zhì)選擇合適的受體細(xì)胞

２、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞1）轉(zhuǎn)化法(transformation)：氯化鈣處理的大腸桿菌很容易攝取外源性DNA，轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子直接導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞的過程。2）轉(zhuǎn)導(dǎo)法(transduction)：在分子克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)導(dǎo)特指以噬菌體DNA為載體，將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞的過程。3）轉(zhuǎn)染法(transfection)：轉(zhuǎn)染特指“將外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞的一系列技術(shù)的通稱”。哺乳動物細(xì)胞很難捕獲外源DNA，近年來通過摸索已建立了幾種高效的將外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞的方法，如脂質(zhì)體包裹DNA轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、DEAE－葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、電擊法等。四、重組ＤＮＡ轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞１、根據(jù)克隆載體的性質(zhì)選擇合適的受五、基因組文庫克隆子的保存與篩選１、基因文庫的保存

1)影印濾膜保存法該法需要兩個濾膜，首先將無菌主濾膜平鋪于培養(yǎng)基平板上，用一滅菌涂布棒將接種液均勻涂在主濾膜上，37°C培養(yǎng)過夜。然后將帶有編號的影印濾膜放于帶有細(xì)菌菌落的主濾膜上（菌落面朝上），將兩張濾膜緊密的壓在一起，并用針頭沿每對硝酸纖維素膜邊緣不對稱地打孔使兩張濾膜相對定位。剝離兩張濾膜，溫育影印濾膜，然后密封貯存。五、基因組文庫克隆子的保存與篩選１、基因文庫的保存2）文庫在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增保存方法：從瓊脂糖平板上刮取已長出的克隆子（不是單個）轉(zhuǎn)入含適當(dāng)?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中，混合的細(xì)菌生長數(shù)代后，其培養(yǎng)物于-70oC儲存（加終濃度為25%的甘油）。缺點(diǎn)：因文庫菌落生長的不均勻性而導(dǎo)致文庫中某些特定的序列過多或過少。3)保存單個克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑選單個克隆子接種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長到一定濃度后，加入終濃度為25%的甘油，于-70oC或-25oC下保存。缺點(diǎn)：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大2）文庫在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增保存方法：從瓊脂糖平板上刮取已長出2、基因文庫的篩選表型篩選法：表達(dá)性狀易于鑒別，如互補(bǔ)篩選抗性篩選法：如二氫葉酸還原酶可以使三甲芐二氨嘧啶降解，而該化學(xué)物可抑制大腸桿菌生長分子雜交法：利用分子探針對文庫進(jìn)行篩選免疫篩選法：利用多肽等作為抗原進(jìn)行原位雜交篩選PCR篩選法：根據(jù)保守序列合成引物，擴(kuò)增特異性片段當(dāng)我們要對某一基因結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究時，首先要獲得此基因，最簡便的方法就是直接從基因文庫中獲取，即基因文庫的篩選。

2、基因文庫的篩選表型篩選法：表達(dá)性狀易于鑒別，如互補(bǔ)篩選當(dāng)用鹽酸胍裂解細(xì)胞課件討論基因組文庫的構(gòu)建討論基因組文庫的構(gòu)建cDNA文庫的構(gòu)建定義：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA

經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA片段分別與克隆載體重組，儲存于某種受體菌中，該群體就稱該生物基因組的cDNA文庫（cDNALibrary）.原理：將帶poly（A）的mRNA經(jīng)酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA，再與原核載體連接.cDNA文庫的構(gòu)建定義：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNAcDNA文庫的構(gòu)建流程①細(xì)胞總RNA的提取和mRNA分離；

②第一鏈cDNA合成；

③第二鏈cDNA合成；

④雙鏈cDNA克隆到載體并導(dǎo)入宿主細(xì)胞中繁殖。cDNA文庫的構(gòu)建流程①細(xì)胞總RNA的提取和mRNA一、mRNA的制備和分離需考慮：mRNA的完整性（合成目的蛋白的能力、大部分mRNA位于1.5-2.0kb之間以及指導(dǎo)合成cDNA的能力）mRNA的豐度（高豐度mRNA占細(xì)胞質(zhì)總RNA量的50-90%,；低豐度mRNA占細(xì)胞質(zhì)總mRNA量的0.5%以下）mRNA的富集（典型的哺乳動物細(xì)胞含有10000-30000種不同的mRNA分子,某些mRNA分子在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)很低甚至只有一個拷貝）mRNA的豐度與文庫克隆子數(shù)的關(guān)系：

N=ln(1-P)ln(1-n)N:所需克隆數(shù);P:要求的概率;n:一種mRNA在總mRNA中的相對比例一、mRNA的制備和分離mRNA的豐度與文庫克隆子數(shù)的關(guān)系1)按大小對mRNA進(jìn)行分級分離*通過瓊脂糖凝膠電泳分離大小不同的mRNA分子，該方法的分離效果最好，但從凝膠中回收的得率較低.*蔗糖梯度離心：加入破壞RNA二級結(jié)構(gòu)的變性劑如氫氧化甲基汞等，再進(jìn)行蔗糖梯度離心以分離不同分子量的mRNA.1)按大小對mRNA進(jìn)行分級分離*通過瓊脂糖凝膠電泳分2)cDNA的分級分離*mRNA通過反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，在插入到克隆載體前，通過瓊脂糖凝膠電泳，將不同大小的cDNA分子分離開來.*優(yōu)點(diǎn)：

a）避免了分離過程中mRNA被污染的

RNA酶降解

b）增加了獲得全長cDNA克隆的概率

c）獲得更準(zhǔn)確的分級分離效果（分子量）2)cDNA的分級分離*mRNA通過反轉(zhuǎn)錄形成cD3）多聚核糖體免疫學(xué)純化法*使用抗體來純化合成目的多肽的多聚核糖體.

將正在合成的新生多肽鏈的多聚核糖體結(jié)合到免疫親和柱（A蛋白-Sepharose柱）上，隨后用EDTA將多聚核糖體解離下來，并通過

Oligo(dT)層析分離mRNA,

利用該方法可將目的mRNA純化數(shù)千倍.目的mRNA在細(xì)胞中的含量可為數(shù)十拷貝.3）多聚核糖體免疫學(xué)純化法*使用抗體來純化合成目的多肽二、cDNA第一鏈的合成利用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈合成DNA時需要引物引導(dǎo)，目前常用的引物主要有兩種，即Oligo（dT）和隨機(jī)引物。

Oligo（dT）引物一般包含10～20個脫氧胸腺嘧啶核苷和一段帶有稀有酶切位點(diǎn)的引物共同組成，隨機(jī)引物一般是包含6～10個堿基的寡核苷酸短片段。二、cDNA第一鏈的合成利用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈合成三、cDNA第二鏈的合成1.自身引導(dǎo)合成法：單鏈cDNA的3’端能夠形成發(fā)夾狀的結(jié)構(gòu)作為引物，在大腸桿菌聚合酶IKlenow或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈.缺點(diǎn)：在以S1核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時，會導(dǎo)致對應(yīng)于mRNA5’端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排.1、自身引導(dǎo)法2、置換合成法3、引導(dǎo)合成法4、引物－銜接頭合成法

三、cDNA第二鏈的合成1.自身引導(dǎo)合成法：單鏈cDNA的32.置換合成法原理：以第一鏈合成產(chǎn)物cDNA：mRNA雜交體作為切口平移的模板，RNA酶H在雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口,產(chǎn)生一系列RNA引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二鏈.優(yōu)點(diǎn)：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，不需純化

c）避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA2.置換合成法原理：以第一鏈合成產(chǎn)物cDNA：mRNA雜交體首先是制備一端帶有Poly（dG）的片段Ⅱ

和帶有Poly（dT）的載體片段Ⅰ

，并用片段Ⅰ來代替Oligo（dT）進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，在第一鏈cDNA

合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）在第一鏈cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，同時進(jìn)行酶切創(chuàng)造出另一端的粘端，與片段Ⅱ

一起形成環(huán)化體，這種環(huán)化了的雜合雙鏈在RNA酶H、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA連接酶的作用下合成與載體聯(lián)系在一起的雙鏈cDNA

。其主要特點(diǎn)是合成全長cDNA的比例較高，但操作比較復(fù)雜，形成的cDNA克隆中都帶有一段Poly（dC）/（dA），對重組子的復(fù)制和測序都不利。3.引導(dǎo)合成法首先是制備一端帶有Poly（dG）的片段Ⅱ和帶有Po4.引物-銜接頭法通過改進(jìn)引導(dǎo)合成法而來的。第一鏈合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）在第一鏈cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，然后用一段帶接頭序列的Poly（dG）短核苷酸鏈作引物合成互補(bǔ)的cDNA鏈，接頭序列可以是適用于PCR擴(kuò)增的特異序列或用于方便克隆的酶切位點(diǎn)的序列。這一方法目前已經(jīng)發(fā)展成PCR法構(gòu)建cDNA文庫的常用方法。

4.引物-銜接頭法通過改進(jìn)引導(dǎo)合成法而來的。第一鏈合成后直接四、雙鏈cDNA分子的克隆1.同聚物加尾法利用小牛胸腺末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈cDNA和質(zhì)粒載體的3’端都加上一個互補(bǔ)的同聚片段，通過退火使兩個片段連接成重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞雙鏈cDNA在和載體連接之前，要經(jīng)過一系列處理，如同聚物加尾和加接頭等。四、雙鏈cDNA分子的克隆1.同聚物加尾法雙鏈cD2.接頭-銜接頭法平端連接的效率低，加尾和加接頭主要為了提高連接效率，其中添加帶酶切位點(diǎn)的接頭最為常用的方法。需注意所加接頭需選擇甲基化敏感的酶且加接頭之前必須對雙鏈cDNA進(jìn)行甲基化處理，加上接頭后再用該酶進(jìn)行消化，創(chuàng)造用于連接的粘端。2.接頭-銜接頭法平端連接的效率低，加尾和加接頭主要為了提高五、cDNA文庫的篩選和鑒定1.核酸雜交是最常用、最可靠的方法之一.采用探針可大規(guī)模地分析文庫的克隆子2.特異性免疫學(xué)檢測目的基因的表達(dá)產(chǎn)物能與特異性抗體發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，通過酶學(xué)的方法加以檢測3.cDNA克隆的同胞檢測將cDNA文庫分成若干組含有10-100個克隆子的易于處理的cDNA文庫，對每組cDNA文庫進(jìn)行檢測，當(dāng)鑒定出陽性庫后再不斷將其分成更細(xì)的庫進(jìn)行檢測，直到獲得陽性單克隆.4.cDNA克隆的確證cDNA克隆含有編碼某一特定蛋白質(zhì)的完整氨基酸序列的開放讀框.

五、cDNA文庫的篩選和鑒定1.核酸雜交是最討論cDNA文庫的構(gòu)建討論cDNA文庫的構(gòu)建朱德裕核酸的制備及基因組文庫的構(gòu)建朱德裕核酸的制備及基因組文庫的構(gòu)建一、核酸制備的基本原理二、核酸制備的基本方法三、質(zhì)粒DNA的制備四、基因組DNA的制備五、RNA的制備六、基因組、cDNA文庫的構(gòu)建主要內(nèi)容一、核酸制備的基本原理主要內(nèi)容一、核酸制備的基本原理DNA主要存于細(xì)胞核中，其它如線粒體和質(zhì)體等，也含有少量DNA。RNA主要存于細(xì)胞質(zhì)中，其它如線粒體和核仁等也含有RNA。在生物體中，DNA和RNA都一般以核蛋白的形式存在。核酸不溶于一般有機(jī)溶劑。一、核酸制備的基本原理DNA主要存于細(xì)胞核中，其它如線粒體和原核細(xì)胞與真核細(xì)胞原核細(xì)胞與真核細(xì)胞菌毛原核細(xì)胞簡示圖原核細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)有細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核糖體，以及由一條裸露的

DNA雙鏈所構(gòu)成的擬核。擬核沒有與細(xì)胞質(zhì)部分相隔開的界膜（核膜），這是與真核細(xì)胞的主要區(qū)別。真核細(xì)胞中只有植物細(xì)胞有細(xì)胞壁。原核細(xì)胞中的DNA沒有組蛋白(histone)與之結(jié)合。無有絲分裂(mitosis)和減數(shù)分裂(meiosis),DNA復(fù)制后，細(xì)胞隨即分裂為二。擬核核糖體菌毛原核細(xì)胞簡示圖原核細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)有細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、真核細(xì)胞簡示圖真核細(xì)胞含有細(xì)胞核。DNA與組蛋白等蛋白質(zhì)共同組成染色體結(jié)構(gòu)，在核內(nèi)可看到核仁。真核生物進(jìn)行有性繁殖，并進(jìn)行有絲分裂。也有些真核生物的細(xì)胞也能進(jìn)行無絲分裂，如人的肝臟細(xì)胞。

真核細(xì)胞簡示圖真核細(xì)胞含有細(xì)胞核。DNA與組蛋白等蛋白質(zhì)共同核酸制備的基本原理1、細(xì)胞破碎2、將核蛋白解聯(lián)，即利用解聯(lián)劑將核蛋白裂解為核酸和蛋白。3、精致純化核酸注意事項(xiàng)：操作過程應(yīng)避免核酸的降解，包括化學(xué)因素（如過酸過堿），物理因素（如強(qiáng)烈振蕩、高溫、輻射等），生物酶等核酸制備的基本原理1、細(xì)胞破碎二、核酸制備的基本方法（一）細(xì)胞破碎1、物理方法機(jī)械碾碎：對于動物組織（如鼠肝），一般多采用勻漿的方法。組織搗碎器：是一種劇烈的破碎的方法，必須保持低溫，時間不宜太長。超聲波：借助超聲波的振動力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器的有效方法。壓榨法：是一種溫和、徹底破碎細(xì)胞的方法。即用高壓迫使幾十毫升細(xì)胞懸液通過一個小于細(xì)胞直徑的小孔，使細(xì)胞被擠壓破碎。二、核酸制備的基本方法（一）細(xì)胞破碎2、溶脹和自溶溶脹：在低滲溶液（如低濃度的稀鹽溶液中），由于存在滲透壓差，溶劑分子將大量進(jìn)入細(xì)胞，致使細(xì)胞膜膨脹破裂。自溶：細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身所具有的各種水解酶作用下，發(fā)生溶解。應(yīng)用此法要特別小心，防止目的核酸被分解。3、化學(xué)處理用脂溶性的溶劑（如丙酮、氯仿、甲苯等）或表明活性劑（SDS）處理細(xì)胞時，可使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)部分溶解，導(dǎo)致細(xì)胞破碎。4、生物酶降解如溶菌酶等生物酶有降解細(xì)胞壁的功能。在用此法處理細(xì)菌細(xì)胞時，先是細(xì)胞壁消融，然后是滲透壓引起的細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞破碎。2、溶脹和自溶各種組織細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法

應(yīng)用1勻漿法機(jī)體軟組織2搗碎法動物韌性組織3研磨法細(xì)菌、酵母4超聲法細(xì)胞混懸液5反復(fù)凍融法培養(yǎng)細(xì)胞6冷熱交替法細(xì)菌、病毒7高壓破碎細(xì)菌、細(xì)胞8有機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母9去垢劑組織、培養(yǎng)細(xì)胞10酶解法細(xì)菌、酵母各種組織細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法應(yīng)用1勻漿法機(jī)體軟組織2搗簡單介紹幾種常用的細(xì)胞破碎儀器簡單介紹幾種常用的細(xì)胞破碎儀器（二）核酸提取1、陰離子去污劑（SDS）法:

SDS（sodiumdodecylsulfate）即十二烷基硫酸鈉，是一種有效的細(xì)胞消溶劑、核酸酶抑制和蛋白變性劑。利用SDS的非極性基團(tuán)破壞蛋白分子的次級鍵，使蛋白變性，使核蛋白解聯(lián)。應(yīng)注意的是：變性后蛋白仍在溶液中，可在室溫條件下加入1/2體積飽和硫酸銨使蛋白沉淀。（二）核酸提取1、陰離子去污劑（SDS）法:2、酚抽提法:

酚作為蛋白變性劑，同時抑制了DNase的降解作用?，F(xiàn)有許多派生的方法。（1）酚水法一般向溶液中加入等體積用水或緩沖溶液飽和的重蒸酚（除去氧化物醌），在室溫下或低溫下?lián)u動混合。變性蛋白分子表面由于含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶，從而變性蛋白分子（以及細(xì)胞殘?jiān)┤苡诜酉?，而核酸和多糖溶于水相。其中間為不溶性變性蛋白質(zhì)。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，直至中間層無明顯變性蛋白為止。然后合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀核酸。此法的特點(diǎn)是使提取的DNA保持天然狀態(tài)。酚抽提法示意圖受pH影響很大，若pH為中性偏酸，利于RNA的抽提；若pH略偏堿，利于DNA的抽提。例如，DNA在水飽和酚的酸性條件下容易留在有機(jī)相。因此，DNA和RNA的酚抽提法的pH值是不同的。2、酚抽提法:酚抽提法示意圖受pH影響很大，若pH為中性偏酸（2）酚/氯仿法：由于酚水法中的缺點(diǎn)是：能溶解10-15%的水，從而溶解一部分核酸。因此，加入氯仿。氯仿的作用是：克服酚的缺點(diǎn)，加速有機(jī)相與水相分層。另外，最后用氯仿抽提還可去除核酸溶液中的跡量酚（酚易溶于氯仿中）。該法中也常加入異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。（3）熱酚法此法系向抽提液中加入熱酚，于65度水浴振蕩抽提，離心去酚后，再反復(fù)抽提3-4次（加熱時間不要超過10min）。目前該法已成為由動物和細(xì)菌細(xì)胞制備RNA的標(biāo)準(zhǔn)方法。（4）SDS-酚法酚與SDS結(jié)合，是適用范圍最廣的方法之一。（2）酚/氯仿法：由于酚水法中的缺點(diǎn)是：能溶解10-15%的PhaseLockGel?-酚/氯仿抽提核酸的最佳伴侶對于核酸純化，常使用酚/氯仿抽提。然而，實(shí)驗(yàn)中常需要面對不同相層的不穩(wěn)定。為避免將蛋白雜質(zhì)或有機(jī)相連同上清水相一起吸出，我們往往會棄去一部分上清，這樣會造成相當(dāng)一部分樣品損失，特別是小體積的酚抽。反之，如果不小心混入了有機(jī)相，又會對下游實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生抑制作用。國內(nèi)天根（Tiangen）公司有個產(chǎn)品：PhaseLockGel?(PLG)。只需將酚氯仿和樣品的混合物加入預(yù)裝有PLG的管子里，離心，PLG化合物就會在水相和有機(jī)相之間形成一層致密的固體，將中間層的蛋白雜質(zhì)和下層有機(jī)相完全鎖在固體之下，這樣，全部水相樣品可輕松吸出，完全不用擔(dān)心混入雜質(zhì)，也不用擔(dān)心酚氯仿會不小心流出來。PhaseLockGel?-酚/氯仿抽提核酸的最佳伴3、濃鹽法:高濃度的鹽可以破壞核酸和蛋白質(zhì)之間的次級鍵，使核蛋白解聯(lián)。一般先用1MNaCl或1MNaClO4進(jìn)行抽提，再加入氯仿/異戊醇（起消泡作用），變性蛋白停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中，然后用2倍體積95%乙醇可將DNA鈉鹽沉淀出來。該法對核酸的損傷較小，但去除蛋白不夠徹底，常與其它方法結(jié)合使用。如經(jīng)高氯酸鈉處理后，采用CsCl密度梯度離心，便可將蛋白全部去除。3、濃鹽法:高濃度的鹽可以破壞核酸和蛋白質(zhì)之間的次級鍵，使核4、高通量的RNA分離技術(shù):（1）微量移液法借助毛細(xì)管或微量移液管直接提取細(xì)胞的內(nèi)含物，進(jìn)行RNA的抽提。（2）激光微解剖法將被冷凍或被石蠟包埋的組織切成薄片，然后所需部位被激光解剖下來，再利用黏膜吸附，轉(zhuǎn)移到RNA提取液。（3）原生質(zhì)體分離法此法首先將熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，用酶處理破壁后，通過紫外照射使那些表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞產(chǎn)生熒光，再通過熒光感受分離儀將其分離出來，進(jìn)而制得RNA。4、高通量的RNA分離技術(shù):（1）微量移液法借助毛細(xì)管或（三）核酸的濃縮和沉淀1、核酸的濃縮DNA含量低且容積大時，需濃縮。（1）真空干燥法此法比較溫和，適用于小量樣品的濃縮（2）丁醇抽提濃縮法丁醇能吸收大量水，而DNA不溶于丁醇。（3）聚乙二醇（PEG）吸收沉淀法。將DNA溶液裝入透析袋，包埋在PEG中，PEG吸水液化，DNA溶液體積減小。（三）核酸的濃縮和沉淀1、核酸的濃縮2、核酸的沉淀核酸是多聚陰陽離子的水溶性化合物，它與鈉、鉀、鎂形成的鹽在多種有機(jī)溶劑中不溶解，也不會變性。（1）常用于沉淀核酸的鹽類：NaAC，NaCl，KAC，MgCl2等。（2）沉淀核酸的有機(jī)溶劑：乙醇，異丙醇，PEG等。（3）離心2、核酸的沉淀（四）核酸的純化核酸純化的方法很多，如酚/氯仿抽提法、超速離心、柱層析、免疫沉淀、凝膠電泳等。柱層析法以硅基質(zhì)作為填充層析柱的樹脂，DNA在高鹽的條件下，DNA的磷酸二酯骨架脫水，通過暴露的磷酸鹽殘基與硅基質(zhì)結(jié)合，而蛋白等雜質(zhì)不能結(jié)合到柱上，可用75%的乙醇洗去雜質(zhì)；而在低鹽條件下，DNA又可從柱子上釋放處理，所以可通過再加入TE或水，離心洗脫。（四）核酸的純化核酸純化的方法很多，如酚/氯仿抽提法、超速討論核酸的分離與鑒定討論核酸的分離與鑒定質(zhì)粒DNA制備

質(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于基因組（大環(huán)狀DNA）并能自我復(fù)制的小環(huán)狀DNA分子

其大小范圍從lkb至200kb以上不等。

這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于細(xì)菌基因組DNA之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒DNA制備質(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于

質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)．質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

分子量相對較小共價(jià)閉合分子雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有更強(qiáng)的抗切割和抗變性能力質(zhì)粒上的元件包括啟動子，多克隆位點(diǎn)，終止密碼，融合Tag，篩選標(biāo)記/報(bào)告基因等

質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分子量相對較小具有更強(qiáng)的抗切割和抗變性能力質(zhì)

細(xì)菌收集純化質(zhì)粒DNA細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌裂解質(zhì)粒DNA的提取和純化

細(xì)菌收集純化質(zhì)粒DNA細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌裂解質(zhì)粒DNA的提取和純化質(zhì)粒DNA的提取和純化

一、細(xì)菌的培養(yǎng)(bacterialculture)l

先分離單個菌落，接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)菌的生長，質(zhì)粒DNA也在自主復(fù)制。質(zhì)粒DNA的提取和純化

一、細(xì)菌的培養(yǎng)(bacteria二、細(xì)菌的收集(bacterialcollection)

細(xì)胞生長過程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒DNA的純度，離心棄上清，細(xì)菌沉淀最好用STE或生理鹽水懸浮，漂洗l-2次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細(xì)去除干凈。二、細(xì)菌的收集(bacterialcollection)

三、細(xì)菌裂解細(xì)胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿裂解法，有機(jī)溶劑法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)、宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇。

三、細(xì)菌裂解細(xì)胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿裂大質(zhì)粒（>15kb）的處理方法：

采用溫和處理方法，使用蔗糖、溶菌酶、EDTA，后再使用SDS裂解，使plasmid損傷減少小質(zhì)粒（<15kb）的處理方法：

無需特殊處理，堿裂解方法等均可使用大質(zhì)粒（>15kb）的處理方法：1.在NaOH存在的強(qiáng)堿性（pH12.0～12.6）條件下，用堿和SDS破壞細(xì)胞壁和裂解細(xì)胞，并使細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA。2.在pHl2.0-12.6堿性環(huán)境中，大分子量細(xì)菌基因組DNA完全變性，而共價(jià)閉環(huán)(CC)質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈不會完全分離。3.將pH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，大部分基因組DNA（無法復(fù)性）和蛋白質(zhì)形成沉淀，而CC質(zhì)粒DNA復(fù)性，仍然為可溶狀態(tài)。4.經(jīng)離心分離，質(zhì)粒DNA保留在上清液中。5.再用酚/氯仿抽提或柱層析法進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。堿裂解法原理1.在NaOH存在的強(qiáng)堿性（pH12.0～12.6）條件下，1~4ml培養(yǎng)細(xì)菌收集細(xì)菌菌體重懸細(xì)菌破裂溶解、染色體基因組和蛋白質(zhì)變性、質(zhì)粒變性變性的細(xì)菌基因組形成網(wǎng)狀、蛋白質(zhì)變性、質(zhì)粒復(fù)性SolutionISolutionIISolutionIII進(jìn)一步分離、純化質(zhì)粒DNA堿裂解法提取質(zhì)粒的試劑及主要成分50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0,100ug/mlRNAse0.2MNaOH/1%SDS（要柔和）4M鹽酸胍，0.75MKAc，用HAc調(diào)pH為4~4.5。堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。1~4ml培養(yǎng)細(xì)菌收集細(xì)菌菌體重懸細(xì)菌破裂溶解、染色體基因組質(zhì)粒DNA的進(jìn)一步純化

1.

CsCl-EB法

2.聚乙二醇沉淀法

3.

柱層析法4.酚/氯仿法質(zhì)粒DNA的進(jìn)一步純化1.CsCl-EB法CsCl-EB密度梯度離心法EB插入相鄰的堿基之間，降低了DNA的浮力密度。在過量EB存在下，蛋白質(zhì)的密度最小位于最上層；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中間。CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。純度可達(dá)100%。CsCl-EB密度梯度離心法EB插入相鄰的堿基之間，降低了簡單介紹利用試劑盒提取質(zhì)粒DNA簡單介紹利用試劑盒提取質(zhì)粒DNA建立基因組文庫；克隆特定的基因；用Southern印跡檢測某一基因的存在和拷貝數(shù)；用PCR反應(yīng)檢測基因的存在及突變等.從細(xì)胞或組織中提取的基因組DNA的目的基因組DNA

的制備建立基因組文庫；從細(xì)胞或組織中提取的基因組DNA的1、DNA樣品準(zhǔn)備

常見的標(biāo)本：血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等生物組織：

最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存－70℃或液氮基因組DNA的制備步驟1、DNA樣品準(zhǔn)備基因組DNA的制備步驟2、DNA提?。?）酚抽提法：

首先用EDTA、SDS（對于細(xì)菌也可用溶菌酶）、蛋白酶K溶液破碎細(xì)胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris飽和酚或酚-氯仿抽提DNA，然后0.1倍體積的3MNaAC和2.5倍體積的100%乙醇沉淀DNA,并用70%乙醇除去DNA沉淀中的鹽離子。最后將基因組DNA溶解在TE緩沖液中，使其終濃度為~1mg/ml，置4C保存。一些RNA，尤其是mRNA會在苯酚處理過程中去除，但大多數(shù)RNA和DNA一起保留在水相，因此最有效去除RNA污染的方法就是加RNAse。2、DNA提取一些RNA，尤其是mRNA會在苯酚處理過程中去（2）

甲酰胺解聚法：破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA。高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物，可以使蛋白質(zhì)變性。減少了酚多次抽提的步驟甲酰胺解聚法適用于從標(biāo)本中制備高分子量的DNA樣品?？傻肈NA200kb左右。（2）甲酰胺解聚法：（3）玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細(xì)胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DAN沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。（4）

表面活性劑快速制備法：用TritonX-100或NP40表面活性劑破碎細(xì)胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。（3）玻璃棒纏繞法：方法包括透析、層析、電泳及選擇性沉淀。電泳法簡單、快速，是DNA樣品純化最重要的方法。瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺電泳。3、DNA的純化方法包括透析、層析、電泳及選擇性沉淀。3、DNA的純化4、DNA的濃縮1、

固體聚乙二醇（PEG）濃縮：2、

丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會。因此重復(fù)幾次可顯著減少DNA體積。5、DNA的檢測溴乙錠染色：在254nm紫外光下檢測，如需回收最好在300nm紫外光下割膠，否則易使嘌呤斷鏈，在1cm寬帶上可檢到10ngDNA。銀染法：Ag+與DNA形成復(fù)合物，在甲醛還原下可染成黑褐色，靈敏度高200倍，但不能回收。4、DNA的濃縮1、

固體聚乙二醇（PEG）濃縮：5、DN6、DNA的回收由于基因組DNA片段大，在離心過柱時可能被“扯斷”，因此常規(guī)的離心過柱的方法并不適合大片段DNA的回收。經(jīng)典方法是電洗脫。其原理是是將含DNA片斷的凝膠放在一個用半透膜隔離的空間中，通過電泳的電流使得DNA離開凝膠進(jìn)入液相，回收液相后純化沉淀其中的DNA分子。低熔點(diǎn)瓊脂糖（需加熱到65°溶解）和瓊脂糖酶消化也是常用方法，均使DNA溶回溶液，然后使用酚抽提法回收DNA。另外還有玻璃珠洗脫法或者其它純化填料。玻璃珠洗脫法是將瓊脂糖凝膠溶于高濃度的碘化鈉溶液，然后加入玻璃珠結(jié)合DNA，經(jīng)分離、洗滌后，在低鹽緩沖液中將DNA洗脫下。6、DNA的回收由于基因組DNA片段大，在離心過柱時可能被“(1)防止內(nèi)源性DNase

裂解緩沖液中的EDTA使DNA免遭DNase的降解。(2)保證得到高分子量的基因組DNA

在制備基因組DNA過程中應(yīng)減少物理機(jī)械作用，防止基因組DNA的損傷。(3)保證基因組DNA不被蛋白質(zhì)所污染，否則將影響限制性內(nèi)切酶對DNA的酶切作用。高純度DNA的OD260/OD280

值大于1.7。制備基因組DNA時應(yīng)注意(1)防止內(nèi)源性DNase制