氨基酸工藝學(xué)第二章谷氨酸發(fā)酵機(jī)制

第二章谷氨酸發(fā)酵機(jī)制

第一節(jié)谷氨酸發(fā)酵機(jī)制1.谷氨酸的作用：谷氨酸(g1utamate，Glu，C5H9O4N)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，主要分布于大腦皮質(zhì)、海馬、小腦和紋狀體，在學(xué)習(xí)、記憶、神經(jīng)元可塑性及大腦發(fā)育等方面均起重要作用。此外，谷氨酸對心肌能量代謝和心肌保護(hù)起著重要作用。

一、谷氨酸生物合成途徑生物體內(nèi)合成谷氨酸的前體物質(zhì)是a-酮戊二酸，是三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))的中間產(chǎn)物，由糖質(zhì)原料生物合成谷氨酸的途徑包括糖酵解途徑(EMP途徑)、三羧酸循環(huán)、乙醛酸循環(huán)、CO2的固定反應(yīng)(伍德一沃克曼反應(yīng))等。（一）、葡萄糖的糖酵解、三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)

1.糖酵解途徑（EMP途徑）將一分子葡萄糖分解成兩分子丙酮酸,并且發(fā)生氧化(脫氫)和生成少量ATP。

葡萄糖6-磷酸葡萄糖3-磷酸甘油醛丙酮酸6-磷酸葡萄糖酸5-磷酸核酮糖HMP途徑EMP途徑2.戊糖磷酸途徑（HMP途徑）可以生成酵解途徑的中間產(chǎn)物6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛。肌肉中的葡萄糖代謝情況3.三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）谷氨酸（胞內(nèi)）轉(zhuǎn)移到胞外草酰乙酸檸檬酸順烏頭酸異檸檬酸α-酮戊二酸琥珀酸延胡索酸蘋果酸丙酮酸乙酰CoA乙醛酸+CO2乙醛酸循環(huán)中的兩個關(guān)鍵酶——異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶。

異檸檬酸脫氫酶

NH4α-酮戊二酸脫氫酶

（二）谷氨酸合成的理想途徑在發(fā)酵產(chǎn)酸期，EMP所占比例更大，約為74％。

生物素充足菌EMP所占比例約為62％；（三）由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑3.在谷氨酸發(fā)酵的菌體生長期，由于三羧酸循環(huán)中的缺陷(喪失a-酮戊二酸脫氫酶氧化能力或氧化能力微弱)，谷氨酸產(chǎn)生菌采用乙醛酸循環(huán)途徑進(jìn)行代謝，提供四碳二羧酸及菌體合成所需的中間產(chǎn)物等。2.此代謝途徑至少有16步酶促反應(yīng)。1.谷氨酸生產(chǎn)菌株為缺陷型，生產(chǎn)過程分為菌體生長期和谷氨酸積累期。

4.在菌體生長期之后，進(jìn)入谷氨酸生成期，封閉乙醛酸循環(huán)，積累α-酮戊二酸，就能夠大量生成、積累谷氨酸。因此在谷氨酸發(fā)酵中，菌體生長期的最適條件和谷氨酸生成積累期的最適條件是不一樣的。

5.由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑（1））在在谷谷氨氨酸酸生生成成期期，，假如如四四碳碳二二羧羧酸酸是是100％％通通過過C02固定定反反應(yīng)應(yīng)供供給給，，在生生長長期期之之后后，，理理想想的的發(fā)發(fā)酵酵按按如如下下反反應(yīng)應(yīng)進(jìn)進(jìn)行行：：1mol葡葡萄萄糖糖可可以以生生成成1mol的的谷谷氨氨酸酸，，谷谷氨氨酸酸對對葡葡萄萄糖糖的的質(zhì)量量理理論論轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化率率為：：6.葡葡萄萄糖糖對對谷谷氨氨酸酸的的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化率率（2））在在谷谷氨氨酸酸生生成成期期，，若若CO2固定定反反應(yīng)應(yīng)完全全不不起起作作用用，丙丙酮酮酸酸在在丙丙酮酮酸酸脫脫氫氫酶酶的的催催化化作作用用下下，，脫脫氫氫脫脫羧羧全全部部氧氧化化成成乙乙酰酰CoA，，通通過過乙乙醛醛酸酸循循環(huán)環(huán)供供給給四四碳碳二二羧羧酸酸。。反反應(yīng)應(yīng)如如下下：：3C6H12O66丙丙酮酮酸酸6乙乙酰酰CoA乙醛醛酸酸循循環(huán)環(huán)：：4乙乙酰酰CoA+4H2O2琥琥珀珀酸酸+4CoASH6乙酰CoA+2NH3+3O22谷氨酸酸+2CO2+6H2O3mol葡萄糖糖可以生生成2mol的的谷氨酸酸，谷氨氨酸對葡葡萄糖的的質(zhì)量理論論轉(zhuǎn)化率率為：(3)實實際轉(zhuǎn)化化率：處于二者者之間，，即54.4%～81.7%。。CO2固定反應(yīng)應(yīng)、乙醛醛酸循環(huán)環(huán)的比率率等對轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化率影影響較大大。乙醛酸循循環(huán)活性性越高，，谷氨酸酸越不易易生成與與積累。。7.醋酸或正石蠟原料發(fā)酵酵谷氨酸酸的推測測途徑在醋酸發(fā)發(fā)酵谷氨氨酸或石石油發(fā)酵酵谷氨酸酸時，卻卻只能經(jīng)乙乙醛酸循循環(huán)供給給四碳二二羧酸，四碳二二羧酸經(jīng)經(jīng)草酰乙乙酸又轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化為檸檸檬酸。。二、谷氨氨酸生物物合成的的代謝調(diào)調(diào)節(jié)機(jī)制制在工業(yè)上上，通過過對微生物物代謝途途徑的控控制來滿足生生產(chǎn)的需需要，提提高生產(chǎn)產(chǎn)效益。。所以，研研究微生生物代謝謝調(diào)節(jié)機(jī)機(jī)制有極極其重要要的意義義。合成代謝謝將分解解代謝產(chǎn)產(chǎn)生的能能量和中中間體合合成氨基基酸、核核酸、蛋蛋白質(zhì)等等物質(zhì)。。微生物的的代謝分解代謝謝：合成代謝謝：從環(huán)境中中攝取營營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)，把它它們轉(zhuǎn)化化為自身身物質(zhì)，，以此來來提供能能源和小小分子中中間體；；1．糖代代謝(EMP途途徑和HMP途途徑)的的調(diào)節(jié)糖代謝可可分為分解與合成兩方面。。糖分解代代謝包括酵解解與三羧羧酸循環(huán)環(huán)；（提供能能量）合成代謝謝包括糖的的異生、、糖原與與結(jié)構(gòu)多多糖的合合成等，，中間代代謝還有有磷酸戊戊糖途徑徑、糖醛醛酸途徑徑等。（消耗能能量）(1)能能荷的調(diào)調(diào)節(jié)腺嘌呤核核苷三磷磷酸，又又叫三磷磷酸腺苷苷(腺苷苷三磷酸酸)，簡簡稱為ATP。其結(jié)構(gòu)簡式是：：A—P～P～P，其相鄰的兩兩個磷酸基之之間的化學(xué)鍵鍵非?；钴S，，水解時可釋釋放約30.54kJ/mol的能能量，因此稱稱為高能磷酸酸鍵。能荷調(diào)節(jié)是通通過ATP、、ADP和AMP分子對對某些酶分子子進(jìn)行變構(gòu)調(diào)調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的的。Atkinson提出了了能荷的概念念。認(rèn)為能荷是細(xì)胞中高能能磷酸狀態(tài)的的一種數(shù)量上上的衡量，能能荷大小可以以說明生物體體中ATP——ADP—AMP系統(tǒng)的的能量狀態(tài)。。能荷的大小小決定于ATP和ADP的多少。能荷逐漸升高高時，即細(xì)胞內(nèi)的能能量水平逐漸漸升高，這一一過程中AMP、ADP轉(zhuǎn)變成ATP。ATP的增加加會抑制糖分解代代謝，抑制如檸檬酸酸合成酶、異異檸檬酸脫氫氫酶等酶的活活性，并激活活糖類合成的的酶，加速糖糖原的合成。。糖酵解主要受三個酶酶調(diào)節(jié)：磷酸酸果糖激酶、、己糖激酶、、丙酮酸激酶酶，其中磷酸果糖激酶酶是限速酶，己己糖激酶控制制酵解的入口口，丙酮酸激激酶控制出口口；三羧酸循環(huán)的調(diào)控由三個個酶調(diào)控，即即檸檬酸合成成酶、異檸檬酸脫脫氫酶和ā-酮戊二二酸脫氫酶酶。兩者都與與能荷的控控制調(diào)節(jié)相相關(guān)。當(dāng)生物體內(nèi)內(nèi)生物合成成或其它需需能反應(yīng)加加強(qiáng)時，細(xì)細(xì)胞內(nèi)ATP分解生生成ADP或AMP，ATP減少，能荷降低，就會激活某些催化糖糖類分解的的酶(糖原原磷酸化酶酶、磷酸果果糖激酶、、檸檬酸合合成酶、異異檸檬酸脫脫氫酶等)或解除ATP對這這些酶的抑抑制，并抑抑制合成糖糖原的酶(NN合成成酶、果糖糖-1，6～二磷酸酸酯酶等)，從而加加速酵解、、TCA循循環(huán)產(chǎn)生能能量，通過過氧化磷酸酸化作用生生成ATP。(2)生物物素對糖代代謝速率的的調(diào)節(jié)生物素對糖糖代謝的調(diào)調(diào)節(jié)與能荷荷的調(diào)節(jié)是是不同的，，能荷是對對糖代謝流流的調(diào)節(jié)，，而生物素能夠夠促進(jìn)糖的的EMP、、HMP途途徑、TCA循環(huán)。。谷氨酸產(chǎn)生生菌大多為為生物素缺陷陷型。許多研究究表明，生生物素對從從糖開始到到丙酮酸為為止的糖降降解途徑的的比例并沒沒有顯著的的影響，主主要作用是是對糖降解速速率的調(diào)節(jié)節(jié)。原因：碳水化合物物、脂肪和和蛋白質(zhì)代代謝中的許多反應(yīng)都都需要生物物素。生物素的主主要功能是在脫羧-羧化反應(yīng)應(yīng)和脫氨反反應(yīng)中起輔酶作用，并和和碳水化合合物與蛋白白質(zhì)的互變變、碳水化化合物以及及蛋白質(zhì)向向脂肪的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化有關(guān)。。在碳水化合合物代謝中中，生物素素酶能催化化脫羧和羧羧化反應(yīng)。。碳水化合合物代謝中中依賴生物物素的特異異反應(yīng)有：：丙酮酸轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化生成草草酰乙酸；；蘋果酸轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化為丙酮酮酸；琥珀珀酸與丙酮酮酸的互變變；草酰琥琥珀酸轉(zhuǎn)化化為α-酮酮戊二酸。。2．三羧酸酸循環(huán)(TCA循環(huán)環(huán))的調(diào)節(jié)節(jié)谷氨酸產(chǎn)生生菌在代謝謝途徑中，，三羧酸循循環(huán)的調(diào)節(jié)節(jié)主要是通通過5種酶酶的調(diào)節(jié)進(jìn)進(jìn)行的。這這五種酶是是磷酸烯醇醇式丙酮酸酸羧化酶、、檸檬酸合合成酶、異異檸檬酸脫脫氫酶、谷谷氨酸脫氫氫酶和α-酮戊二酸酸脫氫酶。。谷氨酸比天天冬氨酸優(yōu)優(yōu)先合成，，谷氨酸合合成過量后后，谷氨酸酸抑制谷氨氨酸脫氫酶酶的活力并并阻遏檸檬檬酸合成酶酶的合成，，使代謝轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)向天冬氨氨酸的合成成。草酰乙酸+谷氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶天冬氨酸+α-酮戊二酸①磷酸烯醇式式丙酮酸羧羧化酶受天冬氨酸酸的反饋抑抑制，受谷谷氨酸和天天冬氨酸的的反饋?zhàn)瓒舳簟＂跈幟仕岷铣沙擅甘侨人嵫h(huán)的關(guān)鍵鍵酶，除受受能荷調(diào)節(jié)節(jié)外，還受受谷氨酸的的反饋?zhàn)瓒舳艉蜑躅^酸酸的反饋抑抑制。反饋抑制：：是指最終終產(chǎn)物抑制制作用，即即在合成過過程中有生生物合成途途徑的終點(diǎn)點(diǎn)產(chǎn)物對該該途徑的酶酶的活性調(diào)調(diào)節(jié)，所引引起的抑制作用。反饋抑制與與反饋?zhàn)瓒舻膮^(qū)別在于于：反饋?zhàn)瓒羰鞘寝D(zhuǎn)錄水平平的調(diào)節(jié)，產(chǎn)生效應(yīng)應(yīng)慢，反饋饋抑制是酶酶活性水平平調(diào)節(jié)，產(chǎn)產(chǎn)生效應(yīng)快快。此外，，前者的作作用往往會會影響催化化一系反應(yīng)應(yīng)的多個酶，而后者往往往只對是是一系列反反應(yīng)中的第第一個酶起起作用。③異檸檬酸脫脫氫酶活力強(qiáng)，而而異檸檬酸酸裂解酶活活力不能太太強(qiáng)，這就就有利于谷谷氨酸前體體物α-酮酮戊二酸的的生成，滿滿足合成谷谷氨酸的需需要。異檸檬酸脫脫氫酶催化化的異檸檬檬酸脫氫脫脫羧生成αα–酮戊二二酸的反應(yīng)應(yīng)和谷氨酸酸脫氫酶催催化的α-酮戊二酸酸還原氨基基化生成谷谷氨酸的反反應(yīng)是一對對氧化還原原共軛反應(yīng)應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)內(nèi)α–酮戊戊二酸的量量與異檸檬檬酸的量需需維持平衡衡，當(dāng)α––酮戊二酸酸過量時，，對異檸檬檬脫氫酶發(fā)發(fā)生反饋抑抑制作用，，停止合成成α–酮戊戊二酸。在谷氨酸的的生物合成成中，谷氨氨酸脫氫酶酶和異檸檬檬酸脫氫酶酶在銨離子子存在下，，兩者非常常密切地偶偶聯(lián)起來，，形成強(qiáng)固的的氧化還原原共軛體系系，不與NADPH2的末端氧化化系相連接接，使α––酮戊二酸酸還原氨基基化生成谷谷氨酸。④沿著由檸檸檬酸至αα–酮戊二二酸的氧化化途徑，谷谷氨酸產(chǎn)生生菌有兩種種NADP專性脫氫氫酶，即異檸檬酸脫脫氫酶和L-谷氨酸酸脫氫酶。由于于谷氨氨酸酸產(chǎn)產(chǎn)生生菌菌的谷氨氨酸酸脫脫氫氫酶酶比其其它它微微生生物物強(qiáng)強(qiáng)大得多多，，所所以以由由三三羧羧酸酸循循環(huán)環(huán)所所得得的的檸檸檬檬酸酸的的氧氧化化中中間間物物就就不不再再往往下下氧氧化化，，而而以以谷谷氨氨酸酸的的形形式式積積累累起起來來。。谷氨氨酸酸對對谷谷氨氨酸酸脫脫氫氫酶酶存存在在著著反反饋饋抑抑制制和和反反饋饋?zhàn)枳瓒舳?。。若若銨銨離離子子進(jìn)進(jìn)一一步步過過剩剩供供給給時時，，發(fā)發(fā)酵酵液液偏偏酸酸性性，，pH在在5.5～～6.5，，谷谷氨氨酸酸會會進(jìn)進(jìn)一一步步生生成成谷氨酰胺胺。⑤在谷氨氨酸產(chǎn)生生菌中，，α–酮戊戊二酸脫脫氫酶先天性缺失或微微弱，對導(dǎo)向向谷氨酸酸形成具具有重要要意義，，這是谷谷氨酸產(chǎn)產(chǎn)生菌糖糖代謝的的一個重要特征征。谷氨酸產(chǎn)產(chǎn)生菌的的α–酮酮戊二酸酸氧化力力微弱，，尤其在在生物素素缺乏的的條件下下，三羧羧酸循環(huán)環(huán)到達(dá)αα–酮戊戊二酸時時即受到到阻擋，，這有利利于α––酮戊二二酸的積積累，然然后生成成谷氨酸酸。3．乙醛醛酸循環(huán)環(huán)(DCA循環(huán)環(huán))的調(diào)調(diào)節(jié)乙醛酸循循環(huán)中的的關(guān)鍵酶酶是異檸檬酸酸裂解酶酶和蘋果酸酶酶。通過乙乙醛酸循循環(huán)異檸檸檬酸裂裂解酶的的催化作作用使琥琥珀酸、、延胡索索酸和蘋蘋果酸的的量得到到補(bǔ)足，，其反應(yīng)應(yīng)如下：：葡萄糖和琥珀酸等對異異檸檬檬酸裂裂解酶酶起著著阻遏遏作用用。在生物素素亞適適量條件下下，琥琥珀酸酸氧化化力降降低，，積累累的琥琥珀酸酸會反饋抑抑制異檸檬檬酸裂裂解酶酶活性性，并并阻遏遏該酶酶的生生成，，DCA循循環(huán)基基本處處于封封閉狀狀態(tài)，，異檸檸檬酸酸高效效率地地轉(zhuǎn)化化為αα-––酮戊戊二酸酸，再生成成谷氨氨酸。在生物素素充足足的條件件下，，異檸檸檬酸酸裂解解酶活活性增增大，，通過過DCA循循環(huán)提提供能能量，，進(jìn)行行蛋白白質(zhì)的的合成成，不不僅異異檸檬檬酸轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化生生成谷谷氨酸酸的反反應(yīng)減減弱使使得谷谷氨酸酸減少少，而而且生生成的的谷氨氨酸在在轉(zhuǎn)氨氨酶的的催化化作用用下又又轉(zhuǎn)成成其它它氨基基酸，，也不利于于谷氨氨酸積積累。(1)以糖糖質(zhì)為為原料料的谷谷氨酸酸發(fā)酵酵中生生物素素對DCA循環(huán)環(huán)的影影響以醋酸酸為原原料發(fā)發(fā)酵谷谷氨酸酸時，，醋酸濃濃度要要低，高濃濃度的的醋酸酸易被被完全全氧化化。當(dāng)菌體內(nèi)的的有機(jī)酸濃濃度低到一定程度度，DCA循環(huán)啟動，此時異檸檸檬酸裂解解酶催化生生成的乙醛醛酸與細(xì)胞胞內(nèi)的草酰酰乙酸共同同抑制異檸檬酸脫氫酶，TCA循循環(huán)轉(zhuǎn)為DCA循環(huán)環(huán)，不利于于谷氨酸生生成與積累累；當(dāng)DCA循循環(huán)運(yùn)轉(zhuǎn)使使得TCA循環(huán)包含含的某些有有機(jī)酸過剩剩時，異檸檸檬酸裂解酶被抑抑制，乙醛酸濃濃度下降，，解除對異異檸檬酸脫脫氫酶的抑抑制，TCA循環(huán)運(yùn)運(yùn)轉(zhuǎn)。(2)以醋醋酸為原料料的谷氨酸酸發(fā)酵對DCA循環(huán)環(huán)的影響4．CO2固定反應(yīng)的的調(diào)節(jié)CO2固定反應(yīng)主主要通過以以下途徑完完成：C02的固定反應(yīng)應(yīng)的作用：：補(bǔ)充草酰乙乙酸；在谷氨酸合合成過程中中，糖的分解代代謝途徑與與C02固定的適當(dāng)當(dāng)比例是提高谷氨氨酸對糖收收率的關(guān)鍵問題。5．NH4+的調(diào)節(jié)谷氨酸脫氫氫酶也能催化谷谷氨酸氧化化脫氨反應(yīng)，脫氨過程程以NAD+作為輔酶，，該酶催化化的反應(yīng)雖雖然偏向氨合成谷氨氨酸一邊，，但是脫氫氫過程產(chǎn)生生的NADH被氧化化成NAD+，同時產(chǎn)生生的NH3很容易被除除去。脫氨反應(yīng)被被NH4+和α-–酮酮戊二酸所所抑制，這對于谷谷氨酸的積累也起到了很很好的作用用。在谷氨酸發(fā)發(fā)酵生產(chǎn)中中，生物素缺陷陷型菌在NH4+存在時，葡葡萄糖消耗耗速率快而而且谷氨酸酸收率高；；NH4+不存在時，，葡萄糖消消耗速率很很慢，生成成物是α--–酮戊二二酸、丙酮酮酸等物質(zhì)質(zhì)，不產(chǎn)生生谷氨酸。。四、細(xì)胞膜膜通透性的的調(diào)節(jié)對谷氨酸發(fā)發(fā)酵的重要要性：當(dāng)細(xì)胞膜膜轉(zhuǎn)變?yōu)橛杏欣诠劝卑彼嵯蚰ね馔鉂B透的方方式，谷氨氨酸才能不不斷地排出細(xì)胞外外，這樣既有有利于細(xì)胞胞內(nèi)谷氨酸酸合成反應(yīng)的的優(yōu)先性、、連續(xù)性，也有利于于谷氨酸在在胞外的積累累。細(xì)胞膜是在在細(xì)胞壁與與細(xì)胞質(zhì)之之間的一層層柔軟而富富有彈性的的半滲透性膜膜，磷脂雙分子子層為其基本結(jié)結(jié)構(gòu)，在雙雙分子層中中鑲嵌蛋白質(zhì)質(zhì)。一種是通過過控制脂肪肪酸和甘油油的合成，，實現(xiàn)對磷磷脂合成的的控制，使使得細(xì)胞不能形成完完整的細(xì)胞胞膜；一種是通過過干擾細(xì)菌細(xì)細(xì)胞壁的形形成，使得細(xì)胞胞不能形成成完整的細(xì)細(xì)胞壁，喪喪失了對細(xì)細(xì)胞膜的保保護(hù)作用。。在膜內(nèi)外外滲透壓差差等因素影影響下，細(xì)胞膜物理理性損傷，，增大膜的的通透性。根據(jù)細(xì)胞膜膜的結(jié)構(gòu)特特性，控制細(xì)胞膜膜通透性的的方法主要有兩種種：1．控制細(xì)細(xì)胞膜的形形成①利用生物素缺陷陷型菌株進(jìn)行谷氨酸酸發(fā)酵時，，限制發(fā)酵培養(yǎng)基基中生物素素的濃度。。生物素參與與了脂肪酸酸的生物合合成，進(jìn)而而影響了磷磷脂的合成成和細(xì)胞膜膜的形成。。生物素是催催化脂肪酸酸合成起始始反應(yīng)的關(guān)關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶的的輔酶，對脂肪酸酸的形成起起促進(jìn)作用用。選育生生物素缺陷陷型菌株，，阻斷生物物素合成，，亞適量控控制生物素素添加，抑制不飽飽和脂肪肪酸的合合成，使得細(xì)胞膜不不完整，提高了了細(xì)胞膜膜對谷氨氨酸的通通透性。。②利用生物素過過量的糖糖蜜原料料進(jìn)行谷氨氨酸發(fā)酵酵時，添加表面活性性劑或飽飽和脂肪肪酸。在生物素素過量的的條件下下，添加加表面活活性劑或或飽和脂脂肪酸仍仍能進(jìn)行行谷氨酸酸發(fā)酵，，其原因因在于這些物質(zhì)質(zhì)對生物物素起拮拮抗作用用，抑制不不飽和脂脂肪酸的的合成，，導(dǎo)致油油酸合成成量減少少，磷脂脂合成不不足，使使得細(xì)胞膜不不完整，提高了了細(xì)胞膜膜對谷氨氨酸的通通透性。。常用的的表面活活性劑有有吐溫-60、、吐溫-40等等。常用用的飽和和脂肪酸酸有十七七烷酸、、硬脂酸酸等。③利用油酸缺陷陷型菌株株進(jìn)行谷氨氨酸發(fā)酵酵，限制發(fā)酵培養(yǎng)養(yǎng)基油酸酸的濃度度。油酸缺陷陷型菌株株喪失了了自身合合成油酸酸的能力力，直接接影響磷磷脂的合合成，不能形成成完整細(xì)細(xì)胞膜，必須添添加油酸酸才能生生長，所所以通過過控制油油酸的添添加量，，實現(xiàn)細(xì)細(xì)胞膜對對谷氨酸酸的通透透性。當(dāng)油酸過量量時，該菌菌株只長長菌或產(chǎn)產(chǎn)酸少；；當(dāng)油酸亞適適量時，隨著著油酸的的耗盡，，細(xì)胞膜膜結(jié)構(gòu)與與功能發(fā)發(fā)生變化化，使得得谷氨酸酸的通透透性提高高。一種脂肪肪酸。分子式C18H34O2甘油缺陷陷型菌株株不能自自身合成成α-––磷酸甘甘油和磷磷脂，外外界供給給甘油才才能使其其生長，，因此可可以通過過控制甘甘油添加加量來控控制細(xì)胞胞膜對谷谷氨酸的的通透性性。當(dāng)甘油添添加量過多時，磷脂脂正常合合成，菌菌體正常常生長，，不產(chǎn)酸酸或產(chǎn)酸酸低；當(dāng)甘油添添加量過少時，菌體體生長不不好，產(chǎn)產(chǎn)酸低，，所以控控制甘油油亞適量量是控制制的關(guān)鍵鍵。④利用甘油缺陷陷型菌株株進(jìn)行谷氨氨酸發(fā)酵酵，限制發(fā)酵培養(yǎng)養(yǎng)基甘油油的濃度度。2．控制制細(xì)胞壁壁的形成成細(xì)胞壁的的骨架結(jié)結(jié)構(gòu)是肽肽聚糖。。對細(xì)胞壁壁形成的的控制方方法：添添加青霉霉素、頭頭孢霉素素C等β-內(nèi)酰胺胺類抗生生素。雙糖單位位：N-乙酰胞胞壁酸（（NAM）和N-乙酰酰葡萄糖糖胺（NAG））青霉素是是糖肽末末端結(jié)構(gòu)構(gòu)(D——Ala—D——Ala)的類似物，與轉(zhuǎn)肽肽酶的活活性中心心結(jié)合，，使轉(zhuǎn)肽肽酶受到到了不可可逆的抑抑制，糖糖肽合成成不能完完成，結(jié)結(jié)果形成成不完整整的細(xì)胞胞壁，使使細(xì)胞膜膜處于無無保護(hù)狀狀態(tài)，易易于破損損，增大大谷氨酸酸的通透透性。轉(zhuǎn)肽酶功功能：在在蛋白質(zhì)質(zhì)生物合合成過程程中肽鍵鍵的形成成具有必必須的作作用。轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)肽酶識識別特異異多肽,催化不不同的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)肽反應(yīng)應(yīng)。青霉素控控制細(xì)胞胞壁形成成的原因因：第二節(jié)谷谷氨酸酸產(chǎn)生菌菌的選育育主要是棒棒桿菌屬屬、短桿桿菌屬、、小桿菌菌屬和節(jié)節(jié)桿菌屬屬中的細(xì)細(xì)菌。目前，我我國企業(yè)業(yè)使用的的谷氨酸酸產(chǎn)生菌菌主要有有：北京棒桿桿菌AS1．．299；鈍齒棒桿桿菌AS1．．542；天津短桿桿菌T6-13；它們的各各種突變變株。黃色短桿桿菌北京棒桿桿菌桿狀細(xì)菌菌谷氨酸菌菌體的選選育方法法主要有有五種，，自然選育育、誘變變選育、、雜交選選育、代代謝控制制選育和和基因工工程選育育。一、自然選育育以基因自發(fā)突變變?yōu)榛A(chǔ)。有利于谷氨酸酸產(chǎn)生菌保持持純系良種，使谷氨酸生生產(chǎn)具有相對對穩(wěn)定性，提提高發(fā)酵水平平。缺點(diǎn)：菌體自身存在在著修復(fù)機(jī)制制和某些酶的的校正作用，，使得自發(fā)突突變率極低，，導(dǎo)致選育耗耗時長、工作作量大、效率率低。也稱自然分離離，是指對微微生物細(xì)胞群群體不經(jīng)過人人工處理而直直接進(jìn)行篩選選的育種方法法。二、誘變選育育物理因素：紫外線、60Co、X射線線、γ-射線線、快中子、、α-射線、、β-射線、、超聲波、He-Ne激激光輻照、離離子束等。化學(xué)因素：氮芥、亞硝基基胍、硫酸二二乙酯、甲基基磺酸乙酯、、亞硝基甲基基脲、亞硝酸酸、5-氟尿尿嘧啶、5-溴尿嘧啶等等。其它因素：生物誘導(dǎo)因因子，如噬菌菌體誘發(fā)抗性性突變等。例：王歲樓；張一一震；李志。。谷氨酸高產(chǎn)產(chǎn)菌TZ-310的誘變變選育及其發(fā)發(fā)酵的研究。。中國調(diào)味品，1997年09期。摘要：以天津津短桿菌Ｔ６６-１３為出出發(fā)菌株，經(jīng)經(jīng)６０Ｃｏ——γ射射線、紫外線線和硫酸二二乙酯酯復(fù)合誘誘變并并經(jīng)高高溫馴馴化，，獲得得一株株琥珀珀酸和和生物物素雙雙營養(yǎng)養(yǎng)缺陷陷型突突變株株。該該菌株株具有有耐高高糖、、耐高高谷氨氨酸（（ＧＡＡ）、、不分分解利利用ＧＧＡ及及耐高高溫（（３８８℃～～４５５℃））的優(yōu)優(yōu)點(diǎn)。。原生質(zhì)質(zhì)體融融合就是將將兩個個親株株的細(xì)細(xì)胞壁壁分別別通過過酶解解作用用加以以剝除除，制制得原原生質(zhì)質(zhì)體或或原生生質(zhì)球球，在在高滲滲條件件下混混合，，由聚聚乙二二醇(PEG)助融融，促促使原原生質(zhì)質(zhì)體凝凝集、、融合合，兩兩個基基因組組之間間接觸觸、交交換、、遺傳傳重組組，在在再生生細(xì)胞胞中獲獲得重重組體體。三、雜雜交育育種雜交育育種常規(guī)雜雜交原生質(zhì)質(zhì)體融融合谷氨酸酸產(chǎn)生生菌的的前處處理因為其其有著著特殊殊的細(xì)細(xì)胞壁壁結(jié)構(gòu)構(gòu)，對對溶菌菌酶一一般不不敏感感。方法：：加入入EDTA（乙二胺胺四乙乙酸）、甘甘氨酸酸、青青霉素素和D-環(huán)環(huán)絲氨氨酸等等，這這些物物質(zhì)可可以使使細(xì)胞胞壁變變得疏疏松，，便于于溶菌菌酶處處理。。如，李李蒲興興等將將6株株谷氨氨酸產(chǎn)產(chǎn)生菌菌以甘甘氨酸酸、青青霉素素和溶溶菌酶酶的不同同組組合合處處理理，對對其其原原生生質(zhì)質(zhì)體體形形成成進(jìn)進(jìn)行行比比較較，，在在最最佳佳條條件件下下，，原原生生質(zhì)質(zhì)體體形成成率率可達(dá)達(dá)95％％～～100％％。。張蓓等等以谷谷氨酸酸產(chǎn)生生菌天天津短短桿菌菌T6-13為為出發(fā)發(fā)菌株株，獲獲得了了具有有目的的遺傳傳標(biāo)記記寡霉霉素抗抗性(Orm)和氟氟乙酸酸抗性性(FEAr)的突突變株株TN63和TN115。然然后，，分別別以TN63和和TN115為為親株株，通通過原原生質(zhì)質(zhì)體融融合，，獲得得了具具有Orm+FEAr標(biāo)記的的融合合子FTN9108，其其原生生質(zhì)體體融合合頻率率為2.6×10-3。OrmFEAr+OrmFEArOrmFEAr四、代代謝控控制選選育以誘變變育種種為基基礎(chǔ)，，獲得得各種種解除除或繞繞過微微生物物正常常代謝謝途徑徑的突突變株株，從從而人人為地地使有有用產(chǎn)產(chǎn)物選選擇性性地大大量生生成積積累。。Glu產(chǎn)生生菌誘變育育種突變株株代謝控控制發(fā)發(fā)酵大量積積累Glu1.選選育耐耐高糖糖、高高谷氨氨酸的的菌株株如選育育在含含20％～～30％葡葡萄糖糖的平平板上上生長長良好好的耐耐高糖糖突變變株；；在含15％％～～20％味味精的的平板板上生生長良良好的的耐高高谷氨氨酸突突變株株；在20％的的葡萄萄糖加加15％味味精的的平板板上生生長良良好的的耐高高糖、、耐高高谷氨氨酸的的菌株株。2.選選育能能強(qiáng)化化谷氨氨酸合合成代代謝、、削弱弱或阻阻斷支支路代代謝的的菌株株（1））選育育不分分解利利用谷谷氨酸酸的突突變株株選育在在以谷氨酸酸為唯唯一碳碳源培養(yǎng)基基上不不長或或生長長微弱弱的突突變株株。。谷氨酸酸谷氨酰酰胺鳥氨酸酸瓜氨酸酸精氨酸酸（2））選育育強(qiáng)化化CO2固定反反應(yīng)的的突變變株a.選選育以琥珀珀酸或或蘋果果酸為為唯一一碳源源，生生長良良好的菌株株。因因為細(xì)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)碳代代謝必必須走走四碳碳二羧羧酸的的脫羧羧反應(yīng)應(yīng)，該該反應(yīng)應(yīng)與C02固定反反應(yīng)是是相同同酶所所催化化，C02固定反反應(yīng)相相應(yīng)地地加強(qiáng)強(qiáng)。b.選選育氟丙酮酮酸敏敏感突變株株。因為氟氟丙酮酮酸是是丙酮酮酸脫脫氫酶酶的抑抑制劑劑，即即抑制制丙酮酮酸向向乙酰酰CoA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化，，相應(yīng)應(yīng)地CO2固定反反應(yīng)加加強(qiáng)。。突變變株對對氟丙丙酮酸酸越敏敏感，，效果果越理理想。。c.選選育減弱乙乙醛酸酸循環(huán)環(huán)的突變變株。。乙醛酸酸循環(huán)環(huán)減弱弱不僅僅能使使C02固定反反應(yīng)比比例增增大，，而且且異檸檸檬酸酸也能能高效效率地地轉(zhuǎn)化化為αα-酮酮戊二二酸，，再生生成谷谷氨酸酸。常常見的的該突突變株株有琥琥珀酸酸敏感感型突突變株株和不不分解解利用用乙酸酸的突突變株株。（3））選育育解除除谷氨氨酸對對谷氨氨酸脫脫氫酶酶反饋饋調(diào)節(jié)節(jié)的突突變株株有酮基基丙二二酸抗抗性突突變株株、谷谷氨酸酸結(jié)構(gòu)構(gòu)類似似物抗抗性突突變株株和谷谷氨酰酰胺抗抗性突突變株株。草酰乙乙酸谷氨酸酸轉(zhuǎn)氨氨酶天冬氨氨酸+α-酮戊二二酸谷氨酸酸α-酮戊二二酸NH3谷氨酸酸脫氫氫酶（4））選育育強(qiáng)化化能量量代謝謝的突突變株株原因：：使TCA循環(huán)環(huán)前一一段代代謝加加強(qiáng)，，谷氨氨酸合合成速速率加加快。。a.選育呼呼吸鏈抑制制劑抗性突突變株如可選育丙丙二酸、氧氧化丙二酸酸、氰化鉀鉀、氰化鈉鈉抗性突變變株來實現(xiàn)現(xiàn)。b.選育ADP磷酸酸化抑制劑劑抗性突變變株如可選育2,4-二二硝基酚、、羥胺、砷砷、胍等抗抗性突變株株來實現(xiàn)。。c.選育抑抑制能量代代謝的抗生生素的抗性性突變株如可選育纈纈氨霉素、、寡霉素等等抗性突變變株來實現(xiàn)現(xiàn)。（5）其它它遺傳標(biāo)記記選育莽草酸酸缺陷型、、抗嘌呤嘧嘧啶類似物物、抗核苷苷酸類抗生生素、異亮亮氨酸缺陷陷、蛋氨酸酸缺陷、苯苯丙氨酸缺缺陷、AEC抗性、、AHV抗抗性、棕櫚櫚酰谷氨酸酸等突變株株，都可以以不同程度度地提高谷谷氨酸產(chǎn)量量。3.選育能能提高谷氨氨酸通透性性的菌株（1）選育育生物素缺陷陷型菌株。（2）選育育油酸缺陷型型菌株。（3）選育育甘油缺陷型型菌株。（4）選育育溫度敏感型型突變株突變位置發(fā)發(fā)生在決定定與谷氨酸酸分泌有密密切關(guān)系的的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)構(gòu)的基因上，發(fā)生堿堿基的轉(zhuǎn)換換或顛換，，一個堿基基為另一個個堿基所置置換，這樣樣為基因所所控制的酶酶在高溫下下失活，導(dǎo)導(dǎo)致細(xì)胞膜膜某些結(jié)構(gòu)構(gòu)的改變。。另一個特點(diǎn)點(diǎn)是在生物物素豐富的的培養(yǎng)基上上也能分泌泌出谷氨酸酸。(5)其它它突變型菌菌株抗藥性、溶溶菌酶敏感感型、二氨氨基庚二酸酸缺陷型、、乙酸缺陷陷型、棕櫚櫚酰谷氨酸酸敏感型突突變株等，，都能增強(qiáng)谷氨酸酸的通透性性。五、基因工工程選育基因工程育育種是指利利用基因工工程方法對對產(chǎn)生菌株株進(jìn)行改造造而獲得高高產(chǎn)工程菌菌，或者是是通過微生生物間的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因而獲獲得新菌種種的育種方方法。載體系統(tǒng)：一般以質(zhì)質(zhì)粒、噬菌菌體或轉(zhuǎn)座座子作為載載體，尤以以質(zhì)粒為多多。受體系統(tǒng)：受體菌選選用短桿菌菌屬和棒桿桿菌屬的野野生菌或變變異株。供體菌株：供體菌株株選擇短桿桿菌屬及棒棒桿菌屬的的野生菌或或變異株。。工具酶：切割供體DNA和載載體DNA的工具酶酶——限制制性內(nèi)切核核酸酶有許許多種，HindⅢⅢ、BclI、XbaI和XamI效果果最好。載體系統(tǒng)受受體系系統(tǒng)供體菌株工工具酶酶谷氨酸產(chǎn)生生菌的許多多關(guān)鍵酶的基基因已被克隆，Ozaki等克隆隆了谷氨酸酸棒桿菌的的分枝酸變變位酶和預(yù)預(yù)苯酸脫水水酶基因，，通過質(zhì)粒粒載體導(dǎo)回回谷氨酸棒棒桿菌，產(chǎn)產(chǎn)量提高了了50％。。周盛等從大大腸桿菌E.colik-12中通通過PCR克隆出磷酸果糖激激酶編碼基基因(pfkA)，將其連到到表達(dá)載體，連接構(gòu)建建成重組質(zhì)質(zhì)粒pKu-1，轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿桿菌B4，，并得到表表達(dá)；酶活活性測定表表明pf-kA基因因表達(dá)活力力為128.6±o.86u／g的蛋蛋白。同時時，轉(zhuǎn)化子子菌株對糖轉(zhuǎn)化率率比B4高高10.64％％，產(chǎn)酸率比B4高高17.1％。。9、靜靜夜夜四四無無鄰鄰，，荒荒居居舊舊業(yè)業(yè)貧貧。。。。12月月-2212月月-22Wednesday,December28,202210、雨雨中中黃黃葉葉樹樹，，燈燈下下白白頭頭人人。。。。21:26:5821:26:5821:2612/28/20229:26:58PM11、以我我獨(dú)沈沈久，，愧君君相見見頻。。。12月月-2221:26:5821:26Dec-2228-Dec-2212、故人人江海海別，，幾度度隔山山川。。。21:26:5821:26:5821:26Wednesday,December28,202213、乍見翻翻疑夢，，相悲各各問年。。。12月-2212月-2221:26:5821:26:58December28,202214、他鄉(xiāng)生白白發(fā)，舊國國見青山。。。28十二二月20229:26:58下下午21:26:5812月-2215、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。十二二月月229:26下下午午12月月-2221:26December28,202216、行行動動出出成成果果，，工工作作出出財財富富。。。。2022/12/2821:26:5821:26:5828December202217、做前，，能夠環(huán)環(huán)視四周周；做時時，你只只能或者者最好沿沿著以腳腳為起點(diǎn)點(diǎn)的射線線向前。。。9:26:58下午午9:26下午午21:26:5812月-229、沒有有失敗敗，只只有暫暫