枸杞多糖對CCl4引起的建鯉急性肝損傷的保護(hù)作用,漁業(yè)論文

枸杞多糖對CCl4引起的建鯉急性肝損傷的保護(hù)作用,漁業(yè)論文肝臟是魚體內(nèi)最大的本質(zhì)性器官，其功能很強(qiáng)大，對來自體內(nèi)外的很多非營養(yǎng)性物質(zhì)，如各種藥物、毒物以及體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物等有生物轉(zhuǎn)化作用［1］，具有很好的解毒功能和代謝功能，因而，肝臟更容易遭到外環(huán)境、病毒、細(xì)菌等因素的影響。當(dāng)前，隨著集約化養(yǎng)殖的不斷發(fā)展，難免會(huì)出現(xiàn)對魚類日常管理的疏忽，如強(qiáng)化投飼和亂用藥物，飼喂霉變飼料等［2］，而這些因素會(huì)對魚類肝臟造成比擬嚴(yán)重的損害，出現(xiàn)以肝膽綜合癥為主要特征的魚類疾病，即所謂的魚類肝病(Theliverdiseaseoffishes)［3］。關(guān)于本病，并沒有有效地治療藥物，死亡率較高，且治療主要是以西藥為主，而西藥容易出現(xiàn)藥物殘留等問題，會(huì)間接影響魚的品質(zhì)，進(jìn)而影響到人類的健康，因而研究開發(fā)出綠色環(huán)保的中成藥就顯得迫在眉睫。近年來，由于中草藥具有綠色無污染、毒副作用小，以及能夠提高機(jī)體的免疫和防御功能等特點(diǎn)［4］，現(xiàn)已廣泛的應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物的病害防治及健康養(yǎng)殖中［5－6］。枸杞(LyciumchinenseMill-er)為茄科枸杞屬(LyciumLinn．)植物，含有多糖、粗蛋白、亞油酸等多種營養(yǎng)成分，而枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP)為枸杞中的主要活性成分之一［7］。當(dāng)代藥理研究表示清楚，枸杞多糖具有護(hù)肝、保衛(wèi)生殖系統(tǒng)、降血脂、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等多種功能［8－11］。當(dāng)前，關(guān)于枸杞多糖的研究報(bào)道主要有:王遠(yuǎn)吉［12］研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖能夠提高鯽魚血清溶菌酶活力，且與枸杞多糖呈濃度依靠性關(guān)系。宋毅等［13］研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖能夠加強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能。然而，水產(chǎn)領(lǐng)域有關(guān)枸杞多糖的保肝作用卻鮮有報(bào)道。四氯化碳(CCl4)作為一個(gè)評價(jià)天然藥物保肝作用的肝毒性模型藥物，已廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究當(dāng)中。本研究以化學(xué)藥物CCl4來進(jìn)行造模，通過測定一些肝功能生化指標(biāo)的變化來評價(jià)枸杞多糖對建鯉急性肝損傷的保衛(wèi)作用，為枸杞多糖在水產(chǎn)肝膽疾病的防治提供理論根據(jù)。1材料與方式方法1．1材料1．1．1供試魚建鯉來自于中國水產(chǎn)科學(xué)院淡水漁業(yè)研究中心漁場，體質(zhì)健康，6月齡，大小規(guī)格基本一致，150g左右，飼養(yǎng)于循環(huán)水系統(tǒng)中，25oC，商品飼料(40%粗蛋白、10%粗脂肪、10%灰分、能量21KJg－1DM)飼喂一周，天天投喂2次。1．1．2藥品和試劑枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP)購自南通四海植物提取有限公司。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、白蛋白(Alb)、谷胱甘肽(GSH)及總抗氧化能力(T-AOC)等試劑盒購自于南京建成生物工程研究所科技有限公司;總蛋白(TP)測定試劑盒購自于碧云天生物技術(shù)研究所。CCl4(分析純)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。1．2方式方法1．2．1枸杞多糖的提純枸杞多糖通過經(jīng)典的水煮醇沉方式方法［14－15］分離提純:取300g粗枸杞多糖室溫下浸潤于1000mL超純水中過夜處理，然后加熱煎煮2h用定性濾紙過濾除去不溶雜質(zhì)，上清液進(jìn)行離心(500g，10min)，再用0.22m的過濾器進(jìn)行過濾，將上清液收集起來，用乙醇進(jìn)行3次沉淀。其間有絮狀沉淀產(chǎn)生，靜置1h，將靜置后固形物依次以95%乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌除雜，待絮狀沉淀分離出來后，轉(zhuǎn)速2500rmin－1，離心時(shí)間3min，95%乙醇洗滌沉淀3次，在溫度為80oC的烘箱中烘干。1．2．2分組及處理將循環(huán)水系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)1周的建鯉隨機(jī)分為6組，分別設(shè)為空白對照組(CK)、模型組(CCl4)、枸杞多糖藥物對照組(LBPCK)、處理組(枸杞多糖0.1，0.5，1.0gkg－1組)，華而不實(shí)CK組及CCl4模型組:飼喂普通商品飼料;枸杞多糖藥物對照組(LBPCK):飼喂含1.0gkg－1枸杞多糖的飼料;處理組:分別飼喂含0.1，0.5，1.0gkg－1枸杞多糖的飼料。天天投喂2次，每次投喂量為試驗(yàn)魚質(zhì)量的2%。飼喂60d后，Ctrl組及LBPCtrl組腹腔注射橄欖油，CCl4組及加藥處理組經(jīng)腹腔注射含30%CCl4的橄欖油，每10g魚注射0.05mL，注射72h后采肝組織及血樣。1．2．3樣品處理(1)制備血清。所有試驗(yàn)魚經(jīng)尾部靜脈采血后，血樣于5000rmin－1離心5min，收集血清，－20℃儲(chǔ)藏備用，測定TP、GOT、GPT、LDH、Alb等生化指標(biāo)。(2)制備肝組織勻漿。采血后試驗(yàn)魚解剖取肝，置于預(yù)冷生理鹽水中漂洗，濾紙拭干后按肝重∶生理鹽水體積=1∶9的比例參加生理鹽水后勻漿研磨，3000rmin－1離心10min，收集上清，－20℃儲(chǔ)藏備用，測定GSH、SOD、CAT、GSH-Px、T-AOC及MDA等生化指標(biāo)。1．2．4數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用SPSS19.0軟件包中的One-way-ANOVA(單因素方差分析)進(jìn)行分析處理。P＜0.05為顯著差異;P＜0.01為極顯著差異。2結(jié)果與分析2．1枸杞多糖對CCl4致建鯉肝損傷血清中GPT、GOT及LDH的影響如此圖1所示，建鯉經(jīng)CCl4作用后，血清內(nèi)GPT、GOT及LDH含量顯著比空白對照組高(P＜0.01)。飼喂含三種不同濃度枸杞多糖飼料后，GPT、GOT及LDH含量較CCl4組降低，枸杞多糖0.1gkg－1組作用不明顯，0.5gkg－1組可顯著抑制GPT酶活性，但對LDH及GOT活性降低沒有顯著作用;枸杞多糖1.0gkg－1對三種酶活性的降低都有顯著作用，分別降低為CCl4組的73.4%，65.89%，63.13%。枸杞多糖對GPT、GOT及LDH酶活性的抑制作用呈現(xiàn)濃度依靠性，隨著濃度的加大，呈現(xiàn)降低趨勢。2．2枸杞多糖對CCl4致建鯉肝損傷血清中Alb和TP的影響【1】由圖2能夠看出，與空白對照組相比，血清中TP及Alb的含量因CCl4的作用而顯著降低(P＜0.05)，飼喂3種不同濃度含枸杞多糖飼料后，TP和Alb含量的降低趨勢被抑制，且TP有隨著藥物濃度增加，含量呈現(xiàn)升高趨勢。在圖2-A中，與CCl4組相比，枸杞多糖1.0gkg－1組，TP的降低趨勢被明顯的抑制(P＜0.05)，在圖2-B中，枸杞多糖0.5gkg－1組對Alb的減少有顯著抑制作用?！?】2．3枸杞多糖對CCl4致建鯉肝損傷組織勻漿上清中SOD、GSH-Px、MDA、GSH的影響如此圖3-A，B所示，與空白對照組相比，CCl4組抗氧化酶(GSH-Px、SOD)含量顯著降低(P＜0.05)。飼喂含不同濃度枸杞多糖飼料后，這些抗氧化指標(biāo)降低的趨勢得到抑制，華而不實(shí)枸杞多糖三個(gè)濃度組對SOD的降低有顯著的抑制作用，枸杞多糖1.0gkg－1組對GSH-Px提高有顯著作用。同時(shí)，枸杞多糖藥物對照組與空白對照組相比，SOD的活力顯著提高。如此圖3-C，D所示，與空白對照組相比，用CCl4-植物油腹腔注射建鯉72h后，CCl4的損傷作用使得肝細(xì)胞受損，導(dǎo)致MDA大量的生成?！?】飼喂含枸杞多糖的飼料后，MDA的釋放量得到有效的抑制。與CCl4組相比，枸杞多糖1.0gkg－1組對MDA的抑制作用顯著(P＜0.05)。肝組織受損也引起了GSH含量的顯著降低。飼喂含枸杞多糖飼料后，GSH的降低趨勢被抑制，華而不實(shí)1gkg－1組對GSH含量的提高有顯著作用(P＜0.05)。2．4枸杞多糖對CCl4致建鯉肝損傷組織勻漿上清中CAT及T-AOC的影響如此圖4-A，B所示，與空白對照組相比，CCl4作用后使得肝組織勻漿上清中CAT及T-AOC的含量顯著降低。飼喂含枸杞多糖飼料后，這些指標(biāo)的含量得到了不同程度的提高。華而不實(shí)，0.5gkg－1枸杞多糖對CAT及T-AOC均有顯著的提高作用(P＜0.05)，1.0gkg－1組顯著提高了T-AOC的含量(P＜0.05)。【4】3討論利用CCl4來制備肝組織損傷模型是一種比擬經(jīng)典的損傷模型，常被用來挑選保肝藥物。其造模機(jī)理主要是CCl4進(jìn)入機(jī)體內(nèi)經(jīng)細(xì)胞色素P450酶進(jìn)行代謝，產(chǎn)生三氯甲基自由基(CCl3)，三氯甲基自由基與氧反響生成氯甲基過氧化氫自由基(CCl3O2)等氧活性產(chǎn)物［13］，這些自由基通過攻擊生物膜脂發(fā)生不可逆共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反響和氧化應(yīng)激，進(jìn)而毀壞細(xì)胞的膜構(gòu)造［16－19］，造成了肝組織(細(xì)胞)的損傷與死亡。肝臟是物質(zhì)和能量代謝的重要器官，富含大量的代謝酶，具有解毒、代謝等功能，一旦機(jī)體遭到損傷或藥物等外界刺激，肝臟內(nèi)相關(guān)指標(biāo)就會(huì)發(fā)生一系列變化。LDH、GPT、GOT作為評價(jià)CCl4致肝損傷的標(biāo)志性指標(biāo)，可評價(jià)CCl4誘導(dǎo)的肝毒性及枸杞多糖的保肝作用［20］。由圖1知，經(jīng)CCl4作用后血清內(nèi)的LDH、GPT、GOT含量明顯增加，枸杞多糖1%濃度組抑制了其含量的增加。表示清楚枸杞多糖能顯著抑制化學(xué)毒物引起的建鯉肝損傷。類似的結(jié)果在小鼠的肝損傷保衛(wèi)中也有報(bào)道，DayeCheng等［21］曾在枸杞多糖對酒精致小鼠氧化應(yīng)激的影響研究中以為，枸杞多糖對酒精致肝損傷引起的LDH及轉(zhuǎn)氨酶含量的增加有明顯的抑制作用。這種抑制作用可能與枸杞多糖促進(jìn)微粒體膜的活性，減少胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶外滲，進(jìn)而維持肝微粒體功能，保證細(xì)胞構(gòu)造的完好性有關(guān)［22］。建鯉肝組織經(jīng)CCl4作用后，TP、Alb的含量出現(xiàn)明顯下降，但用枸杞多糖飼喂的建鯉，這種降低被明顯地抑制。邢雁霞等［23］也有相關(guān)類似的報(bào)道，枸杞多糖能夠升高小鼠血清內(nèi)CCl4引起的蛋白含量降低。這種保衛(wèi)作用可能與枸杞多糖能夠修復(fù)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷，促進(jìn)核糖體合成蛋白有關(guān)。MDA是膜脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，其含量高低是檢測脂質(zhì)過氧化的重要指標(biāo)［24］。CCl4作用使得肝細(xì)胞受損，釋放出大量MDA。飼喂含枸杞多糖飼料后，MDA含量明顯減少，講明枸杞多糖能夠減少M(fèi)DA釋放量，提高抗脂質(zhì)過氧化的能力。甘璐等［22］也曾報(bào)道，枸杞多糖可顯著提高荷瘤鼠免疫細(xì)胞的活力及降低脂質(zhì)過氧化值。這可能與枸杞多糖能夠加強(qiáng)生物膜脂質(zhì)的生物活性，降低自由基對細(xì)胞的親脂攻擊有關(guān)。GSH是一種低分子去除劑，在肝臟的生化代謝中發(fā)揮重要的作用，對自由基具有較強(qiáng)的去除作用，保衛(wèi)肝細(xì)胞功能正常。機(jī)體遭到氧化損傷時(shí)，GSH不斷消耗，以致自由基不能及時(shí)被去除，構(gòu)成自由基的損傷［25］。由圖3數(shù)據(jù)顯示，枸杞多糖顯著的抑制了肝損傷造成的GSH含量的降低。在對小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖能夠有效的抑制鎘致大鼠肝氧化性損傷中GSH的降低［26］，這可能與GSH通過與GSH-Px共同作用，進(jìn)而抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)展，來阻斷新自由基的產(chǎn)生有關(guān)。SOD、CAT、GSH-Px存在于所有的氧化代謝細(xì)胞內(nèi)，作為自由基去除系統(tǒng)可防止自由基對細(xì)胞的損害并且對損害的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)［22］。由圖3和圖4數(shù)據(jù)顯示，枸杞多糖顯著提高了這些抗氧化酶的活性。在小鼠體內(nèi)試驗(yàn)表示清楚，枸杞多糖可通過一系列的生理生化機(jī)制，活化機(jī)體抗氧化酶，提高機(jī)體的抗氧化能力，進(jìn)而保衛(wèi)細(xì)胞免受自由基攻擊。T-AOC是反響機(jī)體抵御自由基攻擊，抗氧化能力強(qiáng)弱的關(guān)鍵指