15第十五章核酸的研究方法

第十五章核酸的研究方法生物化學(xué)一、DNA的分離二、RNA的分離三、核酸含量的測(cè)定法第一節(jié)核酸的分離、提純和定量測(cè)定核酸制備的原則防止核酸的降解和變性采用溫和的條件，防止過(guò)酸、過(guò)堿、避免劇烈攪拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用。一、DNA的分離真核生物細(xì)胞中的染色體DNA與堿性的組蛋白結(jié)合在一起，成為核蛋白（DNP），DNP溶于高鹽溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低鹽溶液（0.14mol/LNaCl）。利用這一性質(zhì)，可將細(xì)胞破碎后用濃鹽溶液提取，低鹽沉淀，使DNP纖維沉淀出來(lái)。用玻璃棒將DNP纖維纏繞在棒上，再經(jīng)多次溶解和沉淀以純化DNP。二、RNA的分離分離RNA時(shí)要特別注意防止RNase對(duì)RNA的降解。RNase無(wú)處不在，且耐高溫，不易滅活。制備RNA通常需要注意3點(diǎn)：①所有用于制備RNA的玻璃器皿都要經(jīng)過(guò)高溫焙烤，塑料用具經(jīng)過(guò)高壓滅菌，不能高壓滅菌的用具要用0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)處理，再煮沸以除凈DEPC。DEPC能使蛋白質(zhì)乙基化而破壞RNase活性。②在破碎細(xì)胞的同時(shí)加入強(qiáng)變性劑(如胍鹽)使RNase失活。③在RNA的反應(yīng)體系內(nèi)加入RNase的抑制劑(如RNasin)。三、核酸含量的測(cè)定法紫外分光光度法（260nm）定磷法（鉬藍(lán)比色法）

先用濃硫酸或過(guò)氯酸將有機(jī)磷水解成無(wú)機(jī)磷。在酸性條件下正磷酸與鉬酸作用生成磷鉬酸，在還原劑存在下被還原成鉬藍(lán)（660nm），從磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知樣品中磷的含量，從而求出核酸的含量。當(dāng)RNA與鹽酸共熱時(shí)核糖轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡?，它與甲基苯二酚(地衣酚)反應(yīng)呈鮮綠色（670nm)DNA在酸性溶液中與二苯胺共熱，其脫氧核糖可參與反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，最大吸收峰在595nm處定糖法第三節(jié)核酸的凝膠電泳一、瓊脂糖凝膠電泳二、聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖

一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來(lái)。一、瓊脂糖凝膠電泳

以瓊脂糖凝膠為支持物時(shí)，DNA電泳的遷移率決定于以下因素：（1）核酸分子的大小。遷移率與分子量的對(duì)數(shù)成反比。（2）膠濃度。膠濃度大則網(wǎng)孔小，核酸的遷移率變小。（3）DNA的構(gòu)象。超螺旋的DNA遷移率>線性DNA>開(kāi)環(huán)DNA

但凝膠中的溴乙錠濃度對(duì)此有影響。EB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。EB在300nm紫外光照射下能發(fā)紅-橙色熒光，即可顯示DNA泳帶在凝膠中所處的位置。熒光強(qiáng)度與DNA含量及大小成正比。

電泳后將膠浸泡在溴乙錠溶液中染色，紫外光照射下觀察電泳結(jié)果。也可在制膠時(shí)就加入溴乙錠，這樣可以在電泳過(guò)程中用紫外燈照射，觀察電泳的進(jìn)程。扁平狀染料與DNA的結(jié)合吖啶橙溴（化）乙啶

1ngDNA條帶可顯示第五節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）PCR：是一種利用DNA變性和復(fù)性原理在體外進(jìn)行特定的DNA片斷高效擴(kuò)增的技術(shù)。1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過(guò)程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。原理：1DNA變性，兩條鏈解開(kāi)

2引物模板退火，二者堿基配對(duì)

3DNA聚合酶隨即以4種dNTP為底物，在

引物的引導(dǎo)下合成與模板互補(bǔ)的DNA新鏈

4重復(fù)此過(guò)程，DNA以指數(shù)方式擴(kuò)增PCR

PCR動(dòng)畫1stcycle2ndcycle3rdcycle過(guò)程變性引物退火延伸1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍Juang

RH

(2004)

BCbasicsCAGGTCCAGCAGGCCCAGGCC+

polymerase+

primerreplicationCGGGCCMutantThrtranslation定點(diǎn)突變

Wild

typeCAGGTCValtranslationWild

type

proteinMutant

protein(1)

(2)primer(3)(5)(4)(6)突變只改變了一個(gè)氨基酸

Val

→

ThrSmith

(1993)基本步驟：設(shè)計(jì)一對(duì)引物優(yōu)化反應(yīng)體系：模板、引物、4種dNTP，耐熱DNA聚合酶、Mg2+選擇3個(gè)溫度進(jìn)行熱循環(huán)(25~30個(gè)周期)：

變性94℃

退火45~60℃

延伸(1min)，循環(huán)25~30個(gè)周期，最后延伸10min應(yīng)用電泳技術(shù)，檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果.標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L10×擴(kuò)增緩沖液

PCR反應(yīng)五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+PCR的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNAPCR瓊脂糖凝膠電泳最終產(chǎn)物紫外光觀察3-4小時(shí)PCR技術(shù)的應(yīng)用用于合成特異探針；用于DNA的測(cè)序；將逆轉(zhuǎn)錄與PCR相偶聯(lián)（RT-PCR）；

用于基因定位誘變；末知序列的PCR擴(kuò)增；基因組序列的比較研究；

用于臨床診斷（遺傳病，癌基因的檢查等）。生物學(xué)領(lǐng)域幾乎無(wú)處不用基因、DNA片段的克隆人工基因構(gòu)建DNA序列測(cè)定基因定點(diǎn)突變基因型（突變）檢測(cè)，SNP分析，遺傳背景分析生物物種鑒定，系統(tǒng)進(jìn)化研究基因表達(dá)量研究（real-timePCR）/基因表達(dá)譜研究（DNAchip,SAGE）醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用疾病基因