噬菌體展示技術(shù)和其應(yīng)用

Phagedisplay

噬菌體展示技術(shù)及其應(yīng)用食品學(xué)院廖振林Email：liao0zhenlin2004@126.com1/15/20231噬菌體展示技術(shù)是將各種多肽或蛋白質(zhì)以融合蛋白的形式表達(dá)并展示在噬菌體表面，同時將其遺傳密碼包含于噬菌體內(nèi)部，這使得蛋白質(zhì)的功能與其基因密碼有機(jī)的連結(jié)在一起。

1/15/20232非展示系統(tǒng)展示系統(tǒng)1/15/20233TheexpressionofexogenouspeptidesonthesurfaceoffilamentousbacteriophagewasinitiallydescribedbySmithin1985.Sincehisfirststudy,differentmoleculessuchassmallpeptidesandantibodieshavebeendisplayedoncoatproteinsofphage,greatlyexpandingtheapplicationsofthetechnology.Thepastdecadehasseenconsiderableprogressinthetechniquesandapplicationsofphagelibraries.Inaddition,differentscreeningmethodshaveallowedisolationandcharacterizationofpeptidesbindingtoseveralmoleculesinvitro,inthecontextoflivingcells,inanimalsandinhumans.1/15/20234-Invivouseofphagelibraries.Initiallythephagelibraryisinjectedinthecirculation.Next,phageisallowedtocirculateforminutesorhours(inthiscasewheninternalizedphagesaretoberecovered).Finally,afterdeepanesthesia,miceareeuthanizedandtheorgansaredissectedforphagerecoveryandpeptidesequencing.1/15/20235Phagestructure.PIII,pVI,pVII,pVIIIandpXIXrepresent

phageproteins.Exogenouspeptidesareexpressedor“displayed”usually

onpIIIorpVIII.

1/15/20236三絲狀噬菌體的生物學(xué)形態(tài)：長桿狀，長度約1um，管直徑約6nm?；蚪M：約6400核苷酸大小的單鏈線狀DNA，結(jié)構(gòu)：●2700個主要蛋白（PVIII）分子螺旋狀排列形成長管，●一頭5個拷貝的次要?dú)さ鞍譖III和PVI，●另一頭則由次要?dú)さ鞍譖VII和PIX。生理：●F菌毛結(jié)合的序列是PIII蛋白N端的200個氨基酸。●一個分裂周期中可生產(chǎn)幾百個子代，

●

其產(chǎn)量可達(dá)到0.3mg/ml。1/15/20237外源蛋白的展示部位

1/15/20238噬菌體展示技術(shù)所展示外源多肽和及文庫

1.

隨機(jī)肽庫

l

隨機(jī)肽庫通常較短（4~36氨基酸[8,9]長度）

l

編碼它們的核酸由化學(xué)法合成而得l

其展示方式包括3，33，3+3，8，88，8+8等

2.

基因文庫

l

基因組文庫如DNAstaphylococcusaurous

l

cDNA文庫

l

抗體庫

l

病毒cDNA

3.各種自然蛋白及蛋白片段等

其中包括-半乳糖苷酶等蛋白片段；酶類如堿性磷酸酶，胰酶等；激素類如人生長素，血管緊張激素等；酶抑制劑如牛胰蛋白酶抑制劑等；毒素如蓖麻毒蛋白B鏈等；受體如IgE受體亞單位、T細(xì)胞受體等；觸體如P物質(zhì)、神經(jīng)激肽A和B等；抗原及抗原表位；DNA和RNA結(jié)合蛋白如鋅指蛋白等；酶底物如蛋白酶底物等；細(xì)胞素如IL3，IL6等。

1/15/20239抗體庫技術(shù)簡單流程1/15/202310

獲得抗體基因1/15/202311

插入載體1/15/2023121/15/202313

表達(dá)1/15/202314

篩選1/15/2023151/15/202316噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展簡史1985年Smith—證實(shí)噬菌體fd基因組能通過基因工程的手段進(jìn)行改造[1]。1988年P(guān)armley—將已知抗原決定簇與噬菌體PⅢN端融合呈現(xiàn)在其表面[2]。1990年McCafferty—用噬菌體展示技術(shù)篩選溶菌酶的單鏈抗體成功使噬菌體展示技術(shù)進(jìn)入一個廣泛應(yīng)用的時代[3]。一系列噬菌體文庫的構(gòu)建—噬菌體展示技術(shù)煥發(fā)出了新的生命力。1/15/202317

噬菌體定義：是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。

噬菌體宿主菌形態(tài)核酸T1-T7、λ、N4大腸埃希菌蝌蚪形dsDNA，線狀P1志賀菌蝌蚪形dsDNA，線狀P22沙門菌蝌蚪形dsDNA，線狀SP01、SP82枯草芽胞桿菌蝌蚪形dsDNA，線狀Φ29解淀粉芽胞桿菌蝌蚪形dsDNA，線狀PM2假單胞菌微球形，有包膜dsDNA，線狀ΦX174、S13、M12、G4大腸埃希菌微球形ssDNA，線狀f1、fd、M13大腸埃希菌絲形ssDNA，線狀MS2、f2、fr、Qβ大腸埃希菌微球形ssRNA，線狀Φ6假單胞菌微球形，有包膜dsRNA，線狀，分成3節(jié)段噬菌體分類：1/15/202318絲狀噬菌體蝌蚪形噬菌體λ噬菌體、T4噬菌體、T7噬菌體M13噬菌體1/15/202319T7與M13相比優(yōu)勢明顯T7Select的優(yōu)勢解釋是在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的裂解性噬菌體與M13不同，T7是裂解性的，其展示的蛋白無需分泌。C-端融合插入序列被克隆到T7Select載體基因10的C-端，可以使帶有終止密碼子的插入子得以表達(dá)和展示。載體克隆容量大T7載體比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1kbp的片段都不穩(wěn)定。插入片段穩(wěn)定T7重組子很穩(wěn)定，而M13重組子–尤其是>1kb的很不穩(wěn)定洗提條件靈活M13穩(wěn)定性尚可，但是洗提條件頗受限制，SDS、鹽、離液劑等，都能造成不穩(wěn)定。而T7在1%SDS，5MNaCl，4M尿素，2M鹽酸胍，10mMEDTA,100mMDTT，pH4-10等條件下穩(wěn)定。生長迅速(小于3小時)，噬斑大明顯縮短富集過程，每輪親和淘洗之間時間少，2天內(nèi)即可完成標(biāo)準(zhǔn)淘洗包裝效率極高(>109

pfu/ug)操作很簡便，只需將DNA加到抽提物中，放置并鋪板?？寺⌒矢進(jìn)13要用電轉(zhuǎn)化方能獲得高效克隆，而T7Select制備大文庫則容易得多1/15/202320噬菌體cDNA展示技術(shù)以改構(gòu)的噬菌體為載體，cDNA基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白基因區(qū)，使外源蛋白表達(dá)并展示于噬菌體表面，通過親和富集法篩選表達(dá)有特異蛋白質(zhì)的噬菌體。1/15/202321噬菌體展示系統(tǒng)的類型產(chǎn)品概況載體用途展示拷貝數(shù)/噬菌體展示大小(氨基酸)宿主T7Select415-1多肽41540–50aaBL21T7Select1-1*蛋白或多肽≤11200aaBLT5403或5615T7Select1-2a,b&c蛋白或多肽≤1900aaBLT5403或5615T7Select10-3b*蛋白或多肽約為10>564**(上限待定)BLT5403或56151/15/202322噬菌體cDNA展示技術(shù)的應(yīng)用1用于模擬表位的研究。2用于DNA、RNA結(jié)合蛋白的研究。3用于蛋白-蛋白相互作用的研究。4用于非蛋白小分子與蛋白相互作用的研究。5細(xì)胞與蛋白相互作用的研究。6酶作用底物的分析、先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)、定位信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等。1/15/2023231/15/202324問題1.沒有一個系統(tǒng)能夠表達(dá)所有的真核細(xì)胞蛋白。2.在外源cDNA插入噬菌體載體時存在雙向插入，可能導(dǎo)致表達(dá)減少或者逆向表達(dá)。1/15/202325展望噬菌體cDNA展示技術(shù)有效地實(shí)現(xiàn)了基因型和表現(xiàn)型的轉(zhuǎn)換，在分子克隆的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)構(gòu)想的體外控制，從而可獲得具有生物學(xué)活性的表達(dá)產(chǎn)物。若將其與蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測、分子模擬技術(shù)完美融合，對分子相互作用、分子識別、受體識別、酶學(xué)機(jī)制等研究進(jìn)程將起到極大的推動作用。1/15/202326應(yīng)用舉例：部分做過的工作1/15/202327一、半合成噬菌體抗體庫的構(gòu)建構(gòu)建一個半合成抗體庫，不經(jīng)免疫制備人源抗Tie2Fab抗體。通過RT-PCR方法，從人臍帶血淋巴細(xì)胞總RNA擴(kuò)增輕鏈基因及重鏈VH段基因，將輕鏈基因插入pCOMb3載體中，得人輕鏈質(zhì)粒庫；從乙肝表面抗體（HBsAb）的Fd段基因制備含有不同長度隨機(jī)化CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后將VH段基因與隨機(jī)化的CDR3融合，得到Fd基因片段，再將其插入輕鏈質(zhì)粒庫中，得半合成人Fab質(zhì)粒庫。

1/15/202328材料和方法人臍帶血淋巴細(xì)胞

Ficoll–paqueplus購自Pharmacia公司。Trizol試劑購自Invitrogen

公司。pComb3噬菌體抗體表達(dá)載體：4029bp，含有可插入輕鏈和重鏈基因的克隆位點(diǎn)。大腸桿菌XLl-blue輔助病毒VCSM13

1/15/202329cDNA制備引物設(shè)計電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備輔助噬菌體的制備抗體庫制備1/15/202330結(jié)果PCR擴(kuò)增人抗體基因

圖3.1λ鏈PCR擴(kuò)增結(jié)果1-6泳道：VL1,VL2,VL3,VL4,VL5,VL6M：MarkerDL2,000圖3.2κ鏈PCR擴(kuò)增結(jié)果11-3泳道：VK1,VK2,VK3M：MarkerDL2,0001/15/202331圖3.3重鏈分段PCR擴(kuò)增結(jié)果1－3泳道：H135，H2，H4(約290bp)4－7泳道：CDR3-5,CDR3-8,CDR3-10,CDR3-12(約400bp)M：MarkerDL2,000

1/15/202332圖3.4重鏈重疊PCR擴(kuò)增結(jié)果1－3泳道：CDR3-5+(H135，H2，H4)融合結(jié)果4－6泳道：CDR3-8+(H135，H2，H4)融合結(jié)果7－9泳道：CDR3-10+(H135，H2，H4)融合結(jié)果10－12泳道：CDR3-12+(H135，H2，H4)融合結(jié)果123456M789101112M1/15/202333圖3.5輕鏈和重鏈插入pComb3流程HL1/15/202334人源輕鏈抗體文庫的構(gòu)建

經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacI和XbaI雙酶切的人抗體輕鏈PCR產(chǎn)物與用相同內(nèi)切酶酶切、去磷酸化的pComb3載體，16℃連接，用該連接產(chǎn)物進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，根據(jù)1μl和10μl菌液鋪平板所長出來的菌落數(shù)，可推算出人抗體輕鏈文庫的庫容量。

κ鏈文庫的容量為5.03×106,λ鏈文庫的容量為6.8×106(多次建庫混合后的庫容量)。從平板上隨機(jī)挑取10個菌落，涂格，過夜培養(yǎng)，菌落PCR鑒定。對于λ鏈文庫，10個克隆中有6個陽性，λ鏈文庫的插入率大約為60％；κ鏈文庫10個克隆中有7個是陽性，其插入率大約為70％。

1/15/202335人源噬菌體Fab抗體半合成文庫的構(gòu)建

將酶切純化的重鏈重疊PCR產(chǎn)物插入經(jīng)酶切、并切膠回收純化的輕鏈抗體文庫中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，在輔助噬菌體VCSM13的超感染下，繁殖出表達(dá)人抗體Fab段的噬菌體，即為抗體組合文庫。1μl和10μl轉(zhuǎn)化菌鋪平板計數(shù)，計算出κ＋Fd（包括CDR3-5到CDR3-12的全部隨機(jī)化Fd片段）文庫的庫容為5.89×106。隨機(jī)挑取10個菌落，涂格，過夜培養(yǎng)后菌落PCR：其中6個克隆中有輕鏈也有重鏈。雙鏈插入率為60％左右。1/15/202336以相同的程序構(gòu)建λ＋Fd鏈抗體庫，庫容量為6.55×106,隨機(jī)挑取10個菌落，涂格，過夜培養(yǎng)后菌落PCR：其中有5個克隆擴(kuò)增出輕鏈和重鏈片段。雙鏈插入率為50％左右。為了提高抗體庫的庫容量，在增加細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率的同時，進(jìn)行了多次轉(zhuǎn)化，每次轉(zhuǎn)化都計算插入率。結(jié)果如表所示。1/15/202337表3.1抗體庫的庫容與抗體片段插入率

ND：未做1/15/202338混合抗體庫的鑒定

將所構(gòu)建的各種Fab抗體庫混合成為最終的人源噬菌體抗體庫，理論庫容為1.97×107

實(shí)際的噬菌體抗體庫滴度為3.9×1014cfu/ml。隨機(jī)挑取10個菌落進(jìn)行PCR，.電泳觀察,雙鏈陽性有5個(圖3.6),單鏈（輕鏈或者重鏈）陽性有4個,空載體1個,Fab陽性率為50％左右。

1/15/202339圖3.6半合成抗體庫Fab重組克隆的PCR鑒定

其中1，2，4，5，8五個克隆為輕重鏈雙陽性克隆M1L1H2L2H3L3H4L4H

M5L5H

6L6H

7L7H

8L8H1/15/202340討論本研究采取構(gòu)建半合成抗體庫的方法，以胎兒臍帶血為材料，將基因組的VH段與人工合成的CDR3（共4組）拼接，在體外進(jìn)行V-D-J重排，構(gòu)建Fd段基因庫，再與來自胎兒臍帶血的輕鏈基因庫組合?，F(xiàn)已明確人類基因組中有約50個VH基因，分7個亞群，第6和第7個亞群僅各有一個基因。我們設(shè)計了三種VH基因5’端引物，其中可擴(kuò)增出第1,3,5亞群，H2擴(kuò)增第2亞群，H4擴(kuò)增第4亞群，第6,7亞群因基因數(shù)量少未設(shè)計專門引物，但也可分別由H135和H4擴(kuò)增。

1/15/202341

在進(jìn)行CDR3隨機(jī)化的過程中，進(jìn)行重疊PCR時難免會有錯誤。故在完成Fd鏈的融合后，對Fd基因進(jìn)行了檢測，將產(chǎn)物克隆到T載體中，測定了5個克隆。發(fā)現(xiàn)有2個克隆在重疊區(qū)提前出現(xiàn)了終止密碼子或者缺失D區(qū)，另外3個正常，分別屬于VH1,VH2,VH4基因家族

1/15/202342為了增加抗體基因的豐度，在試驗(yàn)過程中提取淋巴細(xì)胞總RNA，可以避免提取

mRNA時容易降解和丟失目的基因。獲得的抗體基因需要多次酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟，所以在這些過程中要盡量提高連接效率：可采取分步雙酶切，保證切割完全，檢測連接效率。

1/15/202343

實(shí)驗(yàn)過程中，克隆的抗體基因在細(xì)菌的培養(yǎng)過程中會有丟失現(xiàn)象發(fā)生，雙鏈陽性率會由轉(zhuǎn)化時的60％左右變成50％左右，與前人報告的情況一致?？赡茉蛴校簬в休p重鏈基因的克隆在細(xì)菌生長過程中發(fā)生缺失突變、帶有抗體基因的克隆生長緩慢、輔助噬菌體CP-III蛋白與Fab－CPIII蛋白競爭進(jìn)入噬菌體過程中部分噬菌體沒有Fab－CPIII蛋白包裝在表面。

1/15/202344二從噬菌體抗體庫中篩選抗Tie2抗體以Tie2為靶標(biāo)，對已經(jīng)建好的半合成噬菌體抗體庫進(jìn)行3輪的吸附、洗脫、擴(kuò)增的篩選，獲得2株能夠同Tie2抗原特異性反應(yīng)的Fab噬菌體抗體。1/15/202345材料與方法材料抗原Tie2-Fc，Ang1(購自A&BSystem公司)

對照抗原：BSA購自Sigma公司丙型肝炎病毒NS5—表面抗原(本室表達(dá))IgG1標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）?？贵w：HRP標(biāo)記的抗VCSM13多克隆抗體（購自Sigma

公司）HRP標(biāo)記的抗人IgGFab抗體（購自Sigma公司）

1/15/202346方法噬菌體滴度測定噬菌體抗體庫的淘篩，制備噬菌體抗體的抗原結(jié)合活性-夾心ELISA試驗(yàn)噬菌體抗體的特異性鑒定－交叉反應(yīng)性競爭抑制試驗(yàn)序列測定1/15/202347結(jié)果4.1半合成抗體庫的篩選：將Tie2抗原過夜包被在酶連板中，對所得總庫進(jìn)行了三輪淘篩每輪洗脫噬菌體鋪平板計數(shù)，分別是：2.8×104，

2.9×105，

2.6×106。經(jīng)過三輪的吸附、洗脫、擴(kuò)增的篩選，Tie2抗原對噬菌體抗體進(jìn)行了特異性富集。從表4.1可以看出在三輪淘洗的過程中，噬菌體確實(shí)出現(xiàn)了特異性的富集，第三輪淘洗比第一輪的產(chǎn)率高出近40倍。

1/15/202348表4.1噬菌體抗體庫的富集

1/15/2023494.2噬菌體抗體的鑒定

4.2.1噬菌體抗體的抗原結(jié)合活性－ELISA實(shí)驗(yàn)第三輪淘篩后，隨機(jī)挑取60個克隆，制備單克隆噬菌體抗體，用間接ELISA法檢測對Tie2抗原的結(jié)合活性。A490值超過0.8的有10個（見表4.2）。4.2.2

噬菌體抗體的交叉反應(yīng)性鑒定和其他抗原的交叉反應(yīng)性：將噬菌體抗體滴度較高的10個克隆同其他三種不同的抗原（HCVNS5蛋白，BSA，人IgG，）進(jìn)行ELISA交叉反應(yīng)，排除交叉反應(yīng)抗體，剩余的抗體是特異性針對Tie2抗原的（表4.2）。1/15/202350表4.2篩選所得克隆與Tie2的結(jié)合活性及和其他抗原的交叉反應(yīng)性1/15/2023514.2.3競爭抑制試驗(yàn)結(jié)果：

為進(jìn)一步驗(yàn)證所得噬菌體抗體對體Tie2抗原的特異性，用Ang1與陽性噬菌體抗體克隆做競爭抑制試驗(yàn)，結(jié)果表明：Ang1對部分噬菌體抗體的Tie2結(jié)合活性具有抑制作用。如表4.3所示

1/15/202352表4.3競爭抑制試驗(yàn)結(jié)果

1/15/2023534.2.4所得克隆的酶切與測序：選取交叉反應(yīng)小，有競爭抑制活性的克隆進(jìn)行酶切鑒定(EcoRI＋XhoI酶切如圖4.1所示)，片段大小為1.6Kb和3.7Kb大小正確。同時送部分菌株測序。

1/15/202354圖

4.1pComb3-Fab酶切結(jié)果

3.7kb1.6kb

2000S1212S2S4M1M2S12,12,S2,S4Fab陽性克隆M1Λ/Ecot14M2DL20001/15/202355序列分析

克隆S12測序結(jié)果與抗體胚系基因數(shù)據(jù)庫（V-BASE）比較，重鏈屬于VH4基因家族，與胚系基因DP-66同源性最高；D、J分別是D7-27和JH3a；輕鏈屬于Vκ1家族，來自胚系基因DPκ3，J段屬于Jκ2（如圖4.2）。在重鏈的CDR3區(qū)，符合最初的（NNK）8的隨機(jī)化設(shè)計，在CDR3前面共有人工加入的8個氨基酸，后面3個氨基酸是基本固定的。12號克隆重鏈屬于VH1家族，與DP-23同源性最高，D、J分別是DP-26和JH4d，CDR3區(qū)，符合最初的（NNK）12隨機(jī)化設(shè)計；輕鏈屬于VL2家族，來自胚系基因DPL11，J段屬于JL2/JL3a

。

在測序的克隆中，有兩個克隆測序發(fā)現(xiàn)D基因缺失。

1/15/202356圖4.2S12號克隆輕鏈重鏈可變區(qū)DNA及氨基酸序列

1/15/202357討論噬菌體抗體庫展示技術(shù)的發(fā)展為不經(jīng)免疫直接制備抗體成為可能；利用半合成抗體庫直接獲得人源抗體，是噬菌體展示技術(shù)中的主要方法之一。我們在本研究中從半合成抗體庫中成功篩選出抗Tie2人源抗體Fab抗體，說明這一方法是可行的。但所得的Tie2抗體是否能在體內(nèi)抑制Ang1配體的結(jié)合，還需進(jìn)一步的試驗(yàn)。半合成抗體庫的庫容是一個重要參數(shù)，用組合感染法可以達(dá)到1010，常規(guī)的電穿孔法很難達(dá)到。我們的庫容通過多次建庫為1.97×107。在所建庫中篩到的有些克隆VH基因不全，這和王琰的結(jié)論有相似的地方，在CDR3隨機(jī)化的過程中，由于引物合成和重疊PCR的錯誤等原因，會產(chǎn)生一些不完整的基因。1/15/202358總結(jié)1