DNA重組技術(shù)的基本工具4

基因工程專題1煙草據(jù)WTO調(diào)查：2004年全世界因狂犬病致死人數(shù)約5.5萬人中國衛(wèi)生部通報(bào)：2004年７月，狂犬病列法定報(bào)告?zhèn)魅静∷劳鰯?shù)之首。發(fā)病死亡率近100%

能產(chǎn)生狂犬病抗體蛋白的轉(zhuǎn)基因每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。1979年，美國將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌生產(chǎn)胰島素，大大降低了生產(chǎn)成本。治療糖尿病特效藥——據(jù)WTO調(diào)查：2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國約6000萬。胰島素思考：轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)了一種生物的某些性狀在另一種生物中表達(dá)。這些性狀的表達(dá)與我們學(xué)過的基因的什么過程有關(guān)？密碼子在生物界是的！DNA(基因)mRNA蛋白質(zhì)(性狀)轉(zhuǎn)錄翻譯通用抗蟲害的玉米轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄轉(zhuǎn)基因

鮭魚基因工程產(chǎn)品轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒乳汁中含有人生長激素的轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷)基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?；蚬こ痰膭e名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)人類需要的基因產(chǎn)物基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論達(dá)爾文提出生物進(jìn)化論基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論孟德爾提出基因的分離定律和自由組合定律基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論

摩爾根證明基因在染色體上，并提出基因的連鎖互換定律?；A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體?；A(chǔ)理理論和和技術(shù)術(shù)發(fā)展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路后期基基礎(chǔ)理理論沃森、克里克克提出DNA的雙螺旋旋結(jié)構(gòu)構(gòu)模型。。基礎(chǔ)理理論和和技術(shù)術(shù)發(fā)展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路后期基基礎(chǔ)理理論梅塞爾爾松、斯塔爾爾證明DNA的半保留留復(fù)制制基礎(chǔ)理理論和和技術(shù)術(shù)發(fā)展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路后期基基礎(chǔ)理理論克里克克等提出出中心法法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制基礎(chǔ)理理論和和技術(shù)術(shù)發(fā)展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路后期基基礎(chǔ)理理論1963年年尼倫伯伯格和馬太破譯編編碼氨氨基酸酸的遺傳密密碼，1966年霍拉納納用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)加以以證明明?；A(chǔ)理理論和和技術(shù)術(shù)發(fā)展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路1)基基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移載載體的的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)2)工工具酶酶的發(fā)發(fā)現(xiàn)3)DNA合成和和測序序技術(shù)術(shù)的發(fā)發(fā)明4)DNA體外重重組的的實(shí)現(xiàn)現(xiàn)5)重重組DNA表達(dá)實(shí)實(shí)驗(yàn)的的成功功6)第第一例例轉(zhuǎn)基基因動(dòng)動(dòng)物問問世7)PCR技術(shù)的的發(fā)明明基礎(chǔ)理理論和和技術(shù)術(shù)的發(fā)發(fā)展催催生了了基因因工程程DNA是遺傳傳物質(zhì)質(zhì)的證證明DNA雙螺旋旋結(jié)構(gòu)構(gòu)和中中心法法則的的確立立遺傳密密碼的的破譯譯基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移載載體的的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)工具酶酶的發(fā)發(fā)明DNA合成和和測序序技術(shù)術(shù)的發(fā)發(fā)明DNA體外重重組的的實(shí)現(xiàn)現(xiàn)重組DNA表達(dá)實(shí)實(shí)驗(yàn)的的成功功第一例例轉(zhuǎn)基基因動(dòng)動(dòng)物問問世PCR技術(shù)的的發(fā)明明基礎(chǔ)理論技術(shù)發(fā)明問題探探討：：蘇云金金芽孢孢桿菌菌含有有一種種可以以合成成毒蛋蛋白的的基因因。讓細(xì)菌菌的毒毒蛋白白基因因在棉棉花細(xì)細(xì)胞中中表達(dá)達(dá)，可可培育育出抵抵抗棉棉鈴蟲蟲害的的抗蟲蟲棉。。想一想想需要做做哪些些關(guān)鍵鍵工作作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉基因工程程培育抗抗蟲棉的的簡要過過程：在以上過過程中關(guān)關(guān)鍵步驟驟或難點(diǎn)點(diǎn)是什么么？普通棉花花(無抗蟲特特性)蘇云金芽芽孢桿菌菌提取抗蟲基因因通過運(yùn)載載體導(dǎo)入入轉(zhuǎn)基因棉棉花含抗蟲基因因轉(zhuǎn)基因棉棉花產(chǎn)生生伴胞晶體體轉(zhuǎn)基因棉棉花有抗蟲特性性一、DNA重組技術(shù)術(shù)的基本本工具基因工程程培育抗抗蟲棉的的關(guān)鍵步步驟：關(guān)鍵步驟驟一：抗蟲基因因從蘇云云金芽孢孢桿菌細(xì)細(xì)胞內(nèi)提取出來來關(guān)鍵步驟驟二：抗蟲基因因與棉花DNA““縫合”關(guān)鍵步驟驟三：抗蟲基因因進(jìn)入棉花花細(xì)胞一、DNA重組技術(shù)術(shù)的基本本工具解決培育育抗蟲棉棉的關(guān)鍵鍵步驟需需要哪些些工具？？“分子手手術(shù)刀””——限制性核核酸內(nèi)切切酶關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子縫縫合針””——DNA連接酶“分子運(yùn)運(yùn)輸車””——基基因進(jìn)進(jìn)入受體體細(xì)胞的的載體一、DNA重組技術(shù)術(shù)的基本本工具DNA重組技術(shù)術(shù)的基本本工具限制性核核酸內(nèi)切切酶——“分子手術(shù)術(shù)刀”DNA連接酶——“分子縫合合針”基因進(jìn)入入受體細(xì)細(xì)胞的載載體——“分子運(yùn)輸輸車”思考：⒈自然界界是否存存在一種種生物的的DNA進(jìn)入另一一生物的的情況？？⒉動(dòng)物容容易讓外外來DNA侵入自身身而得以以遺傳嗎嗎？為什么？？植物呢呢？⒊原核生生物，容容易遭到到入侵嗎嗎？⒋原核生生物并沒沒有在進(jìn)進(jìn)化中滅滅絕，而而是產(chǎn)生生了一些些特殊的的酶來防防范。這這些酶應(yīng)應(yīng)該有什什么特點(diǎn)點(diǎn)？可能酶能能識(shí)別外外來侵入入的DNA并將其分分解，而而對自身身的DNA不能起作作用?！胺肿邮质中g(shù)刀””———限制性性核酸內(nèi)內(nèi)切酶主要來源源：原核生物物限制酶在在原核生生物中的的作用原核生物物容易受受到自然然界外源源DNA的入侵，，但是，，生物在在長期的的進(jìn)化過過程中形形成了一一套完善善的防御御機(jī)制，，以防止止外來病病原物的的侵害。。限制酶酶就是細(xì)細(xì)菌的一一種防御御性工具具，當(dāng)外外源DNA侵入時(shí)，，會(huì)利用用限制酶酶將外源源DNA切割掉，以保保證自身的安安全。所以，，限制酶在原原核生物中主主要起到切割割外源DNA、使之失效，，從而達(dá)到保保護(hù)自身的目目的。含有某種限制制酶的細(xì)胞，，其DNA分子中或者不不具備這種限限制酶的識(shí)別別切割序列，，或者通過甲甲基化酶將甲甲基轉(zhuǎn)移到所所識(shí)別序列的的堿基上，使使限制酶不能能將其切開。。限制酶的種類類與命名：現(xiàn)在已經(jīng)從約約300種微微生物中分離離出了約4000種限制制性內(nèi)切酶(限制酶)。。EcoRⅠSmaⅠ粘質(zhì)沙雷氏桿桿菌（Serratiamarcesens）大腸桿菌（EscherichiacoliR）練習(xí)：流感嗜嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分分離到3種限制制酶，則則分別別命名名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ限制酶的的作用特特點(diǎn)作用特點(diǎn)點(diǎn)：能夠識(shí)別別雙鏈DNA分子的某某種特定的核苷酸酸序列，，并且使使每一條條鏈中特定部位的兩兩個(gè)核苷苷酸之間間的磷酸二酯酯鍵斷開切點(diǎn)：磷酸二酯酯鍵舉例：EcoRI限制酶能能識(shí)別GAATTC序列，并并在G和A之間切開開限制酶的的識(shí)別序序列：限制酶所所識(shí)別的的序列有有什么特特點(diǎn)限制酶所所識(shí)別的的序列，，無論是是6個(gè)堿基還還是4個(gè)堿基，，都可以以找到一一條中心軸線線，中軸線線兩側(cè)的的雙鏈DNA上的堿基基是反向?qū)ΨQ稱重復(fù)排列的。。限制酶切切割的結(jié)結(jié)果限制酶EcoRⅠ黏性末端端黏性末端端SmaⅠⅠ平末端平平末端黏性末端端和平末末端要想獲得得某個(gè)特特定性狀狀的基因因必須要要用限制制酶切幾幾個(gè)切口口？可產(chǎn)產(chǎn)生幾個(gè)個(gè)黏性(平)末末端？要切兩個(gè)個(gè)切口，，產(chǎn)生四四個(gè)黏性性(平)末端。。如果把兩兩種來源源不同的的DNA用同一種種限制酶酶來切割割，會(huì)怎怎樣呢？？會(huì)產(chǎn)生相同的黏黏性(平平)末端端，然后讓讓兩者的的黏性(平)末末端黏合起來，就就似乎可可以合成成重組的的DNA分子了。。思考?……GAATTC……………CTTAAG……………GAATTC……………CTTAAG………EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來源的DNA片段混合將不同種種來源的的DNA片段連接接起來生物A基因片段段生物B基因片段段……GAATTC……………CTTAAG…………GAATTC……………CTTAAG……酶切二、“分分子縫合合針”———DNA連接酶①作用:把切下來來的DNA片段拼接接成新的的DNA，，即將脫氧核糖糖和磷酸酸連接起來來.②作用原原理：催化磷酸酸二酯鍵鍵形成DNA連接酶——“分子縫合合針”連接酶有有兩種：：一種是是從大腸腸桿菌中中分離得得到的，，稱之為為E·coli連接酶。。另一種種是從T4噬菌體中中分離得得到，稱稱為T4連接酶。。這兩種連連接酶催催化反應(yīng)應(yīng)基本相相同，都都是連接接雙鏈DNA的缺口，，而不能能連接單單鏈DNA。E·coli連接酶只只能連接接黏性末末端；T4連接酶既既可“縫縫合”黏黏性末端端，又可可“縫合合”平末末端?？砂佯ば孕阅┒酥g的縫隙“縫縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限限制酶切切開的兩兩個(gè)核苷苷酸之間間的磷酸酸二酯鍵鍵T4DNA連接酶還可把平末端之之間的縫縫隙“縫縫合”起來，但但效率較較低T4DNA連接酶比較：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接接黏性末端端能連接黏性末端端和平末端(效率較較低)相同點(diǎn)差別（二）““分子縫縫合針””——DNA連接酶DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點(diǎn)尋根問底底DNA連接酶與與DNA聚合酶是是一回事事嗎?為為什么?1)只能能將單個(gè)核苷苷酸連接到已有的的核酸片段上上，形成磷酸酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過磷酸二酯酯鍵連接成一條互互補(bǔ)的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)時(shí)連接起來，不需要模板三、“分子運(yùn)運(yùn)輸車”———基因進(jìn)入入受體細(xì)胞的的載體思考：⑶假如目的基基因?qū)胧荏w體細(xì)胞后不能能復(fù)制或不能能轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基基因生物能有有預(yù)想的效果果嗎？⑴作為分子運(yùn)運(yùn)輸車——載載體，如果沒沒有切割位點(diǎn)點(diǎn)將會(huì)怎樣？？⑵霍亂菌的質(zhì)質(zhì)粒多個(gè)限制制酶切點(diǎn)，你你會(huì)用它來做做分子運(yùn)輸車車嗎？⑷目的基因有有沒有進(jìn)入受受體細(xì)胞，如如何去發(fā)現(xiàn)？？基因的載體——“分子運(yùn)輸車””載體必須具備備的條件：1、能夠在宿宿主細(xì)胞中復(fù)復(fù)制并穩(wěn)定地地保存；2、具有1-多個(gè)限制酶酶切點(diǎn)，以便便與外源基因因連接；3、具有某些些標(biāo)記基因，，便于進(jìn)行篩篩選。（如抗抗菌素的抗性性基因、產(chǎn)物物具有顏色反反應(yīng)的基因等等）4、對受體細(xì)胞胞無害載體的作用：：1、將外源基基因轉(zhuǎn)移到受受體細(xì)胞中去去。2、利用運(yùn)載載體在受體細(xì)細(xì)胞內(nèi)，對外外源基因進(jìn)行行大量復(fù)制。。常用的載體有有：質(zhì)粒，λ噬菌體的衍生生物，動(dòng)植物物病毒等質(zhì)粒質(zhì)粒是基因工工程最常用的的運(yùn)載體，它它廣泛地存在在于細(xì)菌中，，是細(xì)菌染色色體外能夠自自主復(fù)制的很