生物化學(xué)與分子生物學(xué)進(jìn)展-工具酶

分子克隆技術(shù)常用的工具酶基因重組基因組DNA目的基因PCR限制性內(nèi)切酶目的基因基因載體重組體(復(fù)制子)基因重組工欲善其事，必先利其器核酸核酸水解酶類核酸合成酶類核酸修飾酶類核酸內(nèi)切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA連接酶甲基化酶核苷酸激酶核苷酸轉(zhuǎn)移酶磷酸酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶5’5’GCAATGCTTAGCCATCGTTACGAATCGGTA核酸外切酶核酸內(nèi)切酶核酸外切酶3’3’5’5’GCAAGCTTTAGCCATCGTTCGAAATCGGTA限制性核酸內(nèi)切酶AGCTAGCTAGCTAGCTAGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ（+）（-）電泳IIIIII限制性核酸內(nèi)切酶

能在特異位點(diǎn)（酶切位點(diǎn)）上催化雙鏈DNA分子的斷裂,產(chǎn)生相應(yīng)的限制性DNA片段。切割不同來源的DNA分子，而產(chǎn)生特征性限制性酶切圖譜，具有重大應(yīng)用價值（“分子手術(shù)刀”）。

存在于細(xì)菌體內(nèi)。

一、限制酶概念提出的背景

20世紀(jì)30年代，微生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)，微生物的噬菌體不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌體只能感染EcoliK株，不能感染其它Ecoli株，反之亦然。這種現(xiàn)象稱為“限制現(xiàn)象”。

1962年，W．Arber提出一個假設(shè)來解釋上述現(xiàn)象。他認(rèn)為這是細(xì)菌中有2種以上功能不同的酶，一種是核酸內(nèi)切酶，能識別并切斷外來DNA分子的某些部位，使外來DNA失去活性，限制外來噬菌體的繁殖，把這類酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶.EcoliK株噬菌體EcoliK株其他Ecoli菌株限制現(xiàn)象限制性內(nèi)切酶

能識別并切斷外來DNA分子的某些部位，使外來DNA失去活性，限制外來噬菌體的繁殖，把這類酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶。修飾與限制系統(tǒng)是細(xì)菌保護(hù)自身不受外來DNA入侵的防御系統(tǒng)NNNNNNNNNNNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNBamHⅠ5’3’NNNNNNNNNNNNAGCTNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ5’3’二、限制性核酸內(nèi)切酶的分類

自1968年首次從EcoliK株和β株中分離到限制酶，繼后不斷發(fā)現(xiàn)和分離到新的限制酶。僅2003年1-4月份就有150余種新的酶被登錄入網(wǎng)，至2003年04月19日,REBASE(TheRestrictionEnzymeDatabase)收集的編號已有7096種；其中Ⅱ類酶有3845種．

根據(jù)其識別和切割序列的特性、催化條件及修飾活性等，一般將限制酶分為I，Ⅱ，Ⅲ三大類。

I類：系復(fù)合功能酶，即對雙鏈DNA有切割、甲基化、解旋的活性不適用于基因工程。只在腸道菌中發(fā)現(xiàn)。Ⅱ類：基因工程的工具酶。Ⅲ類：切割位點(diǎn)不在識別位點(diǎn)，一般離識別位點(diǎn)25bp～27bp，對分子克隆操作亦無實(shí)用意義。I類限制酶由3個不同的亞基組成，這3個亞基分別由宿主特異DNAhsdS，hsdM，hsdR基因編碼，反應(yīng)條件需要Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸，系復(fù)合功能酶，即對雙鏈DNA有切割、甲基化、解旋的活性，并有水解ATP的ATP酶活性。一般在識別位點(diǎn)外的400bp～7000bp進(jìn)行非特異切割，產(chǎn)生非特異片段，不適用于基因工程。

I類限制酶只在腸道菌中發(fā)現(xiàn)。2個亞基組成，反應(yīng)條件需要Mg2+和ATP，對雙鏈DNA亦有切割和甲基化修飾功能，但無解旋酶和ATP酶活性，識別序列不對稱。修飾時僅在識別序列的一條鏈上甲基化，另一條鏈沒有甲基化。雖能在DNA鏈上的特異位點(diǎn)切割，但切割位點(diǎn)不在識別位點(diǎn)，一般離識別位點(diǎn)25bp～27bp，對分子克隆操作亦無實(shí)用意義。

Ⅲ類限制酶

Ⅱ類限制酶為單鏈多肽，反應(yīng)條件只需Mg2+，對DNA的水解有很強(qiáng)的特異性。它要求嚴(yán)格的識別序列和切割位點(diǎn)，切割位點(diǎn)所要求的序列中有一個堿基的變異、缺失或修飾都不再能被水解。其中大多數(shù)可用于分子克隆，使得分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有高度的精確性、可重復(fù)性，被譽(yù)為分子生物學(xué)家的手術(shù)刀。

Ⅱ類限制酶Ⅱ類限制-修飾系統(tǒng)的限制酶活性與甲基化酶活性分別是不同的酶。相對應(yīng)的限制酶與修飾酶雖然識別DNA的同一序列，但從已知序列的50多對限制-修飾系統(tǒng)酶中，2種酶的氨基酸序列沒有同源性；不同的Ⅱ類限制酶之間，除少數(shù)同裂酶外，亦沒有同源性。

限制酶的命名是采用Smith和Athens提議的方案，即第個1字母取自它來源細(xì)菌屬名的第1個字母，大寫,

第2，3二個字母取自來源細(xì)菌種名的頭2個字母，小寫,

如果它的來源菌還有株系，則有第4個字母；最后用大寫羅馬數(shù)字，代表同一菌株中不同限制酶的編號。前三個字母用斜體表示,如HindⅢ代表從流感噬血桿菌(Haemophilusinfluenzac)d株中分離到的第3個限制酶。三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則1一般性狀

分子質(zhì)量為60kD，單鏈多肽，最適pH為6～8；對熱不穩(wěn)定，通常是溶于含有50％甘油的緩沖液中貯存于–20℃環(huán)境下。取出使用時必須立即置于冰浴中。NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巰基有保護(hù)作用。2識別序列

它對底物要求有特異的序列，通常的識別序列是4bp～6bp，有些則為7bp～8bp，甚或多于8bp。多數(shù)限制酶的識別序列為回文結(jié)構(gòu)，在識別序列內(nèi)或其附近水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵。四、Ⅱ類限制性核酸內(nèi)切酶

5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-

CAATTG-5’EcoRⅠ的識別序列HaeⅠ的識別序列3酶切切口

有些酶在識別序列內(nèi)的對稱軸上切割，其切割產(chǎn)物具平頭末端；很多限制酶不能精確地在2個對稱軸部位切割，而在識別序列2條鏈對應(yīng)位上錯位切割，切割產(chǎn)物有些形成5’-突出的粘性末端,另一些為3’-突出的粘性末端。這些粘性末端的任何一側(cè)都能和另一末端互補(bǔ)配對，使任何含有該識別序列的DNA分子都能和另一個含相同識別序列的DNA分子容易地連接成新的重組分子。

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

AACNNNNN3’3‘NNNNNCAA

TTGNNNNN5’HaeⅠ的識別序列和酶切切口（平端）5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAAEcoRⅠ的識別序列和酶切切口（粘端）AATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’4．貯存與應(yīng)用

限制酶對熱不穩(wěn)定，貯存于-20oC，為避免反復(fù)凍溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用時添加相應(yīng)的緩沖液稀釋，降低反應(yīng)液中甘油的濃度。

5限制酶的活性單位和質(zhì)量評估

限制酶的活性單位是指在適當(dāng)?shù)臈l件下(通常為37℃，pH7.5～8.0，NaCl50mmol/L～150mmol/L，Mg2+5mmol／L～10mmol／L，反應(yīng)體積為50μL)，1h內(nèi)完全酶解1μg特定底物DNA(常用者為λDNA)的酶活性。6影響限制酶活性的因素1）“星”活性酶的特異性改變或特異性降低而呈現(xiàn)的活性。

EcoRⅠ：GAATTC-----

EcoRⅠ*：AATT

酶濃度太高緩沖液的組成偏離(如用其他金屬離子代替Mg2+、高pH或低鹽)

有機(jī)溶劑(如乙醇、異丙醇、二甲亞砜、二甲基乙酰胺、乙三醇)，反應(yīng)液中甘油的終濃度高于5％盡可能使用能在相應(yīng)時間內(nèi)獲得完全酶解的最少酶量減少反應(yīng)體系中甘油的含量除Mg2+外不加其他重金屬離子適當(dāng)提高反應(yīng)系統(tǒng)的離子強(qiáng)度盡可能除去反應(yīng)系統(tǒng)中可能存在的有機(jī)溶劑，如沉淀DNA用的乙醇。2）甲基化識別序列中某些堿基甲基化后會阻礙酶活性。

限制酶識別序列內(nèi)或其鄰近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，會阻礙限制酶的酶解活性。受甲基化影響的酶在商品說明書中都會有標(biāo)示。

所用符號為：m4C表示N4-甲基化胞嘧啶，m5C為C5-甲基胞嘧啶。3）底物性狀

隨底物的不同而活性發(fā)生改變某些限制酶對線性DNA和超螺旋DNA底物的活性有所不同。如EcoRI、PstI和SalI酶解超螺旋pBR322DNA時的用量比酶解同樣量λDNA的用量至少需要增加5倍量的酶。

由于限制酶活性單位一般是用λDNA為底物確定的，因此，對非λDNA底物進(jìn)行酶解時，最好作些預(yù)實(shí)驗(yàn)，以尋找最適酶用量的條件。

底物位點(diǎn)優(yōu)勢

有些限制酶對同一DNA底物上不同酶切位點(diǎn)的切割速率也有差異，稱為底物位點(diǎn)優(yōu)勢。最常見的是HindⅢ對λDNA的消化產(chǎn)物中4.3kb帶的熒光亮度常比2.3kb和2.0kb帶還淺，顯示HindⅢ對該片段位點(diǎn)的切割效率低于其他位點(diǎn)，表現(xiàn)出位點(diǎn)優(yōu)勢效應(yīng)。此效應(yīng)于1975年已被發(fā)現(xiàn)，但其機(jī)制尚未闡明，①與不同位點(diǎn)上堿基的甲基化修飾有關(guān)，②可能與識別序列外的DNA空間結(jié)構(gòu)或某種化學(xué)修飾有關(guān)。4）試劑：緩沖系統(tǒng)

必須用有足夠緩沖能力的緩沖液以維持反應(yīng)最終的適當(dāng)pH

。

Tris緩沖系統(tǒng)是最廣泛應(yīng)用和不利因素最少的，但其溫度系數(shù)大，其pH亦可受濃度的影響，稀釋時須重測pH；反應(yīng)pH大于9時，常選用甘氨酸緩沖系統(tǒng)；要求pH6.0～7.5時，磷酸緩沖液是個好的緩沖系統(tǒng)，溫度系數(shù)小，但磷酸緩沖液僅用于后續(xù)的酶促反應(yīng)不受磷酸根離子抑制的系統(tǒng)，如磷酸鹽會抑制末端標(biāo)記和連接反應(yīng)；通常的酚抽提和乙醇沉淀不能有效地去除磷酸根離子；能絡(luò)合Mg2+的檸檬酸鹽和其他生物緩沖試劑不宜使用。5）限制酶活性不良的可能原因及解決措施

酶已失活，反應(yīng)體系中有抑制劑存在，緩沖液組成或反應(yīng)溫度不適，

DNA已甲基化、未甲基化或其他修飾，

DNA的純度未達(dá)到，底物中沒有所選酶的識別序列，電泳凝膠的濃度不適，等等。7限制片段末端的連接作用5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAAAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAAAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’8特殊性質(zhì)的限制酶1)可變酶其識別序列一般不止6bp，且識別序列中的一個或幾個核苷酸是可變的。如BstⅨ的識別序列及切割方式為：

5’……CCANNNN↓NTGG……3’3’……GGTNNNN↑NACC……5’

2)ⅡS類限制酶又稱遠(yuǎn)距離裂解酶(Distantcleavage)

這類酶的識別序列為不對稱的4bp～7bp，切割位點(diǎn)在識別序列外確定的lbp～20bp.

切割位點(diǎn)在識別序列兩側(cè)以括號內(nèi)的數(shù)字注明。由于其切割位點(diǎn)特殊性，致使其在基因工程中具有一定的應(yīng)用價值。

3)雙切割酶如Bsp24l的識別序列為:(8/13)GACNNNNNNTGG(12／7)，序列兩端括號內(nèi)的數(shù)字表示切割位點(diǎn)在標(biāo)出鏈的識別序列5’-端上游第8位堿基、3’-端下游第13位堿基處，以及在互補(bǔ)鏈識別序列的5’-端上游第12位堿基、3’-端的下游第7位堿基處雙切割.

4)同裂酶(issochizmer)

亦稱為異源同工酶，是從不同菌種分離到的不同的酶，但它們的識別序列相同，切割方式可以相同也可以不相同。如HapⅡ與MspI的識別與切割序列均相同.第二節(jié)甲基化酶

能識別限制酶識別的序列，并把其中的某些堿基甲基化（常見使限制酶識別序列中的C或A甲基化修飾)，屬修飾酶類。經(jīng)修飾的DNA不再被限制酶降解。已分離到與許多Ⅱ類限制酶相對應(yīng)的甲基化酶。其命名是在對應(yīng)II類限制酶名稱前加一個M表示。如M．EcoRI是能使EcoRI識別序列中(GAATTC)3’-端的A甲基化(GAm6ATTC)的酶

識別序列中某些堿基甲基化對II類限制酶的影響至少有3種：

①敏感的，甲基化后不能再切割；②不敏感的．甲基化后仍可切割；③依賴于甲基化的，只有甲基化后才能切割。第三節(jié)與DNA合成相關(guān)酶類一、大腸桿菌DNA聚合酶I1三種酶活性1）DNA聚合活性dTTP5'5'

ATGCAATTGC3'||||3'TAC

GT5’5’引物5’AGCTTCAGGATA3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTATCGAC5’?3’5’外切酶活性

5’3’外切酶活性能切除突變的DNA片段能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解GC2）核酸外切酶活性二、Klenow酶1:隨機(jī)引物標(biāo)記核酸探針2:5’-粘端補(bǔ)平或3’端標(biāo)記3:合成cDNA的第二鏈4:DNA序列分析5:3’-端的末端標(biāo)記小片段N端C端木瓜蛋白酶大腸桿菌DNA聚合酶I5核酸外切酶活性大片段（

Klenow酶）DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性三、逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄mRNADNA以單鏈RNA為模板合成雙鏈DNA的反應(yīng)。1975年，H.TeminRNA病毒:勞斯雞肉瘤病毒放線菌素D(-)(-)DNA合成RNA