免疫測(cè)定方法學(xué)和臨床應(yīng)用

免疫測(cè)定方法學(xué)和臨床應(yīng)用1第一頁，共四十六頁，2022年，8月28日免疫分析技術(shù)簡介乙肝病毒標(biāo)志物定性、定量檢測(cè)常見問題抗HCV檢測(cè)問題ANA.ENA檢測(cè)問題TP-Ab檢測(cè)問題TB-Ab檢測(cè)問題免疫測(cè)定方法學(xué)臨床應(yīng)用第二頁，共四十六頁，2022年，8月28日免疫分析技術(shù)早期的免疫分析技術(shù):

免疫擴(kuò)散、免疫電泳、直接及間接血凝、被動(dòng)血凝、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)特點(diǎn):這些檢測(cè)方法成本低、結(jié)果易于判斷、技術(shù)上便于掌握,但不便于免疫檢測(cè)自動(dòng)化后來的免疫分析技術(shù):

放射性核素標(biāo)記、熒光免疫標(biāo)記、酶免疫標(biāo)記、稀土元素標(biāo)記及化學(xué)發(fā)光分子標(biāo)記特點(diǎn):快速、靈敏、特異、易于測(cè)定等實(shí)驗(yàn)室的免疫檢測(cè)自動(dòng)化奠定了基礎(chǔ)第三頁，共四十六頁，2022年，8月28日

待測(cè)物質(zhì)濃度與檢測(cè)手段

臨床化學(xué)分析10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析TherapeuticDrugsThyroidHormoneFertilityHormoneAllergyCancerMarkersInfectiousDiseaseVitaminsSerumProteins免疫分析技術(shù)第四頁，共四十六頁，2022年，8月28日放射免疫的創(chuàng)立1959美國Yalow&Berson1960英國Ekim’s1977獲諾貝爾醫(yī)學(xué)生物學(xué)獎(jiǎng)醫(yī)學(xué)生物學(xué)超微量分析的里程碑免疫分析技術(shù)第五頁，共四十六頁，2022年，8月28日放射免疫的精髓R：放射性核素示蹤高靈敏不直接探測(cè)待測(cè)物，而探測(cè)待測(cè)物上的標(biāo)記信號(hào)(標(biāo)記物的放大效應(yīng))RIAI：免疫學(xué)反應(yīng)高特異廢除以往沿用的無機(jī)或有機(jī)試劑，代之以抗體為結(jié)合劑免疫分析技術(shù)第六頁，共四十六頁，2022年，8月28日放射免疫面臨的挑戰(zhàn)半衰期短，限制了藥盒使用壽命由于標(biāo)記物的不斷變化，帶來藥盒批間、批內(nèi)較大的差異，標(biāo)準(zhǔn)曲線無法保存?zhèn)溆梅磻?yīng)時(shí)間過長(數(shù)小時(shí)至過夜)結(jié)果測(cè)量依靠時(shí)間累計(jì)，至少每一樣品一分鐘其主要的缺陷是：理論和實(shí)踐證明其分析的限度是10-7分子/mL或10-12g/mL，要再提高有困難以上原因都造成放射免疫無法進(jìn)行自動(dòng)化分析免疫分析技術(shù)第七頁，共四十六頁，2022年，8月28日新技術(shù)的挑戰(zhàn)放免其必然受到一代新的更靈敏、穩(wěn)定、快速，而且全自動(dòng)化的測(cè)量技術(shù)的挑戰(zhàn)。從90年代開始放免分析在國際上每年以10~15%的速度下降，這是事實(shí)。一些大型的實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)本量大的項(xiàng)目都已逐步應(yīng)用各種非放免標(biāo)記的自動(dòng)化設(shè)備來進(jìn)行分析，這是技術(shù)發(fā)展的必然規(guī)律。免疫分析技術(shù)第八頁，共四十六頁，2022年，8月28日標(biāo)記免疫方法免疫分析技術(shù)第九頁，共四十六頁，2022年，8月28日自動(dòng)標(biāo)記免疫分析的優(yōu)點(diǎn)一、消除手工操作的誤差二、靈敏度高、穩(wěn)定性好三、速度快四、當(dāng)天/隔天報(bào)告實(shí)現(xiàn)短時(shí)間反饋提高臨床診斷效率和質(zhì)量，有效降低總醫(yī)療費(fèi)用免疫分析技術(shù)第十頁，共四十六頁，2022年，8月28日乙型肝炎病毒乙肝的診斷主要以實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)乙肝表面抗原（HepatitisBSurfaceantigen,HBsAg）為主，檢測(cè)方法主要有酶免疫法、反向間接血凝法、放免法、化學(xué)發(fā)光法、免疫熒光法等，目前應(yīng)用較廣、較普及的是酶免疫一步法和化學(xué)發(fā)光定量法。HBsAg的酶免疫檢驗(yàn)方法根據(jù)反應(yīng)模式可分為“一步法”和“兩步法”兩種方法?！耙徊椒ā笔菍⒋郎y(cè)樣品和酶標(biāo)記抗體同時(shí)加人到反應(yīng)孔中進(jìn)行反應(yīng)，從而達(dá)到快速的目的，一步法”存在產(chǎn)生“前帶現(xiàn)象”的可能。第十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日定性？定量？定性測(cè)定常以“有”或“無”也即“陽性”或“陰性”來表達(dá)測(cè)定結(jié)果；半定量測(cè)定雖介于定性和定量之間，但從嚴(yán)格意義上來說，其仍屬于定性測(cè)定，只不過其對(duì)定性測(cè)定中的“陽性”作了進(jìn)一步的分級(jí)，即所謂的強(qiáng)陽性·陽性·弱陽性的區(qū)別定量測(cè)定的結(jié)果則以濃度（如IU/L、ug/L等〕的方式表達(dá)。乙肝病毒標(biāo)志物第十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日定性測(cè)定結(jié)果確定的依據(jù)定性測(cè)定結(jié)果確定的依據(jù)在于陽性陰性判定值（Cut-off）的建立，Cut-off值的確立應(yīng)盡可能地避免假陽性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。因此衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心也在應(yīng)用Cut-off值時(shí)引用了灰區(qū)概念以解決定性測(cè)定結(jié)果的可疑陽性問題。

乙肝病毒標(biāo)志物第十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日定性免疫測(cè)定的CUT-OFF值與灰區(qū)

SD1=0.019SD2=0.628乙肝病毒標(biāo)志物第十四頁，共四十六頁，2022年，8月28日可疑陽性處理原則重復(fù)測(cè)定：同樣方法復(fù)做一次確認(rèn)試驗(yàn)：中和試驗(yàn)：HBsAg

重組免印跡（RIBA）：HCV-Ab

蛋白印跡（WB）:HIV-Ab結(jié)合臨床或跟蹤隨訪乙肝病毒標(biāo)志物第十五頁，共四十六頁，2022年，8月28日定量測(cè)定結(jié)果的依據(jù)系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的劑量反應(yīng)曲線，即通常所謂的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于定量酶免疫測(cè)定中的劑量反應(yīng)曲線與生化測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，一般均為非線性的，變異較大，故不宜稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同的數(shù)學(xué)模式可用來改善上述劑量反應(yīng)曲線繪制的精密度，從而能以較少的數(shù)據(jù)和計(jì)算獲得較為準(zhǔn)確的結(jié)果乙肝病毒標(biāo)志物第十六頁，共四十六頁，2022年，8月28日定性測(cè)定與定量測(cè)定分別定性測(cè)定定量測(cè)定結(jié)果報(bào)告結(jié)果判定測(cè)定方法的變異系數(shù)（CV%）臨床意義陽性/陰性臨界值Cutoff（CO）>CO陽性<CO陰性15％－20％診斷濃度：g/L(ng/mL)U/L(mU/mL)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算<7%診斷、病情、治療監(jiān)測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物第十七頁，共四十六頁，2022年，8月28日Elecsys與酶免法的主要區(qū)別檢測(cè)靈敏度

ElecsysHBsAg:0.09ng/ml對(duì)酶免法(0.5~50ng/ml)，因此酶免法有較高的陽性漏檢率，尤其對(duì)于早期患者；

ElecsysHBsAg不存在灰區(qū)，減少重測(cè)，結(jié)果更可靠。結(jié)果的精密度

5%CV值與20%CV值的差別,酶免法結(jié)果可靠性差。出結(jié)果時(shí)間

來樣本即檢測(cè)出結(jié)果(18分鐘-27分鐘)與集中標(biāo)本檢測(cè)后出結(jié)果（3~4小時(shí)）報(bào)告的分別。酶免法與國際標(biāo)準(zhǔn)值未接軌乙肝病毒標(biāo)志物第十八頁，共四十六頁，2022年，8月28日丙型肝炎的實(shí)驗(yàn)室診斷丙型肝炎(HepatitisC，HC)是丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus，HCV)引起的世界范圍內(nèi)流行、且嚴(yán)重危害人們身心健康的傳染病之一,尤其在亞洲、非洲等一些發(fā)展中國家,流行率、發(fā)病率均較高。臨床特點(diǎn)：感染者中50-85％發(fā)展成慢性或持續(xù)感染、進(jìn)而部分發(fā)展成肝硬化和肝癌。

因此，早期診斷仍是防止傳播的有效手段。第十九頁，共四十六頁，2022年，8月28日丙肝病毒抗體第二十頁，共四十六頁，2022年，8月28日丙肝病毒抗體第二十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日一、抗-HCVIgG檢測(cè)

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)?zāi)瘜?shí)驗(yàn)放射免疫實(shí)驗(yàn)快速檢測(cè)技術(shù)其它檢測(cè)技術(shù)：免疫熒光、化學(xué)發(fā)光等

補(bǔ)充/確認(rèn)實(shí)驗(yàn):重組免疫印跡(RIBA)

丙肝病毒抗體第二十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)

檢測(cè)原理：利用固定在固相載體上的HCV重組表達(dá)和/或人工合成多肽抗原捕捉待測(cè)樣品中的抗-HCVIgG,然后,通過加入酶(如HRP、ALP等)標(biāo)記的抗-人IgG檢測(cè)所捕捉到的特異性抗-HCVIgG。丙肝病毒抗體第二十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日HCV不能體外培養(yǎng),大量HCV天然抗原幾乎得不到.目前主要用基因工程表達(dá)和多肽合成方法得到。用什么區(qū)段的丙肝病毒抗原蛋白？如何選擇各種抗原合適的比例？是保證HCV試劑測(cè)出樣品中所有的抗-HCV抗體的關(guān)鍵。包被抗原的選擇丙肝病毒抗體第二十四頁，共四十六頁，2022年，8月28日抗體臨床意義CHCV感染后出現(xiàn)較早,陽性率也很高,在抗-HCV檢測(cè)中發(fā)揮重要作用NS3抗原的免疫原性很強(qiáng),相應(yīng)的抗體滴度也很高,HCV感染后出現(xiàn)很早,同C區(qū)抗體一樣在抗-HCV的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用NS4HCV感染后出現(xiàn)延遲,持續(xù)陽性可能與慢性化有關(guān)NS5HCV感染后出現(xiàn)較早,可用于急性期感染的診斷HCV各片段抗體檢出的臨床意義丙肝病毒抗體第二十五頁，共四十六頁，2022年，8月28日第一代抗-HCV檢測(cè)系統(tǒng)cDNA克隆5-1-1：1989年5月,美國Chiron公司分離到一個(gè)能表達(dá)NANB肝炎病毒特異性蛋白的cDNA克隆5-1-1。C100-3：又將3個(gè)與5-1-1有共同的重疊克隆連接起來建立了另一個(gè)克隆C100(部分NS3和NS4區(qū)重組表達(dá)抗原)；

HCV

C100-3抗體檢測(cè)系統(tǒng),是最早的檢測(cè)方法.丙肝病毒抗體第二十六頁，共四十六頁，2022年，8月28日

主要缺陷是：靈敏度低,漏檢率較高：C100只含363個(gè)氨基酸,只代表整個(gè)HCV抗原抗體系統(tǒng)的一小部分；抗體檢出時(shí)間較晚：不適于早期診斷。非特異性反應(yīng)較高：使用的抗原含SOD融合蛋白,因此,當(dāng)人體存有抗-SOD時(shí)常常出現(xiàn)假陽性。丙肝病毒抗體第二十七頁，共四十六頁，2022年，8月28日第二代抗-HCV檢測(cè)系統(tǒng)C區(qū)較E區(qū)和某些非結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白都保守,用C區(qū)基因產(chǎn)物檢測(cè)HCV抗體顯得更加合理;第二代試劑除上述C100抗原外又加上了HCV核心區(qū)多肽C22-3和非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原C33C。較第一代試劑檢出率提高25-30%,抗體出現(xiàn)提早到16-60天。丙肝病毒抗體第二十八頁，共四十六頁，2022年，8月28日

不足：由于重組基因多肽抗原中仍有SOD多肽,所以仍存在抗-SOD造成的假陽性問題,于是激發(fā)人們建立人工合成肽段檢測(cè)抗-HCV的新試劑。丙肝病毒抗體第二十九頁，共四十六頁，2022年，8月28日第三代抗-HCV檢測(cè)系統(tǒng)核心區(qū)抗原比例相對(duì)下降,而相應(yīng)也增加了NS3區(qū)C33C的比例,優(yōu)化了試劑盒的組裝工藝；利用現(xiàn)代基因重組技術(shù),對(duì)一些重要抗原采用更好的表達(dá)、純化系統(tǒng),利用先進(jìn)的生產(chǎn)工藝、使包被抗原的活性更強(qiáng),增加了檢測(cè)的靈敏度,減少了非特異性反應(yīng)；加入了NS5區(qū)抗原。丙肝病毒抗體第三十頁，共四十六頁，2022年，8月28日目前我國多采用第三代抗-HCVELISA試劑,其敏感性超過99%,雖然目前缺乏判斷其敏感性的金標(biāo)準(zhǔn),但對(duì)于免疫功能正常的HCVRNA陽性感染者,抗-HCV檢出率也高于99%。

丙肝病毒抗體第三十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日補(bǔ)充/確認(rèn)實(shí)驗(yàn):重組免疫印跡(RIBA)

檢測(cè)原理：以待測(cè)血清中的HCV抗體和分別固定在硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜、尼龍膜等載體上的不同HCV抗原之間的特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ),測(cè)定待測(cè)樣品中抗-HCV的存在和有無。丙肝病毒抗體第三十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日因?yàn)镠CV的各種抗原分別被單獨(dú)固化在載體的不同位置上,因此,該項(xiàng)檢測(cè)可以區(qū)分待測(cè)樣品對(duì)HCV不同抗原的不同反應(yīng)。目前RIBAHCV已經(jīng)得到FDA的認(rèn)可,成為抗-HCV確認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。臨床意義：RIBA陽性的患者中75-80%為病毒血癥(HCVRNA);RIBA陽性而血清中沒有HCVRNA時(shí)提示可能為既往感染。丙肝病毒抗體第三十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日

實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)PCR檢測(cè)原理：在PCR擴(kuò)增反應(yīng)管內(nèi)加入了標(biāo)記有兩種染料的針對(duì)靶序列的探針,每當(dāng)一次擴(kuò)增反應(yīng)中一條探針與靶序列退火結(jié)合后,整個(gè)反應(yīng)體系就會(huì)增加一個(gè)單位的熒光.從而得出每一次擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后產(chǎn)物的量.丙肝病毒抗體第三十四頁，共四十六頁，2022年，8月28日

臨床意義：特異性強(qiáng)：抗-HCV陽性并不能代表現(xiàn)癥感染,丙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)是HCV-RNA.敏感性高：可發(fā)現(xiàn)抗-HCV陰性者HCV感染.陽性出現(xiàn)早：在“窗口期”沒有抗-HCV產(chǎn)生,但可檢測(cè)出RNA.

可指導(dǎo)用藥：為療效觀察及預(yù)后判斷提供指標(biāo).丙肝病毒抗體第三十五頁，共四十六頁，2022年，8月28日

與HBVDNA相比，HCVRNA檢測(cè)更為復(fù)雜和困難,檢出率低:血清中病毒含量低,且有一定波動(dòng),呈間歇陽性;易被RNA酶降解;HCVRNA受進(jìn)食的影響,HCV易與血中脂質(zhì)及脂蛋白結(jié)合,致使其檢出率降低;二次PCR,其中任何步驟的問題均易影響其檢出。丙肝病毒抗體第三十六頁，共四十六頁，2022年，8月28日應(yīng)用EIAS/CO比值報(bào)告抗-HCV結(jié)果試劑Ortho3.0華大吉比愛金偉凱華美科化英科新創(chuàng)萬泰S/CO比值≥

3.8≥7.0≥10.0≥6.0≥10.0≥8.6≥10.0陽性預(yù)測(cè)值≥

96.1%≥96.1%≥96.1%≥97.3%≥96.0%≥96.1%≥96.0%任芙蓉,等.中華肝臟病雜志,2005,13:255-258丙肝病毒抗體第三十七頁，共四十六頁，2022年，8月28日

抗-HCV篩查檢測(cè)報(bào)告陰性或根據(jù)S/Co比值判定為陽性所有陽性結(jié)果高S/Co比值陽性*報(bào)告低S/Co比值陽性*RIBAHCV檢測(cè)或陽性報(bào)告陰性報(bào)告不確定報(bào)告陽性陰性RIBAHCV檢測(cè)HCVRNA的檢測(cè)陽性報(bào)告陰性報(bào)告不確定報(bào)告報(bào)告*以S/Co3.8(OCDHCVELISA3.0)或8.0(OCDVITROSECi/ECiQHCV)為“界值”。CDC抗-HCV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果報(bào)告導(dǎo)則丙肝病毒抗體第三十八頁，共四十六頁，2022年，8月28日ANAENA測(cè)定目前臨床應(yīng)用檢測(cè)自身抗體的主要免疫學(xué)試驗(yàn)技術(shù)種類有：間接免疫熒光法（indirectimmunefluorescence,IIF）、直接免疫熒光法(IF)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫印跡技術(shù)、乳膠顆粒凝集、免疫擴(kuò)散、免疫電泳、放射免疫檢驗(yàn)和酶免疫細(xì)胞化學(xué)等。其中，IIF法、免疫印跡法和ELISA法被廣泛用于臨床檢測(cè)直接抗細(xì)胞成份和可溶性細(xì)胞成份抗體的檢測(cè)。有時(shí)為了彌補(bǔ)試驗(yàn)技術(shù)或試劑中可能存在的缺陷以及試驗(yàn)條件的影響，提高試驗(yàn)結(jié)果的特異性和敏感性，也用一種方法檢測(cè)多種自身抗體，或一種自身抗體用多種試驗(yàn)方法檢測(cè)。第三十九頁，共四十六頁，2022年，8月28日ANA.ENA-Abs第四十頁，共四十六頁，2022年，8月28日歐蒙斑點(diǎn)法(EuROAssAY)

實(shí)驗(yàn)原理

·

將膜條上平行包被數(shù)種純化的、已鑒定生化特性的抗原線作為固相。象固定生物薄片一樣將膜條固定在載片的反應(yīng)區(qū)?！?/p>

若是陽性，已稀釋血清中的特異性抗體將與固相上的抗原結(jié)合?！?/p>

第二步，堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的抗人抗體與已結(jié)合的抗體反應(yīng)?！?/p>

第三步，加入可產(chǎn)生顏色反應(yīng)的色原／底物溶液溫育。若標(biāo)本中含有待測(cè)的特異性抗體，相應(yīng)的抗原條帶將呈現(xiàn)較深的顏色。ANA.ENA-Abs第四十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日結(jié)果判斷簡單，可靠·

不需特殊儀器，肉眼判斷結(jié)果·

由于把抗原包被在固定的位置判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果比免疫印跡法簡單，更適合常規(guī)檢測(cè)·

反應(yīng)區(qū)的質(zhì)控帶呈顯較深的顏色反應(yīng)說明操作正確。·

陰陽性結(jié)果差別明顯。條帶顯色的深淺與抗體滴度相關(guān)?！?/p>

抗原經(jīng)親和層析分離純化。膜條上沒有多余蛋白，不會(huì)產(chǎn)生非特異性反應(yīng)?！?/p>

反應(yīng)過的載片可長期保存，試驗(yàn)結(jié)果容易存檔。ENA多肽抗體譜（歐蒙斑點(diǎn)法）ANA.ENA-Abs第四十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日ENA多肽抗體譜（免疫印跡法）ANA.ENA-Abs第四十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日需注意問題

(1)同一批號(hào)NC膜與同一批號(hào)標(biāo)準(zhǔn)帶相比：了解了NC膜制備可知只有同一批號(hào)才有比較價(jià)值，因在一次電泳中各種ENA抗原泳動(dòng)位置相同，不同批號(hào)時(shí)因每每電泳條件不可能完全一致而沒有可比性；電泳中蛋白質(zhì)遷移率衡定，各種蛋白質(zhì)先后順序衡定，但各蛋白質(zhì)之間距離