葉綠體、線粒體的提取

泡桐葉綠體和線粒體的提取與分離、試驗(yàn)?zāi)康模?、 將泡桐葉片中的葉綠體和線粒體提取出來(lái)。2、 掌握植物葉片中葉綠體和線粒體提取與分離的基本技術(shù)。3、 學(xué)習(xí)蔗糖沉淀差速離心法和差速離心法提取線粒體的方法。二、 實(shí)驗(yàn)材料與儀器：實(shí)驗(yàn)材料：泡桐新鮮葉片。實(shí)驗(yàn)試劑：蒸餾水；液氮；緩沖液V(50mmol/LTris,，25mmol/LEDTA，1.25mol/LNaCl，10mmol/Lp-巰基乙醇，^=0.1%(W/V)BSA(牛血清蛋白)，甲=2%(W/V)CTAB,10g/LPVP,pH=8.0)；緩沖液B(Tris2HCl0.105mol/L,蔗糖0.15mol/L,EDTA0.1005mol/L,BSA0.11%,巰基乙醇0.11%,pH=7.15)；緩沖液C(Tris2HCl0.105mol/L,蔗糖0.13mol/L,MgCl20.101mol/L,pH7.15)；緩沖初(0.2mol/L蔗糖、0.3mol/L甘露醇、50mol/LTris2Cl、1mol/LEDTA、0.1%BSA、0.6%PVP、0.1%B2巰基乙醇,pH7.5)；緩沖液E(蔗糖0.3mol/L、50mol/LTris2Cl,pH7.5)；緩沖液F(50mol/LTris2Cl、0.3mol/L甘露醇、0.2mol/L蔗糖、0.1%BSA、0.6%PVP,pH=7.5)；紗布等。試驗(yàn)儀器：研缽，研磨棒；離心管(250ml)；高速冷凍離心機(jī)；移液槍；高速組織搗碎器等三、 試驗(yàn)步驟：1、葉綠體的提取與分離稱取新鮮泡桐葉片50?100g,,暗處理12小時(shí)，蒸餾水洗干凈在液氮中保存3h以上，以最快速度磨成粉末，然后用6層無(wú)菌紗布過(guò)濾，收集濾液，棄渣。將濾液分裝到250mL預(yù)冷的離心管中，4°C下200r/min離心5min,小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的離心管。再在4°C,1500r/min離心10min,小心抽去上清夜，保留綠色沉淀顆粒，避免光照(防止淀粉聚集)。沉淀中加100mL緩沖液A(10mmol/L巰基乙醇用前加入)，用無(wú)菌軟毛筆充分懸浮沉淀,4C下1500r/min離心6min,棄上清液。沉淀中加30mL緩沖液C,用無(wú)菌軟毛筆充分懸浮沉淀,4C下1500r/min離心6min,棄上清，沉淀為純化的葉綠體。2、線粒體的提取與分離2.1蔗糖沉淀差速離心法。稱取新鮮泡桐葉片50g左右，預(yù)先暗處理，按3mL/g加入研磨緩沖液B(Tris2HCl0.105mol/L,蔗糖0.15mol/L,EDTA0.1005mol/L,BSA0.11%,巰基乙醇0.11%,pH=7.15),用預(yù)冷的高速組織搗碎器搗碎至糊狀，尼龍紗布過(guò)濾，收集濾液。濾液于1200r/min,4°。離心15min。收集上清液后，再于4C,16000r/min離心20min。加少量的預(yù)冷的懸浮緩沖液C(Tris2HCl0.105mol/L,蔗糖0.13mol/L,MgCl20.101mol/L,pH7.15),用毛筆輕攪沉淀。補(bǔ)加懸浮緩沖液至1/5體積,4C,1200r/min離心15min。取上清液至另一離心管，16000r/min離心20min,用2mL懸浮緩沖液懸浮沉淀，按25Lg/g鮮樣加入DNaseI,冰浴2h以去除核基因組DNA。加入EDTA#Na2,終濃度0.12mol/L,終止反應(yīng)。配制蔗糖梯度溶液，按由高到低的順序?qū)⒄崽侨芤?0%(330^L),52%(830^L),36%(1mL),20%(830^L),依次鋪入6個(gè)5mL透明管中，室溫放置1h,然后將2mL粗制線粒體懸浮液平均鋪于斜面上。100000r/min,4C水平離心50min(BeckmanSW55)。收集分層于36%?52%界面的線粒體，置于冰上，小心滴加4倍體積的勻漿緩沖液(未加巰基乙醇和BSA)，混勻，16000r/min4C離心10min,沉淀即為純化的線粒體。2.2高鹽差速離心法(1)線粒體提取。稱取新鮮泡桐葉片50g左右，預(yù)先暗處理左右，加入3倍體積預(yù)冷的勻漿緩沖液D(0.2mol/L蔗糖、0.3mol/L甘露醇、50mol/LTris2Cl、1mol/LEDTA、0.1%BSA、0.6%PVP、0.1%8-巰基乙醇,pH7.5),將預(yù)冷的組織用高速勻漿搗碎機(jī)破碎組織，低速2次，每次5s,高速3次，每次8-10s;10min后加入2倍體積緩沖液E（蔗糖0.3mol/L、50mol/LTris2Cl,pH7.5）,靜置20min,經(jīng)4層紗布過(guò)濾，分裝于8個(gè)50mL無(wú)菌離心管中；取濾液以3000r/min和4000r/min各離心10min,以除去組織碎片和質(zhì)體；將上清液轉(zhuǎn)入新的無(wú)菌離心管中,13000r/min離心10min,棄上清，得到粗線粒體沉淀；在每管沉淀中加入緩沖液F（50mol/LTris2Cl、0.3mol/L甘露醇、0.2mol/L蔗糖、0.1%BSA、0.6%PVP,pH=7.5）,用毛筆輕刷沉淀使之充分懸浮后收集至50mL無(wú)菌離心管內(nèi)。（2）線粒體純化。懸浮液4000r/min離心10min,上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中,加入Dnase至終濃度25Lg/g,同時(shí)加入終濃度為0.01mol/L的MgCl2,冰上反應(yīng)2h。在冰浴液中加入EDTA至終濃度20mol/L,終止DNaseN反應(yīng)；將此溶液小心置于20mL0.6mol/L蔗糖介質(zhì)上（0.3mol/L甘露醇、50mol/LTris2Cl、0.6mol/L蔗糖,pH7.5）,13000r/min離心10min。棄上清，沉淀中加入0.1mL/g的緩沖液C,輕輕懸浮均勻，再次將此溶液小心置于20mL0.6mol/L蔗糖介質(zhì)上,13000r/min離心20m