第7章 生物傳感器

第7章生物傳感器§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)§7-3酶?jìng)鞲衅魃镝t(yī)學(xué)傳感器上節(jié)內(nèi)容回顧§7-2Slide2被測(cè)物質(zhì)生物敏感膜生物學(xué)反應(yīng)信息敏感元件電信號(hào)二次儀表第7章生物傳感器生物傳感器的基本組成被測(cè)物質(zhì)生物敏感膜生物學(xué)反應(yīng)信息敏感元件電信號(hào)二次儀表生物學(xué)反應(yīng)：酶促反應(yīng)免疫學(xué)反應(yīng)微生物反應(yīng)受體配體結(jié)合反應(yīng)生物學(xué)反應(yīng)信息：離子變化質(zhì)子變化氣體分壓變化……傳感器元件：離子選擇性電極場(chǎng)效應(yīng)晶體管熱敏元件……§7-3第7章生物傳感器Slide3

酶?jìng)鞲衅魑⑸锖徒M織及細(xì)胞傳感器免疫傳感器傳感器§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)7-2-1生物敏感膜

生物傳感器的最關(guān)鍵部分；載有生物活性物質(zhì)的膜層；

生物活性物質(zhì)：迅速識(shí)別被測(cè)物質(zhì)并與之發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；具有高特異性和敏感性。

膜材料：天然，人工

第7章生物傳感器圖7.2.1生物敏感膜示意圖Slide4表7.2.1生物傳感器的生物敏感膜及其生物活性材料生物敏感膜生物活性材料酶膜各種酶類全細(xì)胞膜細(xì)菌，真菌，動(dòng)植物細(xì)胞組織膜動(dòng)植物組織切片細(xì)胞器膜線粒體，葉綠素免疫功能膜抗體，抗原，酶標(biāo)抗原§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-1生物敏感膜按照生物活性材料的不同，生物敏感膜可包括:Slide51.基于生物催化反應(yīng)的生物敏感膜2.基于生物吸附的生物敏感膜3.基于天然生物膜和人工生物膜的生物敏感膜按照其分子識(shí)別原理，生物敏感膜可包括:§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-1生物敏感膜Slide6基于敏感膜中的特定酶與底物反應(yīng)；在接觸生物物質(zhì)或有機(jī)物質(zhì)后，發(fā)生催化反應(yīng)；生成的化學(xué)產(chǎn)物，其中一種產(chǎn)物可有傳感器元件所感知。1.基于生物催化反應(yīng)的生物敏感膜§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-1生物敏感膜圖7.2.2基于生物催化反應(yīng)的生物敏感膜示意圖Slide7基于生物親和性物質(zhì)（抗體-抗原，DNA-RNA等）；一方固定在膜上作為分子識(shí)別元件；特異性反應(yīng)引起膜電位變化。2.基于生物吸附的生物敏感膜§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-1生物敏感膜圖7.2.3基于生物吸附的生物敏感膜示意圖Slide8直接利用具有生物活性的天然生物膜或人工生物膜；3.基于天然生物膜和人工生物膜的生物敏感膜§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-1生物敏感膜Slide9圖7.2.4天然生物膜和人工脂質(zhì)雙分子膜生物敏感膜需要滿足哪些性能？§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

生物敏感膜必須滿足一定的性能，才能夠達(dá)到實(shí)用的目的。穩(wěn)定性；可重復(fù)使用；能直接進(jìn)行底物分析；操作簡(jiǎn)單；使用方便。生物敏感膜的制備技術(shù)——固定化技術(shù)怎樣才能夠使得生物敏感膜滿足以上特點(diǎn)？Slide10生物敏感膜制備的固定化技術(shù)生物活性物質(zhì)載體生物敏感膜固定化技術(shù)§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-2固定化技術(shù)酶，輔酶，抗原，抗體，微生物菌體，激素，抑制劑，各種細(xì)胞器。丙烯酰胺系聚合物，甲基丙烯系聚合物，苯乙烯系聚合物，膠原，右旋糖酐，瓊脂糖，纖維素，淀粉等天然高分子以及玻璃，礬土，不銹鋼等無(wú)機(jī)物。Slide11例：酶的固定化方法固定化酶的制備方法、制備材料多種多樣，不同的制備方法和材料，固定化后酶的特性不同。對(duì)于特定的目標(biāo)酶，要根據(jù)酶自身的性質(zhì)、應(yīng)用目的、應(yīng)用環(huán)境來(lái)選擇固定化載體和方法。具體包括：夾心法吸附法包埋法共價(jià)連接法交聯(lián)法§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-2固定化技術(shù)圖7.2.4酶的固定化方法7-2-2固定化技術(shù)Slide12（a）夾心法制備方法：將生物活性材料封閉在雙層濾膜之間優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單；不需要任何化學(xué)處理；固定生物量大；響應(yīng)速度快；重現(xiàn)性好。缺點(diǎn)：穩(wěn)定性較差（酶膜）。適用范圍：微生物和組織膜?！?-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-2固定化技術(shù)圖7.2.5夾心法示意圖Slide13（b）吸附法§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-2固定化技術(shù)制備方法：通過(guò)非水溶性載體的物理吸附或離子結(jié)合，使蛋白分子固定。優(yōu)點(diǎn)：不需要化學(xué)試劑；對(duì)酶活性影響小。缺點(diǎn)：分子易脫落。固常與其他方法結(jié)合使用，如吸附交聯(lián)法。適用范圍：酶膜和免疫分子膜的制作。圖7.2.6吸附法示意圖Slide14（c）共價(jià)連接法§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-2固定化技術(shù)制備方法：酶分子通過(guò)共價(jià)鍵與不溶性載體結(jié)合而固定。優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合牢固，蛋白質(zhì)不易脫落；載體不易被生物降解；

使用壽命長(zhǎng)。缺點(diǎn)：操作繁瑣，酶活性受影響。圖7.2.7共價(jià)連接法示意圖Slide15（c）共價(jià)連接法§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-2固定化技術(shù)酶蛋白上可供載體結(jié)合的功能基團(tuán)有以下幾種：（1）酶蛋白N末端的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基。（2）酶蛋白C末端的α-羧基、天門冬氨酸殘基的β-羧基以及谷氨酸殘基的γ-羧基。（3）半胱氨酸殘基的巰基。（4）絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的羥基。（5）組氨酸殘基的咪唑基。（6）色氨酸殘基的吲哚基。（7）苯丙氨酸和酪氨酸殘基的苯環(huán)。Slide16必須注意，參加共價(jià)結(jié)合的氨基酸殘基應(yīng)當(dāng)是酶催化活性非必需基團(tuán)，如若共價(jià)結(jié)合包括了酶活性中心有關(guān)的基團(tuán)，會(huì)導(dǎo)致酶的活力損失。（d）包埋法§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-2固定化技術(shù)制備方法：將酶分子或細(xì)胞包埋并固定在高分子聚合物三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基質(zhì)中。優(yōu)點(diǎn)：一般不產(chǎn)生化學(xué)修飾，對(duì)分子活性影響?。?/p>

膜的孔徑和形狀可以任意控制；

被包埋物不易滲漏；

底物分子可在膜中任意擴(kuò)散。缺點(diǎn)：分子量大的底物擴(kuò)散困難。圖7.2.8包埋法示意圖Slide17（e）交聯(lián)法§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-2固定化技術(shù)制備方法：依靠雙功能試劑在分子間形成交聯(lián)而聚成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單；

結(jié)合牢固。缺點(diǎn)：固定化時(shí)需嚴(yán)格控制pH，交聯(lián)劑濃度，否則會(huì)使蛋白質(zhì)中毒，酶分子會(huì)部分失活。圖7.2.9交聯(lián)法示意圖Slide18吸附法包埋法共價(jià)結(jié)合法交聯(lián)法物理吸附法離子吸附法制備易易較難難較難結(jié)合程度弱中等強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)活力回收率高，但酶易流失高高低中等再生可能可能不可能不可能不可能固定化成本低低低高中等底物專一性不變不變不變可變可變表7.2.2

各種固定化方法的比較§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-2固定化技術(shù)Slide19具體的例子讓我們打開(kāi)書(shū)295頁(yè)，看書(shū)上表7.3Slide20—

LB膜技術(shù)特點(diǎn)：低溫低壓下制成高密度、分子排列方向一致的單分子層或雙分子層超薄膜。典型的LB膜必須具有雙親性，即含有親水基和疏水基的化合物。制備方法如圖所示：§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-2固定化技術(shù)Slide21圖7.2.10LB膜成膜方法疏水表面的基片：向下插入水面§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-2固定化技術(shù)Slide22知識(shí)擴(kuò)展：固定化細(xì)胞§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-2固定化技術(shù)Slide23固定化死細(xì)胞——只利用其酶活性；固定化活細(xì)胞——經(jīng)固定化后，細(xì)胞仍保存活性，能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝，所以稱為固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。固定化活細(xì)胞與固定化酶相比有何優(yōu)越之處？都以酶的應(yīng)用為目的，其制備方法也基本相同。固定化活細(xì)胞的制備條件比固定化酶更要溫和，其制備方法主要有物理吸附法和包埋法兩種。固定化活細(xì)胞保持了酶的原始狀態(tài)，酶的穩(wěn)定性更高，對(duì)污染的抵抗力更強(qiáng)；通常采用微生物細(xì)胞，生長(zhǎng)力強(qiáng)，細(xì)胞多，反應(yīng)快。

以上僅舉了固定化酶、固定化細(xì)胞的例子；實(shí)際上，根據(jù)感受器的不同，可以將生物傳感器分成以下幾種類型：酶?jìng)鞲衅鳌潭ɑ?；微生物傳感器——固定化?xì)胞；免疫傳感器——固定化抗原/抗體；……Slide24§7-2生物敏感膜與固定化技術(shù)

7-2-2固定化技術(shù)下面我們從酶?jìng)鞲衅鏖_(kāi)始，進(jìn)一步為大家介紹上述生物傳感器。Slide25§7-3酶?jìng)鞲衅鳌?-3酶?jìng)鞲衅髅競(jìng)鞲衅鞯慕M成和工作原理：固定化酶膜：選擇性地“識(shí)別”被檢測(cè)的物質(zhì)，并且催化被“識(shí)別”出的物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；變換器：把這一催化反應(yīng)中底物或產(chǎn)物的變量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，進(jìn)而通過(guò)儀表顯示出來(lái)。圖7.3.1酶?jìng)鞲衅鞯墓ぷ髟鞸lide26酶電極：在基礎(chǔ)電極的敏感面上裝有固定化酶膜，當(dāng)電極插入待測(cè)溶液時(shí)，酶膜中的酶發(fā)生催化反應(yīng)產(chǎn)生電極活性物質(zhì)（如氧，過(guò)氧化氫，氨等），引起基礎(chǔ)電極電位變化，轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，由此測(cè)出該酶所催化的反應(yīng)中反應(yīng)物或反應(yīng)產(chǎn)物的濃度。根據(jù)酶電極的輸出信號(hào)方式，可有電流型和電位型兩類電極。電流型：由催化反應(yīng)有關(guān)物質(zhì)的電極反應(yīng)得到的電流來(lái)確定反映物質(zhì)濃度。如氧電極，燃料電池型電極，過(guò)氧化氫電極等。電位型：通過(guò)測(cè)量敏感膜電位來(lái)確定與催化反應(yīng)有關(guān)的各種離子濃度。如氨電極，二氧化碳電極，氫電極等?！?-3酶?jìng)鞲衅鞣磻?yīng)原理：

反應(yīng)過(guò)程：1．底物S由液相傳質(zhì)到傳感器表面2．底物S通過(guò)透析膜3．底物S在液相與酶層中進(jìn)行分配4．底物S在酶層中傳質(zhì)與反應(yīng)5．反應(yīng)產(chǎn)物粒子通過(guò)透析膜進(jìn)入基礎(chǔ)電極室6．反應(yīng)產(chǎn)物粒子在基礎(chǔ)電極上發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)7.3.1電流型生物傳感器基本原理Slide27§7-3酶?jìng)鞲衅魑覀円云咸烟莻鞲衅鳛槔瑏?lái)介紹電流型生物傳感器的基本原理。Slide28課本上例子（相同原理）：

極譜式氧電極（Clark氧電極）原理：§7-3酶?jìng)鞲衅鲗?shí)際應(yīng)用舉例：針狀酶電極傳感器Slide29§7-3酶?jìng)鞲衅魑覀冏⒁獾剑咸烟茄趸鸽姌O、乳酸酶電極等多數(shù)酶電極，其反應(yīng)式：其中，都需要分子氧參與氧化還原反應(yīng)。那么如果在缺氧，或氧分壓不斷變化的環(huán)境下怎么辦呢？§7-3酶?jìng)鞲衅鱏lide307.3.2介體酶電極——以介體（Mediator）取代O2/H2O2在酶反應(yīng)和電極間進(jìn)行電子傳遞。這種傳感器可以較好地解決前面所述的問(wèn)題，而且能降低工作電位，縮短響應(yīng)時(shí)間，提高酶電極的選擇性和重現(xiàn)性。以二茂鐵單羧酸（Fc）電極為例，介紹工作原理：Fc作為GOD的氧化劑，在酶反應(yīng)與電極過(guò)程間迅速傳遞電子。參考文獻(xiàn)：金利通等.羧酸二茂鐵為介體的生物傳感器的研究.華東師范大學(xué)學(xué)報(bào),

1995,2:60-64.§7-3酶?jìng)鞲衅鱏lide317.3.3酶敏FET意義：傳感器的微型化結(jié)構(gòu)：在pHISFET基礎(chǔ)上制備一層GOD膜。（pHISFET見(jiàn)書(shū)249頁(yè)）原理：1）反應(yīng)式：2）該反應(yīng)使酶膜中的pH下降；3）白蛋白膜為對(duì)葡萄糖不敏感的參考膜。優(yōu)點(diǎn)：僅需微量試液，目前已開(kāi)發(fā)出一種經(jīng)皮

血糖測(cè)試系統(tǒng)。通過(guò)一個(gè)吸引槽從皮膚

吸出微量經(jīng)皮浸出液，即可測(cè)量?！?-3酶?jìng)鞲衅鱏lide327.3.4光尋址電位傳感器（LightAddressablePotentiometricSensor，LAPS）光尋址電位傳感器（LAPS）的基本原理及其構(gòu)造類似于離子敏場(chǎng)效應(yīng)管（ISFET）。它們都是基于EIS（電解質(zhì)溶液-絕緣體-半導(dǎo)體）結(jié)構(gòu)的敏感器件。

原理：LAPS利用調(diào)制光從正面或背面對(duì)EIS結(jié)構(gòu)進(jìn)行光照尋址，通過(guò)檢測(cè)絕緣體表面不同光照部位的電勢(shì)變化而實(shí)現(xiàn)對(duì)溶液中特定離子的濃度的檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：1)通過(guò)光照LAPS的不同敏感部位，可實(shí)現(xiàn)多參數(shù)測(cè)量；2)穩(wěn)定性好；3)易于封裝；4)檢測(cè)時(shí)間短。半導(dǎo)體