第二章 病原致病基因

第二章

病原物致病基因的類(lèi)型

1決定親和性的基因

1.1編碼致病因子的基因：胞壁水解酶酶基因、毒素基因、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)合成有關(guān)酶的基因、編碼未知產(chǎn)物的基因。病原菌中還有正向調(diào)控寄主范圍的基因，將這些基因轉(zhuǎn)移到相關(guān)細(xì)菌中，可使受體菌擴(kuò)大寄主范圍，使原來(lái)的不親和互作變?yōu)橛H和互作，這在植物病原細(xì)菌的小種和致病變種中都有發(fā)現(xiàn)。

1.2克服寄主防衛(wèi)反應(yīng)的基因：目前已報(bào)道的有植物病原真菌對(duì)植保素解毒酶基因（pda）。

2決定不親和性的基因2.1無(wú)毒基因（avr）

無(wú)毒基因編碼特異性激發(fā)子與抗病基因產(chǎn)物受體互作。病原無(wú)毒基因編碼的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)有些是直接起激發(fā)子的作用，如番茄葉霉病菌的無(wú)毒基因avr9編碼63個(gè)AA的多肽。而有些是編碼激發(fā)子合成的酶，如番茄丁香假單胞菌的無(wú)毒基因avrD的產(chǎn)物是3.4×104u的蛋白，在合成激發(fā)子中具有酶的功能。

TMV的外殼蛋白在含有N’抗病基因的煙草中是過(guò)敏反應(yīng)的激發(fā)子；其avr表型決定因子可能是復(fù)制酶蛋白，有些植物病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白基因也具有無(wú)毒基因的功能（Padgettetal，1993）。2.2決定非寄主不親和性基因（寄主專(zhuān)化性基因）

目前，在植物病原細(xì)菌和真菌中都已分離到非寄主專(zhuān)化性的激發(fā)子。韋忠民（1993）證明梨火疫病菌hrpN的編碼蛋白（harpin）具有激發(fā)子功能，能誘導(dǎo)非寄主植物產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。第一節(jié)植物病毒的侵染過(guò)程

及其與致病相關(guān)基因1.植物病毒基因組特征以核酸為核心，外被外殼蛋白亞基形成的外殼,多不具包膜。外殼蛋白多為一種，偶爾兩種。如果外面具有包膜，則結(jié)構(gòu)蛋白往往比較復(fù)雜，如植物彈狀病毒有五種結(jié)構(gòu)蛋白；植物呼腸病毒含7種結(jié)構(gòu)蛋白。植物病毒核酸絕大多數(shù)為（+）ssRNA，少數(shù)為（-）ssRNA

、dsDNA（double-stranded）、ssDNA、dsRNA。（1）（+）ssRNA的植物病毒基因組主要包括4種類(lèi)型：?jiǎn)畏煮w基因組整套基因的遺傳信息儲(chǔ)藏在一條核酸分子中。例如TMV、PXV、PYV、TYMV、SBMV(南方菜豆花葉）等。兩分體基因組基因組分布在兩條核酸上，并被分別包裝在兩個(gè)顆粒中。如煙草環(huán)斑病毒(TRSV)、石竹環(huán)斑病毒(CRSV)和豇豆花葉病毒(CPMV)。三分體基因組整套基因組分布在3-4條核酸中，并分裝于三個(gè)病毒顆粒中。如CMV、AMV(苜蓿）、BMV（雀麥）和BSMV（大麥條紋），均有4條，其中RNA1包裝在一個(gè)顆粒中，RNA2包裝在另一顆粒中，RNA3+RNA4包裝于第三顆粒中。多組分病毒如絨煙斑駁病毒，離體內(nèi)含線(xiàn)狀和環(huán)狀兩種ssRNA，侵染性要求兩種同時(shí)存在。(2)ssDNA植物病毒最主要的為雙生病毒(Geminiviridae)，也稱(chēng)聯(lián)體病毒，是一類(lèi)廣泛發(fā)生在熱帶、亞熱帶地區(qū)植物上的,具有兩個(gè)單鏈DNA，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)衣殼，具有孿生顆粒蛋白的單鏈ssDNA植物病毒。

該科是植物病毒中惟一具有單鏈DNA的單分體或二分體基因組病毒。病毒包裹單分子或兩分子閉環(huán)狀ssDNA，每分子DNA長(zhǎng)2.5~3.0kb，總基因長(zhǎng)約2.5~5.2kb。病毒復(fù)制是經(jīng)一個(gè)雙鏈復(fù)制中間體，通過(guò)滾環(huán)復(fù)制，ssDNA合成起始于基因間隔區(qū)的一段保守序列TAATATT/AC，病毒基因雙向轉(zhuǎn)錄，在基因間隔區(qū)具有轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。大多數(shù)雙生病毒的增殖部位局限于植物韌皮部組織，在細(xì)胞核中形成病毒粒子聚集體。典型的雙生病毒為18~30nm，每個(gè)單鏈大小為2.5~3.0knt。根據(jù)基因組結(jié)構(gòu)、寄主范圍等,可分為玉米線(xiàn)條病毒屬(Mastrevirus)主要侵染禾本科、甜菜曲頂病毒屬(Curtovirus)、萊豆金黃花葉病毒屬，主要侵染雙子葉。玉米線(xiàn)條病毒屬和甜菜曲頂病毒屬的病毒成員由葉蟬傳播，持久性，但不經(jīng)卵傳染，有單組分基因組；萊豆金黃花葉病毒屬的病毒成員由粉虱傳播，含有雙組分基因組。

(3)

dsDNA病毒雙鏈環(huán)狀DNA，分子量5×106u，如花椰菜花葉病毒（CaMV)，。?？稍诩闹骷?xì)胞內(nèi)堆積，形成內(nèi)含體。(4)

dsRNA病毒基因組有10～12個(gè)片段，每段分子量0.8×106～2.6×106例如植物呼腸病毒、三葉草傷瘤病毒和水稻普通矮縮病。（5）（-）ssRNA病毒包括彈狀病毒科，如萵苣壞死黃花病毒、馬鈴薯黃矮病毒。該RNA鏈為非感染性的，沒(méi)有與核糖體的連接點(diǎn)，或者翻譯產(chǎn)物無(wú)意義。以其為模板產(chǎn)生互補(bǔ)的RNA，起信使RNA作用。2侵染過(guò)程及相關(guān)問(wèn)題（1）傷口侵入，表皮毛通常為侵染位點(diǎn)，外突原生質(zhì)連絲可能參與病毒侵入過(guò)程。（2）通過(guò)媒介或人工擦傷的細(xì)胞壁來(lái)感染（3）病毒侵入寄主細(xì)胞后，存在脫外殼過(guò)程，且脫外殼在細(xì)胞的不同地方完成。3病毒的復(fù)制病毒的復(fù)制是很復(fù)雜的問(wèn)題，不同于真核生物DNA復(fù)制程序。一般一種類(lèi)型的病毒復(fù)制以同樣的方式進(jìn)行。（1）ssRNA病毒RNA具有感染性，可起信使RNA的作用，能翻譯產(chǎn)生蛋白，包括復(fù)制酶。復(fù)制酶首先合成反平行的互補(bǔ)鏈，然后再優(yōu)先復(fù)制合成與原始鏈相同的RNA序列。（2）dsRNA病毒類(lèi)似于DNA基因組病毒，不同于單鏈RNA病毒，復(fù)制酶是病毒粒體的核心組成部分，把核酸上的基因復(fù)制成相應(yīng)的信使RNA，再翻譯成蛋白。同時(shí)模板RNA仍配對(duì)保持完整。（3）含DNA的病毒進(jìn)入核內(nèi)形成微染色體---轉(zhuǎn)錄成信使RNA-----進(jìn)入胞漿----翻譯成蛋白并反轉(zhuǎn)錄合成負(fù)鏈DNA,----合成正鏈DNA-----包裝形成病毒顆粒-----轉(zhuǎn)運(yùn)并傳播RNA病毒復(fù)制模型1.吸附；2.侵入；3.脫殼；4.初期翻譯RNA多聚酶，合成細(xì)胞代謝的抑制物；5.形成復(fù)制型；6.形成復(fù)制中間型；7.形成子代RNA；8.翻譯晚期蛋白質(zhì)(合成病毒蛋白質(zhì))；9.子代RNA與病毒蛋白質(zhì)裝配，形成成熟病毒；10.釋放(a→a′表示病毒感染后可見(jiàn)到細(xì)胞核的變形)

DNA病毒復(fù)制模型1.吸附；2.穿入；3.脫殼，脫出的DNA向核內(nèi)移動(dòng)；4.轉(zhuǎn)錄mRNA；5.轉(zhuǎn)錄“早期蛋白質(zhì)”；6.復(fù)制子代DNA，合成與轉(zhuǎn)錄晚期mRNA；7.帶有遺傳信息的晚期mRNA在細(xì)胞質(zhì)中移動(dòng)并翻譯病毒蛋白質(zhì)；8.合成的病毒蛋白質(zhì)向核內(nèi)移動(dòng)；9.病毒DNA和蛋白質(zhì)裝配形成成熟病毒粒子；10.細(xì)胞崩解，病毒釋放4病毒蛋白的合成通常是利用寄主核糖體系統(tǒng)，翻譯病毒專(zhuān)一的RNA（基因組或轉(zhuǎn)錄得到的信使RNA),并且基本上都是利用寄主細(xì)胞質(zhì)核糖體，受放線(xiàn)菌酮抑制。5病毒在植物中的移動(dòng)和積累(1)病毒的移動(dòng)通過(guò)胞間連絲在細(xì)胞間移動(dòng)，通過(guò)維管系統(tǒng)從不同組之間轉(zhuǎn)移，但與CP蛋白和運(yùn)動(dòng)蛋白有關(guān)。

(2)病毒的積累不同病毒在植物中可達(dá)的濃度極不相同，并且和寄主植物種類(lèi)、生長(zhǎng)階段、組織部位有關(guān)，同時(shí)受溫度等環(huán)境條件影響。病毒可以分散在細(xì)胞質(zhì)或者以多種形式聚集。例如各種內(nèi)含體主要是由病毒粒體組成。6植物病毒致病相關(guān)基因6.1外殼蛋白基因（coatproteingene）外殼蛋白對(duì)病毒RNA具有保護(hù)作用，防止病毒核酸被細(xì)胞內(nèi)酶降解。外殼蛋白不僅是病毒粒子的結(jié)構(gòu)亞基，同時(shí)協(xié)同介導(dǎo)病毒的長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)。會(huì)大大提高感染效率和發(fā)病程度。有時(shí)在非寄主植物和抗性寄主上起無(wú)毒基因作用。并且CP基因可介導(dǎo)植物抗病性。

R.Beachy(1986)首次將TMV的CP基因轉(zhuǎn)入煙草，培育出穩(wěn)定遺傳的抗病毒工程植物以來(lái)，已經(jīng)克隆了至少15個(gè)病毒組中30種病毒的CP基因，并成功轉(zhuǎn)化了20多種植物，其中一些植株已經(jīng)進(jìn)入田間試驗(yàn)。

CP基因的抗性機(jī)理：（1）抑制病毒脫殼。（2）干擾病毒的復(fù)制。（3）限制病毒粒子的擴(kuò)展與運(yùn)轉(zhuǎn)。（4）CP基因所表達(dá)的mRNA與侵入病毒RNA之間相互作用（RNA介導(dǎo)的病毒抗性）。存在的問(wèn)題（1）多表現(xiàn)為延遲發(fā)病和降低發(fā)病嚴(yán)重度，免疫類(lèi)型和高抗類(lèi)型較少。（2）具有潛在危險(xiǎn)性。6.2復(fù)制酶基因（replicasegene）

病毒編碼的復(fù)制酶蛋白存在多個(gè)保守序列，其中一個(gè)是存在于所有RNA聚合酶中的Gly-Asp-Asp（天門(mén)冬）三肽基元序列（GDDmotif）,對(duì)維持聚合酶活性必不可少。另一個(gè)保守序列是三磷酸核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NTPbindingdomain），在病毒復(fù)制時(shí)的解螺旋過(guò)程中起重要作用。

Zaitlinetal(1990)將TMV的54KD蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草并獲得抗性煙草后，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道了此類(lèi)由病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因介導(dǎo)的植物對(duì)病毒的抗性。復(fù)制酶介導(dǎo)抗性的特點(diǎn)：

（1）對(duì)完整病毒粒子和裸露病毒RNA均具有高度抗性。（2）抗性水平與整合到染色體上的基因拷貝數(shù)無(wú)關(guān)。（3）抗性持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，并對(duì)高溫（31℃）不敏感。

（4）具有明顯的株專(zhuān)化性?？剐詸C(jī)理：

（1）在蛋白質(zhì)水平上，復(fù)制酶蛋白在病毒的侵染過(guò)程中作為一種調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮正常功能，從而打破了病毒正鏈和負(fù)鏈復(fù)制的平衡或干擾了控制復(fù)制酶活性的反饋抑制途徑。

（2）在RNA水平上，轉(zhuǎn)錄出的mRNA與病毒的復(fù)制酶進(jìn)行了無(wú)效結(jié)合而抑制其正常功能，或者是mRNA誘導(dǎo)了植物的自然抗性。

缺損型復(fù)制酶基因也可以介導(dǎo)抗性。T.M.Andersonetal(1992)將TMVFny株系的RNA內(nèi)部缺失94個(gè)核苷酸后導(dǎo)入煙草，結(jié)果，缺失造成ORF的移碼，其翻譯產(chǎn)物只有完整的97KD蛋白的75％左右，但仍然表達(dá)對(duì)CMV的高度抗性。6.3運(yùn)動(dòng)蛋白基因（movementproteingene）病毒基因編碼的基因產(chǎn)物MP能與胞間連絲結(jié)合，使胞間連絲可以通過(guò)物質(zhì)的孔徑增大，以允許病毒粒子或基因組核酸進(jìn)入鄰近細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)病毒在細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)。

研究證明，完整的TMV的MP基因表達(dá)并不能介導(dǎo)抗性的產(chǎn)生。M.Lapidotetal(1993)&SIMalyshenkoetal（1993）將TMV的缺陷型MP（dMP）基因轉(zhuǎn)入煙草后能獲得抗TMV植株，進(jìn)一步研究表明，轉(zhuǎn)dMP基因的煙草不僅對(duì)TMV，還對(duì)其他病毒如CMV、BMV等具有不同程度的抗性。由此可見(jiàn)，各種病毒MP之間雖然缺乏同源性，但具有相同的功能。

抗性機(jī)制：由于缺陷型MP與野生型MP競(jìng)爭(zhēng)胞間連絲上的結(jié)合位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)的。6.4衛(wèi)星病毒（satelliteRNA）

某些病毒除基因組外，還伴有一些小片段RNA，它們本身并沒(méi)有編碼外殼蛋白的遺傳信息，稱(chēng)為衛(wèi)星RNA。攜帶衛(wèi)星RNA的病毒稱(chēng)為輔助病毒。迄今已報(bào)道有6組共26種植物病毒帶有衛(wèi)星RNA。

衛(wèi)星RNA對(duì)植物病毒的影響有3種表現(xiàn)：加重癥狀；無(wú)調(diào)節(jié)作用；減輕癥狀。1986年，Baulcombe等首次將CMV的satRNA克隆轉(zhuǎn)入煙草，獲得了抗CMV的基因工程植株。

衛(wèi)星RNA與病毒基因組爭(zhēng)奪病毒復(fù)制酶。由于衛(wèi)星RNA能更有效地占據(jù)RNA復(fù)制酶，而且其分子小、復(fù)制周期短，因此，隨著復(fù)制循環(huán)的增加，satRNA的復(fù)制量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于基因組RNA復(fù)制量，最終是病毒基因組的復(fù)制受阻。

雖然衛(wèi)星RNA只需低水平表達(dá)，不產(chǎn)生異源蛋白，但這種抗性?xún)H在侵染晚期發(fā)揮作用，而且轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)減輕癥狀的衛(wèi)星RNA有可能突變成加重癥狀的衛(wèi)星RNA，因此具有一定的潛在危險(xiǎn)性。6.5核酶基因（ribozymegene）

核酶是一類(lèi)具有特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)、能特異性催化切割自身及其它RNA分子的小分子RNA。廣泛存在于一些類(lèi)病毒和病毒衛(wèi)星RNA序列中。根據(jù)核酶的結(jié)構(gòu)可分為錘頭型和發(fā)夾型，其中錘頭型核酶較為普遍。人們可根據(jù)核酶可切割任何生物的RNA，而且對(duì)底物作用位點(diǎn)的堿基序列要求不嚴(yán)格這一特性，設(shè)計(jì)出切割已知序列的病原性RNA人工核酶。目前，人工核酶在植物抗病毒方面，也成功地在體外合成了能切割馬鈴薯紡錘塊莖類(lèi)病毒（PSTV）等的基因組RNA的核酶、能切割蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒的核酶等，但是，在轉(zhuǎn)基因植物水平上的進(jìn)展緩慢。體內(nèi)表達(dá)不如體外表達(dá)有效。

該方法也存在潛在危險(xiǎn)性，即核酶可能將細(xì)胞RNA作為靶RNA切割而破壞細(xì)胞正常功能。6.6蚜傳因子也稱(chēng)輔助因子(Helpercomponent,簡(jiǎn)稱(chēng)HC)：在蚜蟲(chóng)傳播的非持久病毒的寄主細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)有一種病毒編碼的蛋白（HC-Pro)與傳毒有關(guān)，如除去它，蚜蟲(chóng)也就失去傳毒能力，這種輔助因子被稱(chēng)為蚜傳因子。最早在馬鈴薯Y病毒侵然的植物中發(fā)現(xiàn)，具有協(xié)生作用，并幫助長(zhǎng)距離運(yùn)輸。但輔助因子的作用方式尚未完全明確。7.TMV基因組及其編碼蛋白的功能

煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）屬于煙草花葉病毒屬。該屬基因組編碼四種蛋白，大小分別為126kD、183kD、30kD和17.5kD.

其中126kD和183kD蛋白參與病毒的復(fù)制，稱(chēng)為RNA依賴(lài)的RNA聚合酶（RNAdependentRNApolymerase，RdRP）的亞基；183kD的蛋白是126kD蛋白的閱讀框終止子通讀的產(chǎn)物。30kD蛋白參與病毒在寄主細(xì)胞間的移動(dòng)，稱(chēng)為運(yùn)動(dòng)蛋白（Movementpro2tein，MP）。

17.5kD的蛋白為病毒的外殼蛋白（Capsidprotein，CP）。

3×1041.26×1051.83×1055.4×1041.75×104TMV基因組結(jié)構(gòu)示意圖5’運(yùn)動(dòng)蛋白3’CP蛋白復(fù)制酶涉及RNA復(fù)制7.1

126kD/183kD蛋白

煙草花葉病毒通過(guò)機(jī)械傷口或者借助媒介昆蟲(chóng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在病毒顆粒部分脫殼露出基因RNA的5′端時(shí)即侵染后1-10分鐘內(nèi)，翻譯開(kāi)始首先合成126KDa和183KDa的兩種蛋白質(zhì)。183KDa是由126KDa基通讀而產(chǎn)生，Tyr插在這個(gè)琥珀型終止子上，有6個(gè)保守的核苷酸。

兩種蛋白功能

煙草花葉病毒復(fù)制所需依賴(lài)RNA的聚合酶由兩部分組成：一是由寄主提供的亞基，一是由病毒編碼的特異的復(fù)制酶亞基組合成有專(zhuān)一性的全酶。[2]183KDa有RNA依賴(lài)的RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)，126KDa的C端有類(lèi)似于螺旋酶和甲基轉(zhuǎn)移酶的基本結(jié)構(gòu)。所以，這兩種蛋白質(zhì)在TMVRNA的復(fù)制過(guò)程中起重要的作用。

7.2運(yùn)動(dòng)蛋白（MP）運(yùn)動(dòng)蛋白（MP）是TMV的運(yùn)動(dòng)蛋白質(zhì)，在整個(gè)TMV的表達(dá)蛋白質(zhì)中比例很小。運(yùn)動(dòng)蛋白是在病毒復(fù)制過(guò)程中形成的。以TMV+RNA為模板的3′-端開(kāi)始復(fù)制合成全長(zhǎng)的（-）RNA，形成雙鏈，稱(chēng)復(fù)制型RNA（replicative，RF型）。在感病細(xì)胞與膜相連的病毒合成中除發(fā)現(xiàn)RF型外，也發(fā)現(xiàn)有以（—）RNA為模板同時(shí)合成多達(dá)5～6條的（+）RNA，稱(chēng)為復(fù)制中間型（replicativeintermediate，RI型）。這些（+）RNA的出路有三：一是被外殼蛋白包裝形成子代病毒顆粒；二是進(jìn)一步作為模板形成RF→RI；三是做mRNA，而1.5Kb和0.7kb分別翻譯為30KDa和外殼蛋白。運(yùn)動(dòng)蛋白的功能

煙草花葉病運(yùn)動(dòng)蛋白的基因全長(zhǎng)為807bp.TMV的運(yùn)動(dòng)蛋白（30KDa）與TMV在植株體內(nèi)擴(kuò)散密切相關(guān)，主要功能是介導(dǎo)TMV在臨近細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)（Cell-to-cellmovement），且MP的功能是高度保守的。研究表明MP定位于胞間連絲（Plasmodesma），可能與細(xì)胞骨架的某些因子形成一種核孔復(fù)合物，有利于轉(zhuǎn)運(yùn)TMV基因組通過(guò)植株的維管系統(tǒng)，侵染整個(gè)植株。而30KDa蛋白質(zhì)與新合成的子代病毒RNA結(jié)合產(chǎn)生有兩個(gè)重要影響：一是使TMA-RNA不折疊而成舒展的線(xiàn)性；二是使胞間連絲改變構(gòu)型，通道變寬，30KDa蛋白質(zhì)-RNA復(fù)制物可魚(yú)貫通過(guò)。因此，30KDa蛋白質(zhì)較早地以亞基因組形成被表達(dá)，有助于病毒在體內(nèi)的擴(kuò)展和增殖。

3外殼蛋白（CP）

TMV的外殼蛋白有156～161個(gè)氨基酸，共有2130個(gè)亞基，亞基右螺旋排列。外殼蛋白質(zhì)在侵染細(xì)胞中表達(dá)量是最大的，占整個(gè)細(xì)胞總蛋白質(zhì)的10%.復(fù)制過(guò)程種，形成的部分（+）RNAmRNA，而0.7kb翻譯為外殼蛋白。外殼蛋白對(duì)TMVRNA具有保護(hù)作用。外殼蛋白不僅是病毒粒子的結(jié)構(gòu)亞基，同時(shí)協(xié)同介導(dǎo)病毒的長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)。TMV在植物體內(nèi)的移動(dòng)必須以外殼蛋白聚集體的形成為前提。

8花椰菜花葉病毒（CaMV）基因組

病毒粒子為二十面體對(duì)稱(chēng)(T=7)，直徑為54nm，其外殼由420個(gè)蛋白亞基組成，該病毒在自然條件下通過(guò)蚜蟲(chóng)以非持久性方式進(jìn)行傳播，侵染十字花科植物，但不在蚜蟲(chóng)體內(nèi)增殖。

CaMV基因組dsDNA呈環(huán)狀，大小約為8kb，含有8個(gè)ORFs，其中Ⅰ－Ⅵ為主要ORFs，Ⅶ和Ⅷ為兩個(gè)附加ORFs，在Ⅵ和Ⅶ之間還有一個(gè)大的基因間隔區(qū)(intergenicregion)，雙鏈DNA上有3個(gè)缺刻，1個(gè)(△1)在負(fù)鏈(α鏈)上，另外2個(gè)(△2和△3)在正鏈(β1和β2鏈)上。除了第Ⅶ基因外，其余的7個(gè)基因相距很近，甚至有部分重疊(如下圖)。蚜傳因子外殼蛋白反轉(zhuǎn)錄酶內(nèi)含體蛋白與復(fù)制有關(guān)蛋白運(yùn)動(dòng)蛋白

(二)花椰菜花葉病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制

當(dāng)CaMV病毒粒子侵人細(xì)胞后，首先在細(xì)胞質(zhì)中脫去外殼，然后病毒基因組dsDNA進(jìn)人細(xì)胞核內(nèi)，并且在核內(nèi)其基因組dsDNA的重疊區(qū)核苷酸被去除，缺刻經(jīng)過(guò)共價(jià)結(jié)合形成完整的閉環(huán)dsDNA，這一閉環(huán)dsDNA再與寄主組蛋白結(jié)合生成一個(gè)微型染色體(minichromosome)，最后病毒微型染色體在宿主細(xì)胞RNA聚合酶的催化下，以一條負(fù)鏈DNA為模板轉(zhuǎn)錄生成2個(gè)多聚腺苷酸化的RNA分子，即35SRNA和19SRNA(如下圖)。9.黃瓜花葉病毒（CMV)病毒粒子為二十面體對(duì)稱(chēng)(T＝3)，直徑26nm，由180個(gè)外殼蛋白亞基構(gòu)成，在病毒懸液中，PH、二價(jià)陽(yáng)離子都會(huì)使病毒粒子的直徑和構(gòu)型產(chǎn)生可逆性的變化。BMV基因組有3個(gè)RNA組分，即RNA1(3.2kb)，RNA2(2.5kb)和RNA3(2.1kb)，每個(gè)RNA組分的5’端有帽子結(jié)構(gòu)，3’端有Trna樣結(jié)構(gòu)，并帶有假結(jié)(pseudoknot)，能接受酪氨酸(Tyr)。

RNA1編碼單一的蛋白質(zhì)，分子量為l09kD，位于N末端和C末端的氨基酸基序分別類(lèi)似于甲基轉(zhuǎn)移酶和解旋酶；

RNA2單一ORF翻譯合成94kD蛋白，蛋白產(chǎn)物有聚合酶樣的區(qū)域，這兩種蛋白質(zhì)與病毒基因組RNA復(fù)制密切相關(guān)；

RNA3有2個(gè)ORF，一個(gè)ORF編碼32kD蛋白，它影響病毒的宿主嗜親性和介導(dǎo)病毒在細(xì)胞之間運(yùn)動(dòng)，另一個(gè)ORF編碼20kD外殼蛋白。

第二節(jié)植物病原細(xì)菌的致病相關(guān)基因（一）植物細(xì)菌基因組的特點(diǎn)同于一般原核生物基因組，包括染色體基因組和質(zhì)?；蚪M兩部分。染色體是一個(gè)高度折疊的環(huán)狀DNA大分子，大小約為3×106～5×106bp，可攜帶500基因。游離于染色體的一定區(qū)域，沒(méi)有包膜包被。質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外基因組，也是環(huán)狀DNA分子，并能獨(dú)立復(fù)制。DNA分子量在106u～108u，所攜帶基因比染色體少。但一般每個(gè)細(xì)菌菌體內(nèi)包含1～多個(gè)質(zhì)粒。1基因克隆的策略和研究方法1.1基因克隆策略由里及表的研究途徑，創(chuàng)建突變體-通過(guò)基因標(biāo)記和互補(bǔ)法獲得基因，再推斷其產(chǎn)物，并證明其致病。（1）方法導(dǎo)向（2）概念導(dǎo)向（3）異源基因克隆法1.2突變誘變方法1.2.1物理誘變1.2.2化學(xué)誘變1.2.3轉(zhuǎn)座子誘變突變方法1.物理誘變紫外線(xiàn)（UV）、X射線(xiàn)和γ射線(xiàn)誘變；離子束誘變，離子束是元素的離子經(jīng)高能加速器加速后獲得的放射線(xiàn)；中子

2.化學(xué)誘變化學(xué)誘變劑：堿基類(lèi)似物、亞硝酸如亞硝基胍(NTG）、丫定橙染料、烷化劑如甲基磺酸乙脂（EMS）等3.轉(zhuǎn)座子插入突變野生型細(xì)菌的基因組文庫(kù)物理和化學(xué)誘變獲得的突變體兩親交配或三親交配進(jìn)行功能互補(bǔ)獲得能恢復(fù)突變體表型的陽(yáng)性克隆克隆片段的亞克隆分析和進(jìn)一步功能互補(bǔ)驗(yàn)證基因的克隆、測(cè)序和序列分析熱激或電激轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)座子插入突變轉(zhuǎn)座子誘變致病性測(cè)定，獲得致病性發(fā)生變化的突變體獲得相應(yīng)的突變體以轉(zhuǎn)座子的側(cè)端序列為探針進(jìn)行Southern雜交，確定轉(zhuǎn)座子插入的拷貝數(shù)，明確突變表型是由于轉(zhuǎn)座子的插入引起得突變體的遺傳穩(wěn)定性分析Fig.Structuralorganizationofthepgi(A)andhrpX(B)lociofX.

campestris

pv.citriandofplasmidsderivedtherefrom.(A)Restrictionmapofthegenomicregioncontainingpgishowingtheorientationofthegene(horizontalarrow)andthesiteoftransposoninsertioninthemutantXT906.(B)RestrictionmapofthegenomicregioncontaininghrpXshowingtheorientationofthegene(horizontalarrow)andthestructureoftheplasmidpUW10PGUS,whichcontainsanhrpX::gusfusiongene.

1.3基因文庫(kù)的構(gòu)建

將細(xì)菌的基因組切成許多片段，分別連到載體上，構(gòu)建一個(gè)能攜帶該菌所有基因信息的克隆庫(kù)。?

構(gòu)建基因文庫(kù)常用的載體有質(zhì)粒（plasmid）、黏粒（cosmid）和λ噬菌體(phaseλ)。適用于作基因克隆的質(zhì)粒載體必須具備3個(gè)共同的組成部分，即復(fù)制因子、選擇標(biāo)記和克隆位點(diǎn)。

?理想基因文庫(kù)應(yīng)具備的條件：（1）以一種穩(wěn)定的形式含有基因組DNA的序列。（2）克隆總數(shù)不宜過(guò)大。（3）文庫(kù)的克隆片段大小必須足夠包含一個(gè)完整的基因。（4）克隆片段大小適應(yīng)于載體的容納能力，便于進(jìn)行酶切圖譜分析。（5）應(yīng)從少量的起始材料進(jìn)行構(gòu)建并易于篩選理想的片段。（6）克隆片段之間需要有部分片段重疊以利于chromosomewalking。（7）克隆片段應(yīng)易于從載體上切下而不帶有任何載體序列。（8）文庫(kù)應(yīng)能在克隆不損失的情況下得到擴(kuò)增，而且能長(zhǎng)期保存。細(xì)菌文庫(kù)構(gòu)建常用載體1質(zhì)粒載體如PBR322PUC系列（2）噬菌體載體包括插入型和替代型兩種一般可容納15-23Kb的外源DNA片段（3）柯氏質(zhì)粒載體又稱(chēng)粘性質(zhì)粒（cosmid),是由λ噬菌體的cos片段和質(zhì)粒復(fù)制子組成。能自主復(fù)制，可容納大約45Kb的DNA片段。1.4基因克隆1.4.1轉(zhuǎn)座子表簽法1.4.2鳥(niǎo)槍法

在已獲得標(biāo)記基因突變體和基因文庫(kù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行，用基因庫(kù)互補(bǔ)突變體篩選使圖變體表型恢復(fù)的克隆。該克隆含有目的基因功能片段的序列，并將此克隆轉(zhuǎn)移到E.coli中得到純系克隆，在與突變體互補(bǔ)進(jìn)行驗(yàn)證。1.4.3基因功能互補(bǔ)法常用來(lái)克隆控制寄主范圍的基因如無(wú)毒基因。

1.5克隆片段的亞克隆分析2與病理過(guò)程有關(guān)的基因

植物病原菌的侵染過(guò)程一般包括趨化性、吸附、定植和侵入。已鑒定出土壤農(nóng)桿菌的一條染色體基因chvE與其細(xì)菌的趨化性有關(guān)，此外，該細(xì)菌染色體上的picA基因還影響細(xì)菌的聚集而與毒性有關(guān)。

A.Kelman等用轉(zhuǎn)座子誘變方法獲得了青枯假單胞菌類(lèi)似多型性表型轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象，并在分子水平上進(jìn)行了研究，該基因?yàn)閜hcA.2.1與病原菌侵染有關(guān)的基因

2.2決定顯癥的基因

植物病原細(xì)菌的癥狀類(lèi)型與其致病生化因子有密切關(guān)系。如細(xì)胞降解酶與組織浸離癥狀有關(guān)；產(chǎn)生壞死癥狀的病菌如丁香假單胞引起的各種葉斑病都涉及到毒素的作用；毒素和多糖還和植物萎蔫癥狀有關(guān)。有關(guān)這些基因的克隆、結(jié)構(gòu)鑒定和功能分析早已展開(kāi)并取得很大進(jìn)展。

?

黃單胞菌中一個(gè)800bp的opsX基因參與LPS的生物合成和修飾以及誘導(dǎo)水漬狀反應(yīng)；柑桔黃單胞的pthA基因是引起增生性潰瘍癥狀所必需的。D.W.Gabriel,etal(1995)2.3決定寄主范圍的基因2.3.1正向調(diào)控寄主范圍的基因根癌土壤桿菌（Agrobacterium

tumefaciens）青枯假單胞菌（Pseudomonassolanacearum）黃單胞菌水稻白葉枯枝病致病變種（X.Oxyzae

pv.oxyzae）2.3.2負(fù)向調(diào)控寄主范圍的基因

植物病原細(xì)菌的無(wú)毒基因是負(fù)向調(diào)控寄主范圍的基因，無(wú)毒基因直接產(chǎn)物或間接產(chǎn)物作為激發(fā)子與相應(yīng)抗病基因產(chǎn)物識(shí)別誘導(dǎo)寄主防衛(wèi)基因表達(dá)，從而表現(xiàn)小種－品種互作的不親和。無(wú)毒基因失活或缺乏相應(yīng)的無(wú)毒基因則表現(xiàn)小種－品種互作的親和反應(yīng)，所以無(wú)毒基因的作用是病原菌小種對(duì)不同品種的寄主范圍的負(fù)向調(diào)控基因。此外，負(fù)向調(diào)控寄主范圍的基因也可以表現(xiàn)在不同致病變種的致病能力上。植物病原細(xì)菌無(wú)毒基因的克隆

B.J.Staskawica

（1984）首先通過(guò)基因互補(bǔ)法從大豆丁香假單胞6號(hào)小種中篩選到一個(gè)具有無(wú)毒基因功能的克隆，Napoli（1987）將此基因命名為avrA。此后，已從丁香假單胞菌、甘藍(lán)黑腐黃單胞桿菌的不同變種和青枯假單胞中克隆到40多個(gè)無(wú)毒基因。無(wú)毒基因的表達(dá)和調(diào)控以P.syringae

pv.glycinea中avrB為代表，其不能在富加培養(yǎng)基上表達(dá)，但可以在基本培養(yǎng)基上表達(dá)。其表達(dá)水平依賴(lài)于碳源。在侵染期間，avrB在感病或抗病寄主上都能高水平表達(dá)，在非寄主植物上也能表達(dá)，說(shuō)明表達(dá)不受特異性植物因子調(diào)控。以X.campestris

pv.VesicatoriaavrBs3為代表，能在富加、基本培養(yǎng)基以及植物上組成性表達(dá)。這類(lèi)基因的表達(dá)不依賴(lài)于hrp基因簇，但無(wú)毒表型的出現(xiàn)需要有功能的hrp基因，可能是需要hrp基因編碼的無(wú)毒蛋白通道。無(wú)毒基因的生理功能

研究表明,許多植物病原細(xì)菌中存在著無(wú)毒基因的隱性同源序列,但這種同源序列已喪失了誘導(dǎo)過(guò)敏性壞死反應(yīng)的功能。說(shuō)明無(wú)毒基因除了有誘導(dǎo)過(guò)敏性壞死反應(yīng)的功能外，還有其自身的生理功能。

無(wú)毒基因是病原物遺傳因子，除誘導(dǎo)寄主植物（含抗性基因）產(chǎn)生過(guò)敏性壞死反應(yīng)外，還具有決定病原物致病性或適應(yīng)性的功能。無(wú)毒基因的概念是相對(duì)的，在一種病原物中起無(wú)毒基因作用而在另一種病原物中起致病作用。無(wú)毒基因與hrp基因互作

無(wú)毒基因通常在體外、腐生或非致病細(xì)菌中并不表達(dá)。因此，一般情況下無(wú)毒基因產(chǎn)物不足以在植物中誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)，必須依賴(lài)于一個(gè)具有完全功能的hrp基因介導(dǎo)的機(jī)制分泌。近年來(lái)的研究表明，作為效應(yīng)分子，無(wú)毒基因產(chǎn)物是通過(guò)hrp基因簇所編碼的Ⅲ型通道分泌系統(tǒng)運(yùn)送至細(xì)菌細(xì)胞外與寄主發(fā)生相互作用的。2.4決定病原菌致病性或毒性的基因2.4.1胞壁降解酶基因

◆果膠酶基因果膠酶是軟腐歐氏桿菌的重要致病因子，并在萎蔫性病害（P.solanacearum

）中也起作用，現(xiàn)已在至少5種病原細(xì)菌中克隆到果膠酶基因。除此之外，在青枯假單胞菌已鑒定出4種胞外酶基因。

◆

纖維素酶基因

◆

蛋白酶基因

編碼纖維素酶基因已在軟腐歐氏桿菌和青枯假單胞中得到克隆，其主要類(lèi)型都是內(nèi)聚葡聚糖酶基因。

在熒光假單胞（P.flouorescens）胞外酶對(duì)馬鈴薯塊組織的浸離作用研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白酶有軟化薯塊組織的浸離作用。王金生等（1984）研究表明，3中軟腐病菌產(chǎn)生的蛋白酶在離體條件下對(duì)馬鈴薯塊組織有較強(qiáng)的浸離力。目前已從軟腐歐氏桿菌中克隆了許多蛋白酶基因并對(duì)其產(chǎn)物特征進(jìn)行了研究，但這些基因在致病過(guò)程中的作用及其調(diào)控機(jī)理尚不清楚。2.4.2毒素基因

植物病原細(xì)菌的毒素一般是低分子量的非寄主專(zhuān)化性毒素。這一特征有利于對(duì)毒素進(jìn)行遺傳分析，又由于生物測(cè)定是可以敏感微生物代替寄主植物進(jìn)行生物測(cè)試，因此篩選程序簡(jiǎn)單、快速。目前已對(duì)4種丁香假單胞致病變種的毒素進(jìn)行了遺傳分析。

致病變種／毒素TOX菌株類(lèi)型毒性表現(xiàn)pv.tomato/coronatine

Tn5突變體僅產(chǎn)生小病斑，菌群增長(zhǎng)不大

pv.phaseolicola/phaseolotoxin

UV突變體菌群發(fā)育正常，但無(wú)癥狀出現(xiàn)pv.syringae/syringomycin

Tn5突變體在櫻桃上降低毒性或完全喪失毒性pv.tabaci/tabtoxin

自然突變體接種3d細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)與野生型不同2.4.3胞外多糖基因

研究證明，在青枯病菌、梨火疫病菌、玉米細(xì)菌性枯萎病菌和甘藍(lán)黑腐病菌等植物病原菌中胞外多糖與其致病性有關(guān)。2.4.4植物激素基因

致病細(xì)菌誘導(dǎo)植物組織過(guò)度生長(zhǎng)是由于細(xì)菌產(chǎn)生植物激素的作用。這些激素的遺傳決定因子在油橄欖癌腫病假單胞菌和根癌土壤桿菌中已有詳細(xì)研究。2.4.5hrp

基因

（hypersensitivereactionandpathogenicitygene)是決定病原菌對(duì)寄主植物致病性和誘導(dǎo)非寄主植物過(guò)敏反應(yīng)的基因

?Hrp基因的鑒定

P.B.Lindgren(1986)用轉(zhuǎn)座子Tn5對(duì)菜豆暈斑病菌（P.syringae

pv.phaseolicola）進(jìn)行隨機(jī)插入誘變，篩選出6個(gè)突變體，它們既失去在感病菜豆品種上的致病性，同時(shí)也不再引起非寄主植物如番茄、大豆、煙草和豇豆的過(guò)敏性壞死反應(yīng)。Southern雜交和標(biāo)記交換分析證明，這些突變體表型改變是由于單個(gè)Tn5插入的結(jié)果。從野生型基因文庫(kù)中篩選到一個(gè)黏粒pPL6，可以恢復(fù)所有6個(gè)突變體的hrp突變表型，說(shuō)明該黏粒上帶有hrp基因，且hrp基因是由多個(gè)基因組成的基因簇。?

Hrp基因的結(jié)構(gòu)和功能保守性

以P.s.pv.syringae的hrp基因?yàn)樘结樑c該病原的其他8個(gè)致病變種的基因組DNA進(jìn)行雜交，結(jié)果都表現(xiàn)出同源性，但不同致病變種間的雜交信號(hào)強(qiáng)度有差別。研究證明，不同病原細(xì)菌的hrp之間也存在同源性，E.amylovora

的hrp至少與8種植物病原細(xì)菌基因組DNA有同源性，其中包括在植物中不引起HR的E.stewartii和E.chrysanthemi。此外，還發(fā)現(xiàn)非病原細(xì)菌E.coli也含有一些能互補(bǔ)E.amylovora

hrp

突變體的基因。

根據(jù)hrp基因的DNA雜交和異源互補(bǔ)研究結(jié)果，植物病原細(xì)菌可以歸類(lèi)為兩組（1）包括青枯假單胞和甘蔗黑腐黃單胞的致病變種，其hrp基因簇是共線(xiàn)性的，以相對(duì)較高的嚴(yán)謹(jǐn)度相互雜交，且同源性涉及到hrp基因的大部分；（2）包括丁香假單胞的致病變種和梨火疫病菌，其hrp基因在同一組菌之間具有同源性，但兩組菌之間的hrp基因不存在同源性。植物病原菌中的hrp基因的廣泛存在及保守性說(shuō)明了許多不同植物病害具有共同的機(jī)制，并且可能編碼與病害表達(dá)有關(guān)的具有致病功能的因子，但其隨病原細(xì)菌的不同而有差異，hrp基因的DNA序列在不同類(lèi)型生物體之間的相似性也說(shuō)明了它們?cè)谙到y(tǒng)發(fā)育中的高度保守性。?

Hrp基因的表達(dá)和調(diào)控環(huán)境誘導(dǎo)和抑制信號(hào)植物成分的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)基因?

Hrp基因產(chǎn)物及其功能

Hrp基因是一類(lèi)基因產(chǎn)物未知的基因，已報(bào)道的產(chǎn)物多是根據(jù)Hrp基因的DNA序列分析推測(cè)出來(lái)的。

1992年韋忠民等首先從E.amylovora中分離出一個(gè)激發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的蛋白，定名為HarpinEa

由Hrp基因編碼。該蛋白為細(xì)菌外膜相關(guān)蛋白，富含Gly

，熱穩(wěn)定，對(duì)蛋白酶敏感，不具泌出蛋白特性。功能：（1）調(diào)節(jié)蛋白的功能；（2）跨膜蛋白泌出功能；（3）編碼無(wú)毒基因功能；（4）調(diào)節(jié)無(wú)毒基因表達(dá)功能；（5）信號(hào)識(shí)別功能。2.4.6dsp

基因

只影響寄主植物的侵染能力，而不影響在非寄主植物上誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)能力的基因稱(chēng)為dsp

基因。它們與病菌的侵襲力和代謝能力有關(guān)。一般認(rèn)為，dsp

基因在其基因組中是分散排列的，而在質(zhì)粒上是成簇排列的。2.4.7外泌基因2.4.8致病性調(diào)控基因

是指那些不直接編碼致病因子但對(duì)致病因子產(chǎn)生的總體水平發(fā)生影響的基因。如globalregulatorygene和phenotypeconversion,PC。2.4.9編碼未知產(chǎn)物的基因3質(zhì)粒及其在致病中的作用3.1質(zhì)粒的特征及分離3.2質(zhì)粒在決定致病性或毒性中的作用植物病原細(xì)菌決定致病性或毒性的基因可以在染色體上，也可以在質(zhì)粒上。質(zhì)?；蚩砂o(wú)毒基因、hrp基因以及編碼毒素和植物生長(zhǎng)素的基因。3.3質(zhì)粒編碼的非致病特性3.3.1生態(tài)適應(yīng)和進(jìn)化作用

質(zhì)粒的存在使植物病原菌對(duì)環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)能力。一方面是質(zhì)粒在群體中的轉(zhuǎn)移，使許多可利用的基因得以傳播和擴(kuò)散，同時(shí)提高了細(xì)菌群體DNA復(fù)制的效果。另一方面，質(zhì)粒編碼的性狀如產(chǎn)生細(xì)菌素和營(yíng)養(yǎng)能力，增加了細(xì)菌在新環(huán)境中的適應(yīng)和與其他細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)的能力，對(duì)抗生素、重金屬和紫外線(xiàn)輻射的抗性增加了細(xì)菌在不良環(huán)境中存活的機(jī)會(huì)。質(zhì)?；虻膹?fù)雜性是細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)化的產(chǎn)物。3.3.2細(xì)菌素（bactrocin）的產(chǎn)生

自1946年Fredericq報(bào)道大腸桿菌素（colocin）后，至今已報(bào)道了100多種細(xì)菌素。澳大利亞學(xué)者Kerr(1972)分離到一株能產(chǎn)農(nóng)桿菌素84（Agrocin84）的放射土壤桿菌菌株84，該菌株發(fā)酵后產(chǎn)生的A84對(duì)蘋(píng)果屬、梨屬、山楂屬和薔薇屬等許多屬植物的根癌并具有較強(qiáng)防治作用，目前該技術(shù)已在澳大利亞、美國(guó)、加拿大、英國(guó)、意大利和希臘等國(guó)家實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)而應(yīng)用于大田防治。3.3.3用重組質(zhì)粒向病原細(xì)菌導(dǎo)入新的基因

將從費(fèi)氏弧菌（Vibrio

fischeri）分離的熒光素基因?qū)胫参锊≡?xì)菌后可使這些細(xì)菌的細(xì)胞形成生物熒光，因此可以利用它們的發(fā)光性來(lái)監(jiān)測(cè)其在植物和環(huán)境中的分布和存活。目前已由實(shí)驗(yàn)室把含有Bt殺蟲(chóng)蛋白基因的重組克隆導(dǎo)入生防菌構(gòu)建成病蟲(chóng)兼治的生防制劑。

雙組分調(diào)控系統(tǒng)是生物中普遍存在的和相當(dāng)保守的一種重要調(diào)控機(jī)制。細(xì)菌細(xì)胞在環(huán)境變化是通過(guò)這種調(diào)控系統(tǒng)直接或間接地感受和傳遞信號(hào)，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)有關(guān)基因的表達(dá)或有關(guān)蛋白的活性，從而對(duì)環(huán)境的變化作出反應(yīng)，使細(xì)胞能適應(yīng)環(huán)境的變化?；趯?duì)蛋白質(zhì)AA序列的同源性比較，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近30個(gè)雙組分調(diào)控系統(tǒng)。

4植物病原細(xì)菌致病基因的調(diào)控機(jī)制

4.1雙組分系統(tǒng)的基本組成和調(diào)節(jié)控制組成

典型的雙組分調(diào)控系統(tǒng)有感受蛋白（sensor,modulator,tranmitter）和調(diào)節(jié)蛋白（regulator,effector,receiver）組成。分別由兩個(gè)不同的基因編碼。所有雙組分調(diào)控系統(tǒng)的感受蛋白和調(diào)節(jié)蛋白在AA序列上具有高度的同源性。感受蛋白：C末端250個(gè)AA序列具有明顯的同源性，在這一區(qū)域中，有5個(gè)小區(qū)表現(xiàn)高度的保守性；N末端雖然不具同源性，但是均有2個(gè)疏水區(qū)。調(diào)節(jié)蛋白：N末端120個(gè)AA序列是高度保守的，一些調(diào)節(jié)蛋白的C末端區(qū)也具有同源性。根據(jù)其同源性，可將目前已發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)蛋白分成5類(lèi)，其中3類(lèi)C末端具有一定的保守性；一類(lèi)無(wú)保守性；另一類(lèi)其分子量較小，近又保守的C末端區(qū)域組成。調(diào)控機(jī)制

感受蛋白通過(guò)N末端感受信號(hào)。然后保守的C末端與調(diào)節(jié)蛋白的保守N末端互相作用，將信號(hào)傳遞給調(diào)節(jié)蛋白。這種信號(hào)的傳遞是通過(guò)磷酸化或去磷酸化作用實(shí)現(xiàn)的。在不少雙組分調(diào)控系統(tǒng)中，已經(jīng)證實(shí)感受蛋白是磷酸化激酶，其活性區(qū)正是C末端的保守區(qū)。在這一區(qū)域中，有一個(gè)完全保守的His蛋白激酶，是感受蛋白自身磷酸化位點(diǎn)。感受蛋白在接受環(huán)境信號(hào)后，能將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到調(diào)節(jié)蛋白上，使調(diào)節(jié)蛋白磷酸化，被磷酸化的調(diào)節(jié)蛋白即具有了調(diào)節(jié)其他相關(guān)基因表達(dá)的活性。有的感受蛋白還具有磷蛋白磷酸酶的活性，可以通過(guò)去磷酸化作用是被磷酸化的調(diào)節(jié)蛋白失去活性。輸入信號(hào)感受蛋白調(diào)節(jié)蛋白NCCNP輸出信號(hào)HP4.2土壤農(nóng)桿菌毒性基因的調(diào)控植物釋放的信號(hào)物質(zhì)糖ChvE酚類(lèi)膜外周質(zhì)細(xì)胞質(zhì)PACGBDEVirG

無(wú)活性受體有活性VirA跨膜蛋白1跨膜蛋白25植物病原細(xì)菌的致病島（毒力島）5.1概念

毒力島（Pathogenicityisland,PAI）是指細(xì)菌染色體上一段具有典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的基因簇，主要編碼與細(xì)菌毒力及代謝等功能相關(guān)的產(chǎn)物。毒力島最早是用來(lái)描述泌尿道致病大腸桿菌（Ueropathogenic

E.coli,UPEC）染色體上兩個(gè)分子量很大，編碼許多毒力相關(guān)基因的，不穩(wěn)定的外源DNA片段（HackerJ,1997）。隨著研究的不斷深入，現(xiàn)已在動(dòng)植物病原細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了30多個(gè)毒力島。5.2毒力島的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與功能（1）存在于病染菌軟色體上，編碼毒力相關(guān)基因簇的一個(gè)分子量較大的DNA片段。（2）兩端具有RS和IS。（3）位于染色體的tRNA位點(diǎn)內(nèi)或附近，或者與質(zhì)粒、噬菌體整合有關(guān)的位點(diǎn)。（4）其G-C含量、密碼使用與宿主染色體具有明顯的差異。（5）不穩(wěn)定并含有一些潛在的可移動(dòng)成分。（6）編碼的產(chǎn)物多為分泌性蛋白和細(xì)胞表面蛋白。第四節(jié)植物病原真菌的致病相關(guān)基因1病原真菌基因克隆的策略和研究方法1.1差異雜交法

分離兩個(gè)菌株的mRNA群體，并用其中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后互相雜交，分離出沒(méi)有被雜交的特異性mRNA，再將此mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA構(gòu)建探針，從基因組文庫(kù)中釣取目的基因克隆。

該方法已被成功地用于克隆巢曲霉（Aspergillus

nidulans）的發(fā)育調(diào)節(jié)基因。1.2功能互補(bǔ)法以野生型菌株基因文庫(kù)為供體，缺失某種性狀的突變體為受體。突變體是已知目的基因所編碼性狀發(fā)生明顯改變?nèi)缰虏⌒詥适Ш团c致病性有關(guān)的致病生化因子的缺失。因此，用野生型菌株的基因文庫(kù)向突變體轉(zhuǎn)化可以篩選能使突變體性狀發(fā)生恢復(fù)的基因克隆，獲得克隆即含有能互補(bǔ)突變體功能的片段。

該方法已成功用于篩選玉米小斑病菌(Cochliobolus

heterostrophus)交配型基因、玉米瘤黑粉病菌(Ustilago

maydis)的b位點(diǎn)和豌豆根腐病菌（Nectria

haematococca）pda基因。1.3根據(jù)蛋白質(zhì)克隆基因法從純化的蛋白質(zhì)氨基酸序列推測(cè)基因序列合成探針，標(biāo)記后從基因文庫(kù)中或cDNA文庫(kù)中釣取有關(guān)基因。

從黑曲霉（Aspergillus

niger）克隆果膠裂解酶基因D和從番茄葉霉病菌(Cladosporium

fulvum)克隆無(wú)毒基因avr9就是利用這一方法。1.4染色體步查（chromosomewalking）法用與目的基因緊密連鎖的RFLP標(biāo)記為探針，從基因文庫(kù)中鑒定出同源片段，再以此片段克隆為探針鑒定出編碼目的基因的基因組重疊區(qū)，將這些克隆在進(jìn)行RFLP分析，從而得到新的RFLP，因?yàn)檎婢蚪M較大，必須一步一步反復(fù)巡查，使克隆的功能片段逐步縮短，才能最終獲得必需的目的基因。

該方法已用于克隆鑒定控制小種－品種轉(zhuǎn)化性的基因即無(wú)毒基因，如萵苣霜霉病菌（Bremia

lactucae）、稻瘟病菌（Magraparthe

grisea）。2病原真菌致病過(guò)程的相關(guān)基因2.1參與真菌發(fā)育調(diào)節(jié)的基因游動(dòng)孢子侵染寄主的發(fā)育調(diào)節(jié)基因

鞭毛菌亞門(mén)的植物病原真菌的游動(dòng)孢子是主要侵染結(jié)構(gòu)，主要從根的生長(zhǎng)區(qū)、根毛發(fā)生區(qū)和根冠或傷口等處侵染。其侵入并不是隨機(jī)發(fā)生的而是由根和游動(dòng)孢子表面特殊的誘導(dǎo)因子和受體介導(dǎo)的。分生孢子侵染寄主的發(fā)育調(diào)節(jié)基因

植物病原真菌的分生孢子一般在水中即可萌發(fā)，但有時(shí)除環(huán)境條件外還受外源物質(zhì)的影響。噬菌體或有機(jī)酸等化學(xué)物質(zhì)可影響孢子萌發(fā)和附著胞的分化甚至組織侵染發(fā)生；番茄葉霉病菌在抗感品種中都可以侵入，但在抗病品種中菌絲在進(jìn)入氣孔后在氣孔腔內(nèi)就被抑制，不能在細(xì)胞內(nèi)形成菌絲網(wǎng)絡(luò)以及從氣孔產(chǎn)生新的分生孢