選修153血紅蛋白的提取和分離2

本課題學(xué)習(xí)目標(biāo)

體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過(guò)程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝膠色譜法②電泳法③緩沖溶液④它們?cè)谘t蛋白的提取中分別起到什么作用。2、主要原理：①凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理②電泳法分離樣品的原理③緩沖溶液的組成和作用機(jī)理3、課題重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法4、課題難點(diǎn)：

①樣品的處理②色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。血液血漿水分固體物質(zhì)：血漿蛋白、無(wú)機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)2.提問(wèn)：血液有哪些成分？1.提問(wèn)：用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用豬、牛、羊的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？

雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提??；人的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。血紅蛋白血紅蛋白兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白的特點(diǎn)：1.分離生物大分子的基本思路：

選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。2.蛋白質(zhì)分離和提取的原理：

根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來(lái)分離不同種類的蛋白質(zhì)。一、血紅蛋白的提取和分離3.高溫滅菌和酒精滅菌的結(jié)果：使微生物的蛋白質(zhì)發(fā)生變性、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞。（一）凝膠色譜法（分配色譜法）2.凝膠：大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，來(lái)進(jìn)行分離。1.概念：3.凝膠色譜法的原理①當(dāng)相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢;②而相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。③依據(jù)的特性是：蛋白質(zhì)分子量的大小。4.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理和具體過(guò)程凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過(guò)程的動(dòng)畫(huà)演示

凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過(guò)程的動(dòng)畫(huà)演示

分子量大小直徑大小大于凝膠顆粒空隙直徑，被阻擋在顆粒的外面小于凝膠顆?？障吨睆?，可以進(jìn)入顆粒內(nèi)部運(yùn)動(dòng)方式垂直向下移動(dòng)垂直向下移動(dòng)，無(wú)規(guī)則擴(kuò)散進(jìn)入顆粒內(nèi)部運(yùn)動(dòng)速度較快較慢運(yùn)動(dòng)路徑較短較長(zhǎng)洗脫次序先從凝膠柱洗脫出來(lái)后從凝膠柱洗脫出來(lái)一、基礎(chǔ)知識(shí)蛋白質(zhì)分離和提取的原理

（二）緩沖溶液

1.概念:在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的影響使原來(lái)溶液PH值基本保持不變的混合溶液。

能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液PH值的影響，維持PH基本不變。2.作用:3.緩沖溶液的配制:通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。

4.提問(wèn)：在本課題中使用的緩沖液是:__________,其目的是:利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)磷酸緩沖液緩沖溶液的組成及分類①弱酸及其對(duì)應(yīng)的鹽：②弱堿及其對(duì)應(yīng)的鹽：③多元弱酸的酸式鹽及其對(duì)應(yīng)的次級(jí)鹽:H2CO3→NaHCO3；CH3COOH→CH3COONaNH3?H2O→NH4CL;NH4OH→NH4CLNaHCO3→Na2CO3；NaH2PO4→Na2HPO4

緩沖溶液由足夠濃度的共軛酸堿對(duì)組成。其中，能對(duì)抗外來(lái)強(qiáng)堿的稱為共軛酸；能對(duì)抗外來(lái)強(qiáng)酸的稱為共軛堿。這一共軛酸堿通常稱為緩沖對(duì)、緩沖劑或緩沖系。常見(jiàn)的緩沖對(duì)主要有如下三種類型：思考：說(shuō)出人體血液中緩沖液。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3（三）電泳：1.概念：帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。2.原理：

①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。②在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。最常用的電泳支持介質(zhì)是聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠。瓊脂糖有一個(gè)相對(duì)較大的孔徑，用來(lái)分離大分子例如核酸、大蛋白和蛋白復(fù)合物，聚丙烯酰胺形成孔徑較小的膠，適合于分離大多數(shù)蛋白和小片段核酸。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)瓊脂糖凝膠電泳示意圖

（1）、蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于

等因素。它所帶靜電荷的多少以及分子的大?。?）、SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于（）。分子的大小SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）

聚丙烯酰胺凝膠電泳1、在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)常用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng)

蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。

（SDS的作用）為了消除凈電荷對(duì)遷移率的影響，可以在凝膠中加入SDS。2.原理：

SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。3.SDS作用機(jī)理:用SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法

使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對(duì)數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測(cè)定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場(chǎng)上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。

二、實(shí)驗(yàn)操作樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定1.樣品處理：（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟（二）操作過(guò)程

本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液來(lái)分離血紅蛋白。(1)紅細(xì)胞的洗滌:①洗滌目的:

去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，洗滌次數(shù)不可過(guò)少。②洗滌操作：

1、采集血樣。2、低速短時(shí)間離心（速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時(shí)間）6、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒(méi)有黃色，表明洗滌干凈。紅細(xì)胞的洗滌思考：洗滌的目的是什么？洗滌過(guò)程：血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒(méi)有黃色采集得到血液柜式離心機(jī)初次離心后的結(jié)果3次洗滌后的結(jié)果(2)血紅蛋白的釋放：

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。

二、實(shí)驗(yàn)操作（2）釋放血紅蛋白思考：釋放血紅蛋白過(guò)程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？（蒸餾水，40%體積的甲苯）為了加速釋放過(guò)程，采取了什么措施？

（使用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢瑁┠康姆治觯赫麴s水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀___________________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂攪拌器正在工作(3)分離血紅蛋白溶液：

①過(guò)程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無(wú)色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。

二、實(shí)驗(yàn)操作甲苯層（無(wú)色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）試管中溶液層次(4)透析：

①過(guò)程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時(shí)。

②透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。

二、實(shí)驗(yàn)操作

2.粗分離透析（去除分子量較小的雜質(zhì)）（1）用

方法進(jìn)行粗分離，透析袋由半透膜制成，常用。將透析袋放入

溶液中進(jìn)行透析。（2）透析的原理是（3）透析的目的是

。

透析玻璃紙、腸衣、膀胱膜

透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)磷酸緩沖透析過(guò)程中如何去除無(wú)機(jī)鹽離子和小分子有機(jī)物？半透膜的選擇透過(guò)性，大分子物質(zhì)不能通過(guò)半透膜，離子和小分子能夠通過(guò)半透膜。在透析過(guò)程中，血紅蛋白溶液中的離子和小分子不斷通過(guò)半透膜擴(kuò)散進(jìn)入到pH＝7的磷酸緩沖液中。透析過(guò)程中為何使用pH＝7的磷酸緩沖液？為什么緩沖液量遠(yuǎn)多于血紅蛋白溶液量？維持血紅蛋白的正常特性。有利于雜質(zhì)分子充分地向外擴(kuò)散。利用透析袋透析2.凝膠色譜操作:（1）凝膠色譜柱的制作：

①取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。

④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。（2）凝膠色譜柱的裝填50cm高2、凝膠色譜柱的裝填步驟操作要求①操作要求色譜柱垂直固定在支架上②計(jì)算稱量凝膠根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量③配制懸浮液凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹凝膠顆粒＋洗脫液→沸水?、苎b填懸浮液一次性緩慢倒入；輕輕敲打⑤緩沖液洗滌平衡立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h

教材P70：為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？如果裝填不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無(wú)效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過(guò)，攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，影響分離的效果。思考裝配好的凝膠柱3、樣品加入與洗脫調(diào)節(jié)緩沖液面→加入蛋白質(zhì)樣品→調(diào)節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì)（1）調(diào)節(jié)緩沖液面：打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。（2）滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。（3）樣品滲入凝膠床：加樣后打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。（4）洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口進(jìn)行洗脫。（5）收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功）（6）注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。3.樣品的加入和洗脫（3）樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。(3）樣品加入與洗脫①加樣前打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)凝膠面上的（）緩慢下降到與（）平齊，關(guān)閉出口緩沖液凝膠面注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。②加透析樣品①調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊②滴加透析樣品：加到色譜柱的（）③樣品滲入凝膠床：（）④再調(diào)整緩沖液面洗脫：⑤收集：待（）接近色譜柱底端時(shí)收集頂端樣品完全進(jìn)凝膠層紅色的蛋白質(zhì)色譜柱制作成功的標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)記開(kāi)始進(jìn)行層析收集得到的純化后的蛋白

1、由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行。2、TEMED和過(guò)硫酸胺對(duì)黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。3、在進(jìn)行電泳操作時(shí)一定按照實(shí)驗(yàn)要求和步驟完成。操作時(shí)要戴好一次性手套。注意事項(xiàng)：（三）SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度。1.目的：

①SDS-聚丙烯酰胺分離膠制備：用去離子水4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris緩沖液2.5mL，10%的SDS0.1mL，10%的過(guò)硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，混合均勻，迅速灌注在兩玻璃板的間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間(梳子的齒長(zhǎng)再加0.5cm)，再在膠液面上小心注入一層水（約高2—3mm），以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。②分離膠聚合完全后（約30min），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。③配制SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液用去離子水2.7mL，30%的丙烯酰胺0.67mL，1.0mol、pH6.8的Tris緩沖液0.5mL，10%的SDS0.041mL，10%的過(guò)硫酸胺0.04mL，TEMED0.004mL，混合均勻，直接灌注在聚合的分離膠上，并立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)注意避免氣泡的產(chǎn)生。然后再補(bǔ)加濃縮膠溶液，使其充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合。（1）根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)安裝電泳用的玻璃板（2）SDS—聚丙烯酰胺凝膠制備：3、電泳方法步驟（3）樣品處理：在電泳樣品中按1∶1體積比加入樣品處理液，在100℃溫度下加熱3min，以使蛋白質(zhì)變性。（4）濃縮膠聚合完全后（30min），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris—甘氨酸電泳緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部?jī)刹ＡО逯g的氣泡。（5）加樣：按順序加樣，加樣量通常為10—25μL。樣品可以多加幾個(gè)，例如，血漿樣品紅細(xì)胞破碎后(即進(jìn)行凝膠色譜分離之前)的樣品和凝膠色譜分離之后的樣品（6）電泳：將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8V/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約1cm處，關(guān)閉電源。（7）剝膠：從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮刀撬開(kāi)玻璃板。將緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角，以標(biāo)注凝膠的方位。（8）染色：將電泳凝膠片放在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色1-2h。（9）脫色：染色完畢，傾出染色液,換脫色液脫色3-10h，其間需多次更換脫色液至背景清楚。（10）觀察結(jié)果：SDS電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過(guò)程中，待別是樣品制備過(guò)程中蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度。3、電泳方法步驟

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見(jiàn)教科書(shū)圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？

由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。

注意事項(xiàng)1.紅細(xì)胞的洗滌：

洗滌次數(shù)不能過(guò)少；低速、短時(shí)離心。2.凝膠的預(yù)處理：

沸水浴法時(shí)間短，還能除去微生物和氣泡3.色譜柱的裝填：

裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無(wú)氣泡；洗脫液不能斷流。4.色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。為什么？

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見(jiàn)教科書(shū)圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？

由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說(shuō)明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過(guò)程中，紅色區(qū)帶的移動(dòng)嗎？請(qǐng)描述紅色區(qū)帶的移動(dòng)情況，并據(jù)此判斷分離效果？三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)本課題作業(yè);1.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的的原理是怎樣的?2.什么是緩沖溶液?它的作用是什么?3.電泳的作用及其原理是什么?4.你能描述血紅蛋白分離的完整過(guò)程嗎?5.與其他真核細(xì)胞相比,紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)?這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義?凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時(shí)，各分子在色譜柱內(nèi)進(jìn)行兩種不同的運(yùn)動(dòng)，即垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無(wú)規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過(guò)的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出，