第二章分子克隆工具酶

第二章分子克隆工具酶

基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性核酸內切酶，連接酶，DNA聚合酶等)作為工具對基因進行人工切割，拼接和擴增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶”。工具酶是對野生菌株（或真核生物如酵母）進行改造、優(yōu)化、而產生的生物工程產品。分子克隆工具酶工具酶

核酸內切酶核酸外切酶DNA連接酶DNA聚合酶DNA及RNA修飾酶單鏈核酸內切酶酶主要用途限制性核酸內切酶識別DNA特定序列，切割DNA分子DNA連接酶連接兩個DNA分子或片段大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ或Klenow酶1制作DNA探針；2合成cDNA第二鏈；3填補雙鏈DNA3`凹端；4DNA測序。TaqDNA聚合酶聚合酶鏈式反應（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端標記探針末端轉移酶使3`-末端加同聚物尾S1核酸酶降解單鏈DNA或RNADNA酶Ⅰ在雙鏈DNA上產生隨機切口RNA酶A降解RNA逆轉錄酶補平反應，合成cDNA或制探針磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARY1限制性內切酶1.1引言--核酸酶和限制性核酸內切酶的定義1.2限制性核酸內切酶的命名1.3限制性核酸內切酶的分類1.4限制性核酸內切酶活性及其影響因素核酸酶（Nuclease）：通過切割相鄰兩個核苷酸殘基之間磷酸二酯鍵，導致核酸分子多核苷酸鏈水解斷裂的蛋白酶。1）按作用對象可分為:Deoxyribonuclease(DNAase)&Ribonuclease(RNAase)2）按水解斷裂核酸分子不同方式可分為：Endonuclease&Exonuclease1.1引言--核酸酶和限制性核酸內切酶的定義限制性內切核酸酶（restrictionendonuclease):

指一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識別序列內或附近特異切割雙鏈DNA的核酸內切酶。

限制酶天然存在于細菌體內，與相伴存在的甲基化酶共同構成細菌的限制-修飾系統（Restriction-ModificationSystem)。EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號

若種名頭2個字母相同則其中一個可用種名的第一和第三個字母。1.2限制性核酸內切酶的命名1.3限制性核酸內切酶的分類1.3.1Ⅰ型限制性內切酶1.3.2Ⅱ

型限制性內切酶1.3.3Ⅲ

型限制性內切酶1.3.1Ⅰ型限制性內切酶功能：限制、修飾特點：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為輔助因子；識別位點和切割位點不一致，沒有固定切割位點（隨機性）；應用：不常用。1.3.2Ⅲ型限制性內切酶功能：限制、修飾特點：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為輔助因子；特異切割，切割位點在識別位點外，距識別位點3`端24-26bp處。應用：數量很少，分子克隆中無實際作用。1.3.3Ⅱ型限制性內切酶功能：識別并特異切割DNA分子。

即通常所指的DNA限制性核酸內切酶；反應特點：僅需Mg2+作為催化反應的輔助因子，能識別雙鏈DNA的特殊序列，并可特異切割DNA，產生特異性的片段；應用：種類繁多，分子克隆中最常用的內切酶。限制性內切酶限制酶限制性內切酶分布：主要在微生物中。作用特點：特異性，即識別特定核苷酸序列，切割特定切點。結果：產生黏性未端（堿基互補配對）。舉例：大腸桿菌的一種限制酶EcoRI能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，它們之間正好互補配對，這樣的切口叫做黏性末端。(1)基本特性識別長度為4-8個核苷酸的特異序列；最常見的為6個堿基.許多識別序列具回文結構，如HindⅢ的識別序列：

5`AAGCTT3`3`TTCGAA5切割產生的末端有粘端

(cohesive/stickyend)如BamHI(G↓GATCC)

和平端

(bluntend)如SmaI(CCC↓GGG)PstⅠ切割后產生3ˊ粘性末端：有一些酶沿對稱軸切斷DNA，產生平端或鈍端（Bluntend）,如SmaⅠ：EnzymeRecognitionsequenceEnzymeRecognitionseuqenceBamHIG↓GATCCPst

ICTGCA↓GBgl

IIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy

↓PuACSfi

IGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSma

ICCC↓GGGKpn

IGGTAC↓CXba

IT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXho

IC↓TCGAGRecognitionSequencesandCuttingsitesofselectedRestrictionEndonucleases

(2)同裂酶（isoschizomer）

識別相同序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點可能不同。①同序同切酶

這些酶識別序列和切割位置都相同

HindⅡ與HincⅡ識別切割位點為GTY↓RAC

，HpaⅡ與HapⅡ識別切割位點為C↓CGGMobⅠ與Sau3AⅠ識別切割位點為↓GATC

。②同序異切酶

KpnⅠ和Acc65Ⅰ識別的序列是相同的，但它們的切割位點不同，分別為GGTAC↓C和G↓GTACC。

③“同功多位”許多識別簡并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。如EcoRⅠ識別和切割位點為G↓AATTC，ApoⅠ

識別和切割位點為R↓AATTY，后者可識別前者的序列。

④其它有些限制酶識別的序列有交叉，如在pUC

系列質粒的多克隆位點中有一個SalⅠ位點（識別切割位點為G↓TCGAC），該位點也可被AccⅠ（識別切割位點為GT↓MKAC）和HincⅡ（識別切割位點為

GTY↓RAC）切割。(3)同尾酶有些限制酶識別序列不同，但是產生相同的粘性末端，這些酶稱為同尾酶（isocaudamer)

如：

BamHI:G↓GATCC

Bgl

II:A↓GATC

BclⅠ:5’-T↓

GATCA-31.4

限制性核酸內切酶活性

及其影響因素(1)

活性大?。好笇NA水解程度不同。(2)酶的活性單位：在指明pH與37℃，在0.05mL反應混合物中，1小時消化1μg的λDNA的酶量為1單位。(3)限制性核酸內切酶的反應條件1)底物DNADNA純度:RNA與E結合影響有效酶濃度；

DNA濃度:

[DNA]過大，抑制酶活，影響酶分子擴散如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃15h1μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃1h

2)反應系統因素緩沖液（無菌、無污染）buffer（pH=8.0）：50mmol/LTris-HCl10mmol/LMgCl21mmol/LDTT或巰基乙醇100μgBSA/ml（DDT：二硫蘇糖醇BSA：牛血清蛋白)

NaCL（0,500,1000mM）金屬離子如：Ⅱ型酶需Mg2+，若以Mn2+代替Mg2+（如HindⅢ，ECORI）則特異性改變。離子濃度不合適會抑制酶活。牛血清蛋白(BSA)BSA是酶穩(wěn)定劑，可避免熱、表面張力、化學品導致的酶變性。過量BSA會引起電泳拖尾限制性核酸內切酶的反應條件限制性核酸內切酶的反應體系Buffer（10x）3LDNA（質粒、載體、總DNA….0.1-1g酶2uddH2OBSA（1%）3L30L酶量不超過總體積的1/10思考題用限制酶BglⅡ消化2ｕgλDNA，該DNA濃度為125ｕg/mL，BglⅡ為4units/ｕL.并提供了限制酶BglⅡ的10倍的緩沖鹽體系。請設計一最佳方案來完成該實驗限制性內切酶的選擇原則：選常見的、活性高的酶，如果雙酶切最好選有公用Buffer的酶推薦酶：Promega公司，Takara公司，Tyoyobo公司雙酶切A有公用Buffer的。（直接用公用Buffer切）B兩種酶反應溫度不同的。（先切其中一個然后高溫失活，再用另外一個酶切）C無公用Buffer的：先用低鹽Buffer切幾個小時，再補加鹽分到高鹽加入另外一個酶繼續(xù)切3.星活性在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星星活性,如EcoRⅠ星活性用EcoRⅠ*表示。

影響因素：甘油濃度高（>5%），酶過量（>100U/ml），離子強度低（<25mM），pH值過高（>8.0），45%聚乙二醇(PEG)，有機溶劑，8%二甲基亞楓，二價陽離子，12%乙醇。限制性核酸內切酶的反應條件DNA末段的長度對限制酶切割的影響需要在識別序列兩端存在一定長度的非識別序列增加切割效率

位點偏愛（Sitepreference）

某些限制酶對同一介質中的有些位點表現出偏愛性切割，即對不同位置的同一個識別序列表現出不同的切割效率的現象稱作位點偏愛。1.5

限制酶的用途

1.

在特異位點上切割DNA，產生特異的限制片斷

2.

建立限制酶（物理）圖譜繪制

3.

構建基因文庫

4.用限制酶切出相同的粘性末端，以便重組2DNA連接酶2.1定義及功能2.2種類及作用機理2.3使用時的注意事項2.1定義及功能DNA連接酶（DNAligase）：可使一段DNA的3`羥基末端和5`磷酸末端形成3`，5`-磷酸二酯鍵，把兩個DNA片段連在一起，封閉DNA雙鏈上形成的切口的酶。

DNA連接酶是1967年在三個實驗室同時發(fā)現的。J:\生物視頻\細胞生物學視頻\連接酶\DNA連接酶.J:\生物視頻\細胞生物學視頻\連接酶\連接酶.swfOHP5`3`3`5`5`3`3`5`DNAligaseDNAligase

連接缺刻(nick)DNA連接酶連接的部位：磷酸二酯鍵（梯子的扶手），不是氫鍵（梯子的踏板）。T4DNA連接酶(ATP提供能量）和大腸桿菌DNA連接酶（NAD+提供能量）兩種。2.2種類及作用機理大腸桿菌的DNA連接酶

大腸桿菌的DNA連接酶是一條分子量為75KD的多肽鏈。對胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶與NAD(而不是ATP)反應形成酶-AMP中間物，但不能繼續(xù)將AMP轉移到DNA上促進磷酸二酯鍵的形成。大腸桿菌的DNA連接酶DNA連接酶在大腸桿菌細胞中約有300個分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子數相近，這也是比較合理的現象。因為DNA連接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合,填滿雙鏈DNA上的單鏈間隙后,封閉DNA雙鏈上的缺口。這在DNA復制、修復和重組中起著重要的作用，連接酶有缺陷的突變株不能進行DNA復制、修復和重組。

噬菌體T4DNA連接酶

噬菌體T4DNA連接酶分子也是一條多肽鏈，分子量為60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化過程需要ATP輔助。T4DNA連接酶可連接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和雙鏈DNA粘性末端或平頭末端。另外，NH4C1可以提高在大腸桿菌DNA連接酶的的催化速率，而對T4DNA連接酶則無效。無論是T4DNA連接酶，還是大腸桿菌DNA連接酶都不能催化兩條游離的DNA鏈相連接。

AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5′5′5′5′(1)(2)AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5′5′AATTC······GG······CTTAA5′5′(a)分子間連接(b)分子內連接(1)(2)ATGCTATAGCTAT4連接酶T4連接酶T4DNAligase

的作用機理1)DNA連接酶不能催化兩單鏈DNA分子連接；2)只能連接雙鏈DNA分子的單鏈缺刻(nick)；3)不能連接雙鏈中一個或多個核苷酸缺失所致的缺口（gap）。2.3使用時的注意事項思考

要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性末端？要切兩個切口，產生四個黏性末端。

如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？

會產生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就可以合成重組的DNA分子了。DNA聚合酶（DNApolymerase）

J:\生物視頻\細胞生物學視頻\DNA聚合酶\Nucleotide_Polymerization.movJ

J:\生物視頻\細胞生物學視頻\DNA聚合酶\Nucleotide_Polymerization.mov3.1DNA聚合酶I3.2Klenow聚合酶3.3TaqDNA聚合酶3.4逆轉錄酶3.5T4DNA聚合酶3.6T7DNA聚合酶3.1DNA聚合酶I活性：5`→3`聚合活性，5`→3`外切和3`→5`外切活性。發(fā)揮生物學活性的條件：（1）DNA模板（可以是單鏈或雙鏈）（2）帶有3`-端游離羥基的引物鏈（3）底物和激活劑注：對雙鏈DNA，當有dNTP存在時，3`→5`降解活性會被5`→3`方向的聚合活性所抑制。應用：缺口平移法制備DNA分子雜交探針1、5′→3′聚合酶活性：

CCGGGCTATCGGE.coli

DNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG2、5′→3′外切酶活性

3、3′→5′外切酶活性

GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coli

DNApolIMg2++pC，pT5′TCGATAGCCAGCTATE.coli

DNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5′DNA聚合酶I的三種活性DNA雜交探針的制備5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’********(a)(b)(c)(d)(e)(a)雙鏈的DNA分子(b)帶有3’-OH末端的單鏈缺口(c)polⅠ從5‘-P移去一個核苷酸(d)polⅠ將32P標記的核苷酸參入取代被移去的核苷酸(e)重復(c)(d)的步驟，缺口沿5’-3‘方向移動，形成32P標記的核苷酸合成的DNA鏈制備高比活性的探針當雙鏈DNA分子的一條鏈上產生切口時,E.coliDNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3‘羥基末端。同時該酶具有從5’→3‘的核酸外切酶活性,能從切口的5’端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3‘端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。DNA聚合酶I在基因工程的應用用于分子克隆（填充缺口利于重組）

DNApolⅠ能填充DNA的小缺口區(qū)（Gappedregion）→以便有效在體外用于DNA分子重組

DNA序列分析K:\生物視頻\細胞生物學視頻\核酸特性、合成及轉運\DNA測序

①

Sauger雙脫氧法

DNApolⅠ參入了2’3’－雙脫氧核苷酸到相應的融合了的引物中，從而終止了鏈的進一步延伸，這樣每個大小不同片段都帶有ddNTP。經過PAGE測出DNA順序。

②

化學降解法當Mg2＋被Mn2＋取代時，DNApolⅠ有參與相應NTP取代dNTP的能力，參與的這個NTP可以作為1個特殊切割位點而被降解，得到帶有NTP末端的DNA片段，這是化學法測序的主要原理。③

加減法主要原理是在限制使用dNTP條件下加入DNApolⅠ和T4誘導的DNApol同時反應。在減法反應中從4個反應混合物中每4個dNTP中減去1個。生長鏈沿著引物延伸至缺少的那個dNTP為止。在加法反應中所用的dNTP只有1種，如dATP，通過DNApol3′→5′外切酶活性使鏈終止在帶有A的3’末端用其它3種dNTP進行類似反應，這樣通過加或減法8個混合物的電泳結果即可推出DNA鏈的順序。

來源：

E.coliDNAPolymeraseⅠ經蛋白酶水解的大片段(Klenow和Henningseon.19703.2Klenow聚合酶DNApolⅠ枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶C端(76kd)+N端（36kd）

5’→3’外切用途填補限制酶的5′-粘性末端為平齊末端5’…CC3’…GGAATT5’…CCTTAA3’3’…GGAATT5’Klenow3′-末端標記

Klenow

在無底物時只進行3′→5′外切；有底物存在時則聚合。這種標記也稱作交換標記，但Klenow作用不如T4DNA聚合酶。顯著特點：熱穩(wěn)定性

70℃反應2h殘留活性為原來的90%；93℃反應2h殘留活性為原來的60%；94℃反應2h殘留活性為原來的40%。應用：（1）DNA序列測定（2）PCR(polymerasechainreaction)對DNA的特定片段進行體外擴增。K:\生物視頻\細胞生物學視頻\分子\PCR3.3TaqDNA聚合酶逆轉錄酶(reversetranscriptase)：又稱為RNA指導的DNA聚合酶?；钚裕?/p>

5`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是帶3`-OH的RNA或DNA。K:\生物視頻\細胞生物學視頻\逆轉錄酶\逆轉錄酶的作用原理.swfK:\生物視頻\細胞生物學視頻\逆轉錄酶\DNA端部處理K:\生物視頻\細胞生物學視頻\反轉錄病毒\Life_Cycle_of_a_Retrovirus.mov3.4逆轉錄酶逆轉錄酶的活性

用途：（1）在體外以mRNA為模板合成cDNA；（2）對有5`突出末端的DNA片段作末端標記（補平）；（3）雙脫氧法測序；（4）以DNA或RNA為模板合成核酸探針。活性：

5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性，且3`→5`外切酶活性對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA強。

高濃度dNTP

環(huán)竟下前者活性更強。應用：標記DNA平末端或隱蔽3`末端注意：3`外切酶活性無序列特異性3.5T4DNA聚合酶活性：5`→3`聚合酶活性；有單鏈及雙鏈的3`→5`外切酶活性，但無5`→3`外切酶活性；特點：極佳的連續(xù)合成能力應用：（1）用于長模板DNA的引物延伸反應；（2）通過單純的延伸或取代合成途徑標記DNA3`末端；（3）使雙鏈DNA的5`或3`突出末端變成平末端。3.6T7DNA聚合酶T7DNA聚合酶（測序酶）來源：T7Phage感染的E.coli結構：由2個蛋白亞基組成：

T7phagegene5蛋白+宿主硫氧蛋白活性：5′→3′聚合，持續(xù)反