第六講酶和細(xì)胞的固定化

酶和細(xì)胞的固定化Immobilizedenzymeandcell酶的催化具有高選擇性、高催化活性、反應(yīng)條件溫和、環(huán)保無(wú)污染等特點(diǎn)。但游離狀態(tài)的酶對(duì)熱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑等穩(wěn)定性較差，易失活，并且反應(yīng)后混入底物等物質(zhì)，純化困難，不能重復(fù)使用。歷史簡(jiǎn)介1916年Nelson和Griffin首先發(fā)現(xiàn)了酶的固定化現(xiàn)象，從此科學(xué)家就開(kāi)始了固定化酶的研究工作。1969年日本一家制藥公司第一次將固定化的酰化氨基酸水解酶用來(lái)從混合氨基酸中生產(chǎn)L-氨基酸，開(kāi)辟了固定化酶工業(yè)化應(yīng)用的新時(shí)代。已經(jīng)顯示固定化酶將在現(xiàn)代酶工程以及整個(gè)生物工程中占有重要作用，它在應(yīng)用上和理論上的巨大潛力引起了生物化學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)工程和高分子等領(lǐng)域的各類(lèi)研究人員的廣泛關(guān)注。主要講授內(nèi)容一、固定化酶(細(xì)胞)的制備二、固定化酶(細(xì)胞)的性質(zhì)和指標(biāo)三、固定化酶和固定化細(xì)胞的反應(yīng)器四、酶工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用一、固定化酶(細(xì)胞)的制備1.傳統(tǒng)的酶固定化方法2.新型的酶固定化方法3.固定化細(xì)胞的方法4.固定化酶常用的載體材料1.傳統(tǒng)的固定化酶的方法傳統(tǒng)的固定化酶的方法為載體結(jié)合法，大致可分為：吸附法交聯(lián)法包埋法其他方法

載體結(jié)合法

載體結(jié)合法是將酶結(jié)合于不溶性載體上的一種固定化方法。根據(jù)結(jié)合形式的不同，可分為物理吸附法、離子結(jié)合法和共價(jià)結(jié)合法三種形式。物理吸附法：是利用酶和載體間的非特異性物理吸附作用將酶固定在載體表面，這些物理吸附作用包括范德華力、氫鍵、疏水作用、靜電作用等。物理吸附法的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：條件溫和，工藝簡(jiǎn)便，載體選擇范圍很大，吸附時(shí)既可實(shí)現(xiàn)酶的固定化又可以達(dá)到純化的目的，吸附后酶的構(gòu)象變化較小或基本不變，因此對(duì)酶的催化活性影響小。物理吸附法的缺點(diǎn)缺點(diǎn)：但酶和載體之間結(jié)合力弱，pH、溫度、離子強(qiáng)度等條件的變化都易使酶從載體脫落，并且污染催化反應(yīng)產(chǎn)物。離子結(jié)合法離子結(jié)合法是酶通過(guò)離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不性載體上的固定化方法。此法的載體有多糖類(lèi)離子交換劑和合成高分子離子交換樹(shù)脂，如DEAE-纖維素、AmberliteCG-50、XE-97和Dowex-50等。

*DEAE——二乙胺基乙基離子結(jié)合法的優(yōu)缺點(diǎn)離子結(jié)合法優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)單，處理?xiàng)l件溫和，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能得到酶活回收率較高的固定化酶。缺點(diǎn)是載體和酶的結(jié)合力較弱，容易受緩沖液種類(lèi)或pH的影響，在離子強(qiáng)度較高的條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，往往會(huì)發(fā)生酶從載體上脫落的現(xiàn)象。共價(jià)結(jié)合法共價(jià)結(jié)合法是酶以共價(jià)鍵結(jié)合于載體上的固定化方法，即將酶分子上非活性部位功能團(tuán)與載體表面反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合的方法。一般先用化學(xué)方法將載體活化，再與酶分子表面的某些基團(tuán)如羧基、氨基、羥基等反應(yīng)，形成共價(jià)鍵。共價(jià)結(jié)合法的優(yōu)缺點(diǎn)共價(jià)結(jié)合法所得的固定化酶與載體結(jié)合比較牢固，有良好的穩(wěn)定性及重復(fù)使用性，成為目前研究最為活躍的一類(lèi)酶固定化方法。但該法較其他固定方法反應(yīng)劇烈，固定化酶活性損失更加嚴(yán)重。交聯(lián)法

交聯(lián)法是利用雙功能或多功能交聯(lián)試劑，在酶分子和交聯(lián)試劑之間形成共價(jià)鍵的酶的固定化方法。采用不同的交聯(lián)條件和在交聯(lián)體系中添加不同的材料，可以產(chǎn)生物理性質(zhì)各異的固定化酶。交聯(lián)法與共價(jià)結(jié)合法一樣也是利用共價(jià)鍵固定酶，所不同的是它不使用載體。交聯(lián)法制備較難，酶活損失較大，一般作為其他固定化方法的輔助手段。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等，其中應(yīng)用最廣泛的是戊二醛。包埋法

包埋法是載體與酶溶液混合后，借助引發(fā)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，通過(guò)物理作用將酶限定在載體的網(wǎng)格中，從而實(shí)現(xiàn)酶固定化的方法。該法條件溫和，基本上不涉及酶的構(gòu)象及酶分子的化學(xué)變化，因而酶活力回收率較高。包埋法的缺點(diǎn)但包埋法固定化酶易泄漏，常存在機(jī)械強(qiáng)度差、擴(kuò)散受限制、傳質(zhì)阻力較大等問(wèn)題，不宜催化大分子底物的反應(yīng)。常用的載體主要有明膠、聚酰胺、瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹(shù)脂、海藻酸鈉、火棉膠等。包埋法可分為兩種：

網(wǎng)格型微囊型將酶或細(xì)胞包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中的稱(chēng)為網(wǎng)格型，常用的高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏樹(shù)脂等合成高分子化合物，以及淀粉、明膠、海藻膠和角叉菜膠等天然高分子化合物。將酶和細(xì)胞包埋在高分子半透膜中的稱(chēng)為微囊型，顆粒比網(wǎng)格型要小得多，比較有利于底物與產(chǎn)物的擴(kuò)散，但反應(yīng)條件要求高，制備成本也高。傳統(tǒng)的酶固定化方法的缺點(diǎn)：

酶在任意位點(diǎn)與載體進(jìn)行連接，使酶活性位點(diǎn)不能充分暴露，而且酶的固定化量降低。

因此定向固定化酶技術(shù)將成為今后固定化酶研究的熱點(diǎn)。2.新型的酶固定化方法新型的酶的固定化方法，要在較為溫和的條件下進(jìn)行，盡量減少或避免酶活力的損失，并提高固定化效率。通過(guò)輻射、光、等離子體、電子、“柔性鏈”等新方法均可制備高活性固定化酶。

如光偶聯(lián)法以光敏性單體聚合物包埋固定化酶或帶光敏性基團(tuán)的載體共價(jià)固定化酶，由于條件溫和，可獲得酶活力較高的固定化酶。等離子體是高度激發(fā)的原子、分子、離子以及自由基的聚集體，大量的等離子體常在室溫下存在。載體材料表面可以用等離子體進(jìn)行修飾，從而引入活性基團(tuán)。

偶合（耦合）固定化也是新近發(fā)展起來(lái)的一種酶固定化方法，基本上能夠解決單一固定化方法酶活回收率低、穩(wěn)定性差、傳質(zhì)阻力大等問(wèn)題，并具有方法多樣、操作簡(jiǎn)便、技術(shù)成熟等特點(diǎn)。從較早的吸附—交聯(lián)法、包埋—交聯(lián)法開(kāi)始，偶合固定化技術(shù)已經(jīng)得到越來(lái)越多的應(yīng)用，先后提出并研究了包埋—吸附法、絮凝—吸附法、吸附—交聯(lián)法、膜—吸附法等方法。無(wú)載體固定化酶直接利用交聯(lián)劑交聯(lián)溶解酶、晶體酶、物理聚集酶和噴霧干燥酶而形成交聯(lián)溶解酶、交聯(lián)酶晶體、交聯(lián)酶聚集體和交聯(lián)噴霧干燥酶等4種無(wú)載體酶系統(tǒng)。與傳統(tǒng)固定化酶相比，無(wú)載體酶具有以下一些優(yōu)點(diǎn)：①催化活性高，成本低；②具備較高的催化劑比表面；③可加入多種酶；④底物擴(kuò)散受限較少；⑤在極端條件、有機(jī)溶劑和蛋白酶中的穩(wěn)定性較高。此外，研究人員還開(kāi)發(fā)了一些定向固定化的方法，如利用酶和抗體之間的親和性、酶和金屬離子形成復(fù)合物、通過(guò)酶分子上的糖基部分固定化、用分子生物學(xué)方法使酶定向固定化等。3.固定化細(xì)胞的方法細(xì)胞的固定化主要是活細(xì)胞的固定化，是一種不用載體的工藝。通過(guò)化學(xué)的或物理的手段，使整個(gè)細(xì)胞彼此附著相連。

化學(xué)交聯(lián)化學(xué)交聯(lián)是指細(xì)胞體借助雙功能或多功能試劑，如醛或胺的共價(jià)附著相連。固定含L-天門(mén)冬氨酸解氨酶(天門(mén)冬氨酸酶)活性的大腸桿菌細(xì)胞，它們是通過(guò)應(yīng)用雙功能試劑(戊二醛，以及甲苯二異氰酸酯)來(lái)強(qiáng)化細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的交聯(lián)。物理交聯(lián)用絮凝法進(jìn)行細(xì)胞的物理交聯(lián)，在固定化細(xì)胞的應(yīng)用中有很大潛力。使用種類(lèi)不同的絮凝劑，可促進(jìn)細(xì)胞凝聚。這些絮凝劑，包括陽(yáng)離子聚合電解質(zhì)和陰離子聚合電解質(zhì)以及金屬化合物。絮凝劑陽(yáng)離子聚合電解質(zhì)，如聚胺、聚乙烯亞胺和陽(yáng)離子聚丙烯酰胺；陰離子聚合電解質(zhì)，如羧基取代的聚丙烯酰胺、聚苯乙烯磺酸鹽、聚羧酸；以及金屬化合物，如Mg（II）、Ca（II）、Fe（III）、Mn（II）的氧化物、氫氧化物、硫酸鹽、磷酸鹽。除了化學(xué)交聯(lián)法外，還有載體粘合法、凝膠體截留法和金屬螫合法等多種。載體粘合法，是將融合整細(xì)胞粘合到支撐體表面，根據(jù)整細(xì)胞粘合的方式，又可分為吸附、螯合和共價(jià)結(jié)合三種。用此法固定細(xì)胞時(shí)，應(yīng)注意選擇載體及粘合方法。載體有有機(jī)載體和無(wú)機(jī)載體兩種。粘合方法最常用的是吸附法，它簡(jiǎn)單、溫和、細(xì)胞存活率高。截留法是在一種壓緊的結(jié)構(gòu)內(nèi)將細(xì)胞滯留。這種結(jié)構(gòu)牢固得足以阻止細(xì)胞漏出，同時(shí)能讓基質(zhì)滲入和產(chǎn)物擴(kuò)散。這種方法與交聯(lián)法和粘合法的區(qū)別，在于生物催化劑本身不和凝膠本體或膜聯(lián)結(jié)。這種方法已廣泛應(yīng)用于截留各種生物大分子、整細(xì)胞以及大小不同、性質(zhì)相異的細(xì)胞器。4.常用的固定化酶載體材料固定化酶載體材料的性能要求

固定化酶載體材料

固定化酶載體材料的性能要求載體材料對(duì)固定化酶的性質(zhì)影響非常大。盡管到目前為止，人們沒(méi)有找到一種合適的材料可以擔(dān)當(dāng)起所有的固定化載體，但是材料的下述性能可作為選擇合適的酶載體材料時(shí)的考察要點(diǎn)。(1)功能基團(tuán)：一般來(lái)說(shuō)，載體材料帶有能與酶發(fā)生反應(yīng)的官能團(tuán)，如帶有-OH、-COOH、-CHO等反應(yīng)性基團(tuán)，則可大大提高載體材料與酶之間的結(jié)合力，同時(shí)亦可提高固定化酶的操作性和穩(wěn)定性。

(2)滲透性和比表面積：好的載體材料應(yīng)具有大的比表面積和多孔結(jié)構(gòu)，因?yàn)榫哂羞@樣結(jié)構(gòu)的載體材料易和酶相交聯(lián)，并可提高固定化率。(3)溶解性：一般來(lái)說(shuō)，載體材料要求是不溶于水的。這不僅可以防止酶失活，還可以防止酶受到污染。

(4)機(jī)械剛性及穩(wěn)定性：這些對(duì)載體材料非常重要，由于固定化酶的一個(gè)最大的特點(diǎn)是要能重復(fù)使用，這就要求載體材料的機(jī)械剛性和穩(wěn)定性都非常好。(5)組成和粒徑：一般來(lái)說(shuō)，材料的孔徑越小，其比表面積就越大，與自由酶固定化程度就越高，固定化率也就越高。

(6)對(duì)微生物的抵抗性：在長(zhǎng)時(shí)間的使用中，載體材料必須要能防止微生物的降解作用，對(duì)微生物抵抗性好的載體材料可以長(zhǎng)時(shí)間的使用。(7)經(jīng)濟(jì)性和環(huán)保：來(lái)源經(jīng)濟(jì)、豐富，無(wú)毒、可降解。

固定化酶載體材料

從載體材料的組成來(lái)看，固定化酶所使用的載體可以分為高分子載體、無(wú)機(jī)載體、復(fù)合載體以及新型載體等。高分子載體高分子載體又可以分為天然高分子載體和合成高分子載體材料。天然高分子載體材料天然高分子載體材料如結(jié)構(gòu)性蛋白(角質(zhì)、膠原蛋白)、球狀蛋白以及碳水化合物由于原料易得，都比較適合擔(dān)當(dāng)酶的載體材料。此類(lèi)材料最大的特點(diǎn)是無(wú)毒性，傳質(zhì)性能好。研究得較多的載體是殼聚糖和海藻酸鈉。由于天然高分子材料存在強(qiáng)度較低，在厭氧條件下易被微生物所分解，使用壽命較短，而且天然高分子材料原料來(lái)源往往受產(chǎn)地所限，這在一定程度上限制了其應(yīng)用。合成有機(jī)高分子材料合成有機(jī)高分子材料由于其化學(xué)、物理性能都有很大的可變性，從理論上來(lái)說(shuō)，可以擔(dān)當(dāng)任何一種酶的固定化載體，而且它們對(duì)微生物的腐蝕也有較強(qiáng)的抵抗力。另外，與天然高分子材料相比，合成有機(jī)高分子凝膠載體還有強(qiáng)度較大的優(yōu)點(diǎn)。無(wú)機(jī)載體無(wú)機(jī)載體具有一些有機(jī)材料不具備的優(yōu)點(diǎn)，如穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度高、對(duì)微生物無(wú)毒性、不易被微生物所分解、耐酸堿、成本低、壽命長(zhǎng)等。常見(jiàn)的無(wú)機(jī)載體材料有玻璃、硅凝膠、鋁、蒙脫土等。復(fù)合載體

復(fù)合載體是以有機(jī)材料和無(wú)機(jī)材料復(fù)合組成的新載體材料。如磁性高分子微球，其內(nèi)部含有磁性金屬或金屬氧化物的超細(xì)粉末，從而具有磁響應(yīng)性。

磁性高分子微球可以通過(guò)共聚、表面改性等化學(xué)反應(yīng)在微球表面引入多種反應(yīng)性功能基團(tuán)，也可以通過(guò)共價(jià)鍵來(lái)結(jié)合酶、細(xì)胞、抗體等生物活性物質(zhì)，在外加磁場(chǎng)的作用下，進(jìn)行快速運(yùn)動(dòng)或分離。與其他載體材料相比，磁性高分子微球作為固定化載體具有從反應(yīng)體系中易分離和回收、操作簡(jiǎn)便、成本較低等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。新型載體

設(shè)計(jì)新型載體并結(jié)合當(dāng)代高新技術(shù)，是固定化酶研究的一個(gè)新方向。如導(dǎo)電聚合物作為酶固定化載體時(shí)可用于酶電極類(lèi)生物傳感器的制備。當(dāng)光敏性單體聚合物包埋固定化酶或帶光敏性基團(tuán)的載體共價(jià)固定化酶時(shí)，反應(yīng)條件溫和，固定化酶的酶活力較高。主要講授內(nèi)容一、固定化酶(細(xì)胞)的制備二、固定化酶(細(xì)胞)的性質(zhì)和指標(biāo)三、固定化酶和固定化細(xì)胞的反應(yīng)器四、酶工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用二、固定化酶(細(xì)胞)的性質(zhì)和指標(biāo)1.固定化后酶活力的改變

2.固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響3.固定化酶的最適溫度變化4.固定化酶的最適pH變化5.固定化酶的米氏常數(shù)(Km)變化6.固定化酶(細(xì)胞)的指標(biāo)

游離的酶經(jīng)固定化后，酶本身的結(jié)構(gòu)會(huì)受到影響。主要是由于它的催化作用由均相轉(zhuǎn)到非均相，由此帶來(lái)的擴(kuò)散限制效應(yīng)、空間障礙、載體的分配效應(yīng)等因素必然影響到酶的性質(zhì)。1.固定化后酶活力的改變?cè)诙鄶?shù)情況下，酶固定化后的活力比天然酶小，其專(zhuān)一性也會(huì)發(fā)生改變。例如，用羧甲基纖維素做載體固定的胰蛋白酶，對(duì)高分子底物酪蛋白只顯示原酶活力的30％；而對(duì)低分子底物苯酞精氨酸—對(duì)硝基酰替苯胺的活力保持80％。所以，一般認(rèn)為高分子底物受到空間位阻的影響比低分子底物大。在相同測(cè)定條件下，一般固定化酶的活力低于等摩爾原酶的活力。其原因可能是：①酶分子在固定化過(guò)程中，空間構(gòu)象會(huì)有所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸；②固定化后，酶分子空間自由度受到限制(空間位阻)，會(huì)直接影響到活性中心對(duì)底物的定位作用；③內(nèi)擴(kuò)散阻力使底物分子與活性中心的接近受阻；④包埋時(shí)酶被高分子物質(zhì)半透膜包圍，大分子底物不能透過(guò)膜與酶接近。也有例外酶在固定化后反而比原酶活力提高，原因可能是偶聯(lián)過(guò)程中酶得到化學(xué)修飾，或固定化過(guò)程提高了酶的穩(wěn)定性。1.固定化后酶活力的改變2.固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響3.固定化酶的最適溫度變化4.固定化酶的最適pH變化5.固定化酶的米氏常數(shù)(Km)變化6.固定化酶(細(xì)胞)的指標(biāo)

2.固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響穩(wěn)定性關(guān)系到固定化酶能否實(shí)際應(yīng)用。在大多數(shù)情況下，酶經(jīng)過(guò)固定化后其穩(wěn)定性都有所增加，這是十分有利的。具體表現(xiàn)：熱；有機(jī)試劑及酶抑制劑；pH、蛋白酶、貯存和操作條件

的穩(wěn)定性。（1）熱穩(wěn)定性提高

作為生物催化劑，酶也和普通化學(xué)催化劑一樣，溫度越高，反應(yīng)速度越快。但是大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)組成的，一般對(duì)熱不穩(wěn)定。因此，不能在高溫條件下進(jìn)行反應(yīng)，而固定化酶耐熱性提高，使酶最適溫度提高，酶催化反應(yīng)能在較高溫度下進(jìn)行，加快反應(yīng)速度，提高酶作用效率。(2)對(duì)有機(jī)試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高酶經(jīng)過(guò)固定化后，提高了對(duì)各種有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性，使本來(lái)不能在有機(jī)溶劑中進(jìn)行的酶反應(yīng)成為可能。可以預(yù)計(jì)，今后固定化酶在有機(jī)合成中的應(yīng)用會(huì)進(jìn)一步發(fā)展。(3)對(duì)pH、蛋白酶、貯存和操作條件

的穩(wěn)定性提高

固定化酶穩(wěn)定性提高的原因可能有：①固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接，可防止酶分子伸展變形；②酶活力的緩慢釋放；③抑制酶的自降解。將酶與固態(tài)載體結(jié)合后，由于酶失去了分子間相互作用的機(jī)會(huì)，從而抑制了降解。1.固定化后酶活力的改變2.固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響3.固定化酶的最適溫度變化

4.固定化酶的最適pH變化5.固定化酶的米氏常數(shù)(Km)變化6.固定化酶(細(xì)胞)的指標(biāo)3.固定化酶的最適溫度變化酶反應(yīng)的最適溫度是酶熱穩(wěn)定性與反應(yīng)速度的綜合體現(xiàn)。由于固定化后，酶的熱穩(wěn)定性提高，所以最適溫度也隨之提高，這是非常有利的結(jié)果。

1.固定化后酶活力的改變2.固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

3.固定化酶的最適溫度變化4.固定化酶的最適pH變化

5.固定化酶的米氏常數(shù)(Km)變化6.固定化酶(細(xì)胞)的指標(biāo)

4.固定化酶的最適pH變化酶的催化能力對(duì)外部環(huán)境特別是pH非常敏感。酶固定化后，對(duì)底物作用的最適pH和酶活力-pH曲線(xiàn)常常發(fā)生偏移。曲線(xiàn)偏移的原因是微環(huán)境表面電荷性質(zhì)的影響。

一般說(shuō)來(lái)，用帶負(fù)電荷載體(陰離子聚合物)制備的固定化酶，其最適pH較游離酶偏高。原因的解釋這是因?yàn)槎嗑坳庪x子載體會(huì)吸引溶液中陽(yáng)離子，包括H+，使其附著于載體表面，結(jié)果使固定化酶擴(kuò)散層H+濃度比周?chē)耐獠咳芤焊?，即偏酸，這樣外部溶液中的pH必須向堿性偏移，才能抵消微環(huán)境作用，使其表現(xiàn)出酶的最大活力。反之，帶正電荷載體(陽(yáng)離子聚合物)制備的固定化酶，其最適pH較游離酶偏低。使用帶正電荷的載體其最適pH向酸性偏移。1.固定化后酶活力的改變2.固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

3.固定化酶的最適溫度變化4.固定化酶的最適pH變化5.固定化酶的米氏常數(shù)(Km)變化6.固定化酶(細(xì)胞)的指標(biāo)5.固定化酶的米氏常數(shù)變化固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km隨載體的帶電性能有一定的變化。當(dāng)酶結(jié)合于電中性載體時(shí)，由于擴(kuò)散限制造成表觀Km上升；但是帶電載體和底物之間的靜電作用會(huì)引起底物分子在擴(kuò)散層和整個(gè)溶液之間不均一分布。由于同性電荷相排斥、異性電荷相吸引。與載體電荷性質(zhì)相反的底物在固定化酶微環(huán)境中的濃度比整體溶液中的高，與溶液酶相比，固定化酶的表觀Km值低于溶液的Km值；而載體與底物電荷相同，則會(huì)造成固定化酶的表觀Km值顯著增加。由于高級(jí)結(jié)構(gòu)變化及載體影響引起酶與底物親和力變化，從而使Km變化。這種Km變化又受溶液中離了強(qiáng)度影響。離子強(qiáng)度升高，載體周?chē)撵o電梯度逐漸減小，Km變化也逐漸縮小以至消失。1.固定化后酶活力的改變2.固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

3.固定化酶的最適溫度變化4.固定化酶的最適pH變化5.固定化酶的米氏常數(shù)(Km)變化6.固定化酶(細(xì)胞)的指標(biāo)6.固定化酶(細(xì)胞)的指標(biāo)游離酶制備成為固定化酶后，其催化功能也由原來(lái)的均相體系反應(yīng)變?yōu)楣獭合嗖痪环磻?yīng)，酶的催化性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變。因此制備固定化酶(細(xì)胞)后，必須考察它的性質(zhì)。常用的評(píng)估指標(biāo)包括固定化酶(細(xì)胞)的活力、固定化酶(細(xì)胞)的偶聯(lián)率以及相對(duì)活力、固定化酶(細(xì)胞)的半衰期以及熱穩(wěn)定性。固定化酶(細(xì)胞)的活力

指固定化酶(細(xì)胞)催化某一特定化學(xué)反應(yīng)的能力，其大小可用在一定條件下它所催化的某一反應(yīng)的反應(yīng)初速度來(lái)表示。固定化酶(細(xì)胞)的單位可定義為每毫克干重固定化酶(細(xì)胞)每分鐘轉(zhuǎn)化底物(或生產(chǎn)產(chǎn)物)的量，表示為μmol/(min·mg)。與游離酶相仿，表示固定化酶的活力一般要注明下列條件：溫度、攪拌速度、固定化酶的干燥條件；固定化的原酶含量或蛋白質(zhì)含量用于固定化酶的原酶的比活力。固定化酶的活力回收固定化酶的活力回收是指固定化后的固定化酶(或細(xì)胞)所顯示的活力占被固定的等當(dāng)量游離酶(細(xì)胞)總活力的百分?jǐn)?shù)。固定化酶的活力回收計(jì)算公式如下：

活力回收=

固定化酶總活力／(加入酶的總活力—上清液中未偶聯(lián)酶活力)×100％固定化酶通常呈顆粒狀所以一般測(cè)定溶液酶活力的方法要