人脂肪細(xì)胞因子CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建與研究,病理學(xué)論文

人脂肪細(xì)胞因子CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建與研究,病理學(xué)論文C1qTNF相關(guān)蛋白(C1qTNF-relatedprotein,CTRP)從屬脂肪細(xì)胞因子家族,現(xiàn)已確定這個家族有15個成員。華而不實(shí)的脂聯(lián)素已經(jīng)具有將近20年的研究歷史,在肥胖、II型糖尿病發(fā)生、胰島素抑制,以及在由肥胖引起的慢性炎癥發(fā)生經(jīng)過中具有重要的作用,當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn),在代謝與炎癥的穿插領(lǐng)域中,CTRP家族發(fā)揮了非常重要的作用。CTRP4(C1qTNF-relatedprotein4)是CTRP脂肪細(xì)胞因子家族成員之一,由本室與國家基因組北方中心利用反向生物學(xué)的方式方法,通過DLR(dualluciferasereportassay)平臺挑選出的對NF-B通路具有明顯活化作用的一個功能未知的新基因。我們于2018年初次在國際上進(jìn)行了報道。前期的研究發(fā)現(xiàn)人CTRP4重組蛋白在肝癌細(xì)胞系HepG2中能夠上調(diào)IL-6、TNF的表示出,促進(jìn)STAT3的磷酸化。還能夠提高HepG2對化療藥的抵抗,促進(jìn)細(xì)胞的克隆構(gòu)成。我們體外研究已經(jīng)證明CTRP4具有多種重要功能,進(jìn)一步研究該分子在體內(nèi)的生理功能及病理作用是特別必要的。為了更深切進(jìn)入研究CTRP4體內(nèi)的作用和機(jī)制,我們構(gòu)建了人CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠,并進(jìn)行了鑒定,結(jié)果表示清楚轉(zhuǎn)基因鼠的構(gòu)建是成功的。1、材料和方式方法1.1實(shí)驗(yàn)動物CTRP4的轉(zhuǎn)基因小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所【SCXK(京)2018-0004】。小鼠品系:C57BL/6J,使用級別為SPF級。用于交配的C57BL/6J小鼠均購自維通利華公司【SCXK(京)2018-0012】,遺傳背景為外表分子CD45.2陽性。動物飼養(yǎng)環(huán)境:SPF級,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物部【SYXK(京)2018-0039】。1.2實(shí)驗(yàn)試劑限制性內(nèi)切酶XbaI、XhoI等購自TaKaRa公司,KpnI等購自NEB公司;RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit購自Fermentas公司;基因特異性引物由北京擎科生物公司合成;硝酸纖維素膜(NC膜)購自Amersham-Pharmaciabiotech公司;IRDTMye800-偶聯(lián)的抗鼠或抗兔的IgG二抗購自LICORBioscience公司;聚丙烯酰胺凝膠電泳Marker購自Fermentas;2TAQPCRMASTERMIX購自博邁德公司;RIPA裂解液、PMSF購自碧云天公司;鼠尾裂解液配方:1mol/LTris-HCl5mL;0.5mol/LEDTA2.5mL;NaCl5.844g;10%SDS25mL。1.3轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建真核細(xì)胞表示出質(zhì)粒pcDNA3.1-CTRP4-Myc/His由本室構(gòu)建,pCAGGS質(zhì)粒由美國Vanderbilt大學(xué)吳冠青教授饋贈。克隆方案中,上下游引物詳細(xì)序列分別為:CTRP4-PCAGGS-F:5-CCGCTCGAGATGCTGCCGCTTCTGCT-3CTRP4-PCAGGS-R:5-CCGCTCGAGTCAATGATGATGATGATG-3。1.4轉(zhuǎn)基因鼠的制備:選用性成熟的野生型C57BL/6J雌性小鼠。腹腔依次注射孕馬血清(50U/mL,0.1mL)及人絨毛膜促性腺激素(50U/mL,0.1mL),置于單籠飼養(yǎng)的正常雄性小鼠籠內(nèi),取有精栓雌性小鼠輸卵管。受精卵置顯微鏡注射平臺M2液滴內(nèi),選有原核的受精卵為注射對象,用顯微鏡操作儀將有目的基因的線性化片段注入小鼠受精卵雄性原核中,再移植到6周齡ICR孕母鼠輸卵管中,待其發(fā)育后產(chǎn)仔。此項(xiàng)工作由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所完成。1.5鼠尾基因組DNA提取剪取鼠尾0.5cm左右,用500L含有0.1mg/mL蛋白酶K的鼠尾裂解液55℃裂解過夜,之后參加300L飽和NaCl冰浴15min,12000r/min轉(zhuǎn)速室溫離心15min,收上清后參加700L異丙醇顛倒混勻直至構(gòu)成絮狀沉淀,12000r/min室溫離心15min后棄上清參加70%乙醇洗滌沉淀,棄乙醇,晾干。50L水65℃溶解沉淀得鼠尾基因組DNA。1.6PCR鑒定CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠以2.5中所述提取的鼠尾基因組DNA為模板,利用pCAGGS載體的啟動子序列chicken-actin的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在10LPCR體系中參加:2PCRMix5L,ddH2O4L,PCR上下游引物各0.2L,模板DNA0.6L。反響條件為:94℃變性5min,進(jìn)入循環(huán)(94℃變性30s,退火58℃,30s,延伸72℃,30s)。共35個循環(huán),最后一個循環(huán)在72℃延伸10min,4℃保存。上游引物為:5-CCCATAGTAACGCCAATAGG-3下游引物為5-GGGAGAGTGAAGCAGAACG-3。取5LPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。1.7轉(zhuǎn)基因小鼠各個組織蛋白的提取分離小鼠各器官組織,每種組織取100mg,用500L的RIPA裂解液勻漿20s后冰上裂解30min,隨后4℃離心,12000r/min,20min,汲取上清,BCA定量法對裂解液進(jìn)行蛋白定量。1.8westernblot檢測CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠各個組織的表示出收集上一步的組織勻漿液上清,參加SDS加樣緩沖液,99℃加熱10min,經(jīng)12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳分離蛋白樣品后,將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,5%脫脂牛奶封閉2h后,用TBS-T以1∶800比例配置CTRP4一抗,將膜與抗體封入雜交袋中,4℃過夜,之后用TBS-T洗膜三次,每次10min,再參加相應(yīng)的IRDyeTM800/700標(biāo)記的二抗避光反響1h,TBS-T重復(fù)洗膜三次,最后用OdysseyImagingSystem儀器掃描成像分析。1.9CTRP4轉(zhuǎn)基因動物繁衍及純合子挑選1.9.1轉(zhuǎn)基因小鼠F1代的繁衍我們將CTRP4轉(zhuǎn)基因鼠首建鼠(Founder)(雄性5只,雌性8只)分別與育齡期的野生型C57BL/6J小鼠交配,交配大約兩周之后觀測小鼠腹部并用指揉法判定小鼠的胚胎情況,假如證實(shí)確已受孕,即把雌鼠分籠。小鼠一代生育的子鼠在6~12只左右,在F1代小鼠出生12d左右對小鼠編號并鑒定小鼠的基因型,得到CTRP4雜合子轉(zhuǎn)基因小鼠,在4周時將新生小鼠離乳。1.9.2F2代轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育用F1代鑒定陽性的CTRP4雜合子小鼠進(jìn)行近親交配,即同窩陽性小鼠的雌雄交配,根據(jù)最適的雌雄比例(雄:雌=1:2)進(jìn)行,編號及鑒定方式方法同F(xiàn)1代。1.9.3F2轉(zhuǎn)基因純合子小鼠的挑選根據(jù)孟德爾遺傳定律,F2代小鼠中有一定概率出現(xiàn)純合子,因而通過測交的方式方法來挑選F2代中的純合子小鼠,即把得到的每一只CTRP4陽性F2代小鼠與野生型的C57BL/6J小鼠進(jìn)行交配,通過子代小鼠判定F2代小鼠能否為純合子,假如子代小鼠經(jīng)過PCR鑒定100%為CTRP4陽性,則表示清楚親代小鼠為純合子小鼠,否則為雜合子小鼠。PCR鑒定方式方法同1.6中所述。陰性鼠的來源:F1代小鼠中的陰性小鼠進(jìn)行交配,并大量繁衍,進(jìn)而得到用于實(shí)驗(yàn)對照的陰性小鼠。2、結(jié)果2.1轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建以1.3中所述真核表示出質(zhì)粒pcDNA3.1-CTRP4-Myc/His為模板,以pCAGGS質(zhì)粒為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建,pCAGGS-CTRP4質(zhì)粒的構(gòu)建方案基本經(jīng)過如下:設(shè)計(jì)包含Xho1酶切序列的CTRP4基因特異性引物(即如1.3中所述引物),以pcDNA3.1-CTRP4-Myc/HisB(-)質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增得到的片段連同真核表示出載體pCAGGS采用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離,切膠回收目的條帶?；厥盏妮d體和PCR片段用T4DNA連接酶連接,16℃,12h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1-BLUE中,使用LA(Amp抗性)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)14~16h,挑取克隆擴(kuò)增培養(yǎng),提質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。鑒定能否有插入片段、插入片段的大小、片段插入的方向。對符合目的要求的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒測序,測序結(jié)果與NCBI標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫中的CTRP4CDS序列進(jìn)行比對,準(zhǔn)確無誤后進(jìn)行質(zhì)粒大量提取,最終所得質(zhì)粒構(gòu)造如此圖1所示。質(zhì)粒線性化,定量除菌后提供應(yīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所制作轉(zhuǎn)基因小鼠。2.2轉(zhuǎn)基因小鼠的繁衍與鑒定通過首建鼠和野生型C57BL/6J小鼠交配,得到F1代小鼠135只,經(jīng)觀察雌雄比例并沒有異常,通過1.5和1.6中所述鑒定方式方法對F1代小鼠進(jìn)行鑒定,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,最終鑒定有30只陽性小鼠。以首建鼠66號為例。如此圖1A所示,66號小鼠所生子代(F1代)12只小鼠的PCR鑒定結(jié)果顯示,1號和6號為陽性鼠。隨后我們選擇F1代小鼠同窩并且至少有1只雄性,1只雌性的小鼠進(jìn)行同窩交配,最終我們挑選出4窩小鼠進(jìn)行繁衍,以華而不實(shí)一窩F1代小鼠為例,如此圖1B所示,其生產(chǎn)的7只小鼠中1號和6號為陽性。經(jīng)過上述繁衍我們總共獲得28只陽性F2代小鼠。通過1.9.3中所述測交方式方法鑒定,得到兩個品系純合子轉(zhuǎn)基因小鼠共8只。以華而不實(shí)一系純合子小鼠鑒定結(jié)果為例,圖1C中所示結(jié)果,F2代4號小鼠與野生型小鼠交配生成的7只F3代小鼠均為陽性,證實(shí)該轉(zhuǎn)基因小鼠為純合子。2.3CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)表示出的鑒定為了驗(yàn)證外源CTRP4在小鼠體內(nèi)的表示出水平,我們?nèi)TRP4純合子小鼠的心臟,肝,腦,腎等組織進(jìn)行勻漿處理后westernblot檢測CTRP4表示出水平,同時取同窩陰性小鼠相應(yīng)組織作對照,CTRP4純合子小鼠表示出水平在各組織中明顯高于同窩陰性小鼠。2.4CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠血生化分析結(jié)果CTRP4作為潛在的脂肪因子,很可能對機(jī)體的血糖血脂等具有調(diào)控作用。為了驗(yàn)證這種猜想,我們對CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了血生化檢測,包括血糖,膽固醇和甘油三酯三項(xiàng),結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)血清膽固醇和血糖水平相對較低,如表1所示。2.5CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠體重曲線,脂肪比例與脂肪形態(tài)CTRP家族成員中有半數(shù)以上是脂肪因子,根據(jù)當(dāng)前研究表示清楚,脂肪因子有可能對機(jī)體體重、脂肪組織占體重比例以及脂肪細(xì)胞大小發(fā)揮一定的影響。為了檢測CTRP4能否具有類似的作用,我們檢測了CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠自出生后16周的體重變化,同時測量了其脂肪比例,觀察了脂肪HE染色結(jié)果。在正常飲食條件下,上述指標(biāo)均沒有明顯變化。3、討論脂肪細(xì)胞因子是一類在肥胖和由肥胖誘導(dǎo)的慢性炎癥經(jīng)過中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子,通過對代謝調(diào)控通路、炎癥信號通路、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等進(jìn)行調(diào)節(jié),在多種生理及病理經(jīng)過中發(fā)揮重要作用。近20年來,脂肪因子越來越遭到人們的關(guān)注,通過對脂肪因子的研究,人們逐步對代謝的調(diào)節(jié)、肥胖、II型糖尿病、炎癥的關(guān)系有了更深一步的認(rèn)識。CTRP家族是當(dāng)前脂肪因子研究領(lǐng)域中被廣泛關(guān)注的一類分子,包括脂聯(lián)素在內(nèi)已有16個成員被發(fā)現(xiàn),華而不實(shí)大部分成員均已有功能研究報道,脂聯(lián)素在肥胖,胰島素抵抗和由肥胖介導(dǎo)的慢性炎癥經(jīng)過中的重要作用已經(jīng)被確認(rèn)。該家族主要特征是具有N端膠原樣構(gòu)造域和C端C1q球狀構(gòu)造域。CTRP4是該家族中較為特殊的一個成員,它并不具有N端膠原樣構(gòu)造域,同時,它是唯逐一個具有兩個C1q構(gòu)造域的成員。這一構(gòu)造上的特殊性也提示我們,CTRP4在該家族中或許有較為特殊的地位。NF-B在細(xì)胞炎癥信號的誘發(fā)和調(diào)節(jié)中具有核心作用。在固有免疫系統(tǒng)辨別病原形式