第二章 發(fā)酵工業(yè)菌種選育及保藏

第二章

菌種選育、保藏與復(fù)壯2.1菌種選育目的

提高生產(chǎn)能力

提高產(chǎn)品質(zhì)量

開發(fā)新產(chǎn)品

解決生產(chǎn)實際問題

防止菌種退化方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程基因的直接進化：點突變、易錯PCR、同序法DNA、Shuffling等一、菌種的來源根據(jù)資料直接向有關(guān)科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買。從大自然中分離篩選新的微生物菌種。二、從自然界分離篩選新種的步驟定方案：采樣：增殖：分離：純種分離和篩選性能鑒定：菌種鑒定、發(fā)酵性能測定、毒性試驗。土樣采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；水田等浸水土壤在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴格，可取離地面5～15cm處的土。將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根際土樣時，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量無菌水中浸漬約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這部分上卻為根際土樣。植物體采集方法

在采集葉面時，一般是用滅菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊，并注意不要損傷周圍邊緣。選擇葉面時應(yīng)考慮葉位、葉齡、葉片正反面和在一片葉上的取樣部位。采集植物根及根系時，方法與根際土樣采集方法相似。將洗凈的根裝入采樣袋中，采集根系時，一般與根際土樣一起保存。

水樣采集方法用于細菌檢測的水樣應(yīng)收集于100mL干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。由于表層水中含有泥沙，故在采樣時應(yīng)在較深的靜水層中采集水樣。方法是：握住采樣瓶底浸入水中30-50cm處，然后瓶口朝下打開瓶蓋，讓水樣進入。如果有急流存在的話，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。采集瓶從水中取出時應(yīng)迅速并帶有較大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶。所有水樣都應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進行檢測，或者4℃下貯存。1.稀釋平皿分離法1.稀釋平皿分離法100ml1g/mL9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀釋1.稀釋平皿分離法b.涂布平皿分離法傾注平皿分離法2.平皿劃線分離法

a.連續(xù)劃線分離法b.分區(qū)劃線分離法1.概念：是利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)變異，通過分離、篩選、排除劣質(zhì)形狀的菌株，選擇出維持原有生產(chǎn)水平或具有更優(yōu)良生產(chǎn)性能的高產(chǎn)菌株。自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機率為10-8～10-9。三、菌種選育（一）自然選育2.導(dǎo)致菌種退化變異的原因：（1）遺傳基因型的分離（2）自發(fā)變異的產(chǎn)生（3）人工誘變導(dǎo)致的退化變異。3.自然選育操作步驟：

一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細胞(孢子)懸液的制備平板分離挑選單菌落(注意形態(tài)的觀察)發(fā)酵試驗（二）、誘變育種1.概念：用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進行的篩選，稱為誘變育種。2.誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑誘變劑物理在：紫外，快中子化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍{（2）、誘變劑處理過程中幾個有關(guān)的問題化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點誘變劑量的選擇誘變劑的選擇出發(fā)菌株的選擇（1）、誘變劑的作用原理亞硝酸：0.07MNa2HPO4亞硝基胍：1MNaOH（3）誘變劑的選擇堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復(fù)突變率高，效果不大。亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”。甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。3、誘變育種的一般步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選(1)出發(fā)菌株的選擇自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達到好的效果。在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。出發(fā)菌株開始時可以同時選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復(fù)處理會使細胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細胞，就要選對數(shù)期的細胞；有的作用于休止期，就可選用孢子。

(2)處理菌懸液的制備關(guān)鍵是制備單細胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。帶玻璃珠的三角瓶內(nèi),加無菌水(3)誘變處理

根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對象的實際，設(shè)計誘變處理方案。

(4)中間培養(yǎng)由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程，即細胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。此過程稱為中間培養(yǎng)這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。

方法：讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細胞繁殖幾代，以得到純的變異細胞。若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。(5）分離和篩選篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復(fù)篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細比較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。搖床復(fù)篩降解纖維素產(chǎn)生產(chǎn)透明圈病毒產(chǎn)生產(chǎn)空斑一、紫外線的誘變育種

紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長為2537A．燈與處理物的距離為15～30cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在70～80%為宜。舉例

被照射的菌懸液細胞數(shù)，細菌為106個/ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為106～107個

/ml。由于紫外線穿透力不強，要求照射液不要太深，約0.5～1.0cm厚，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進行。

操作步驟

1．將細菌培養(yǎng)液以3000r／min離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。

2．將菌懸液放入一已滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細胞液含細胞數(shù)可達108個／ml左右，作為待處理菌懸液。

3．取2～4m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應(yīng)先開紫外線10min，讓紫外燈預(yù)熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射10～50s。操作均應(yīng)在紅燈下進行，或用黑紙包住，避免白熾光。

4．取未照射的制備菌液和照射菌液各0.5ml進行稀釋分離，計數(shù)活菌細胞數(shù)。

5．取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120r／min振蕩培養(yǎng)4～6h。

6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。

7．挑取菌落進行篩選。二、亞硝基胍誘變曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強烈的誘變作用。精確作用機制尚不清，據(jù)認為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細胞內(nèi)的DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。

操作步驟

1．單孢子懸液制備取斜面，加入6ml0.1mol／LpH6.o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液。

2．MNNG溶液的制備用分析天平稱取2mg，加入2ml0.1mol／LpH6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。

3．誘變處理吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子懸液中，30℃振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-4兩個稀釋度分離培養(yǎng)，30℃3天后計數(shù)。

4．死亡率計算將未處理的孢子液1ml加入1ml磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離，30℃下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計算出死亡率。

5．挑取菌落進行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選．（三）營養(yǎng)缺陷型的選育營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。對應(yīng)的是野生型。1.與篩選營養(yǎng)缺陷型有關(guān)的三類培養(yǎng)基①基本培養(yǎng)基（M．M．minimal

medium）②補充培養(yǎng)基（S．M．

supplementalmedium）③完全培養(yǎng)基（C．M．

completemedium）2.篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜誘變方法物理誘變化學(xué)誘變淘汰野生型抗生素法：將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時間讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于休眠狀態(tài)。細菌或酵母對一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。菌絲過濾法：對于霉菌，孢子生長后會長出菌絲體，用濾紙過濾法將菌絲濾去，缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。

檢出缺陷型原理：缺陷型在CM上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能生長。具體方法：影印法、點種法、夾層法將一較平皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。將完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落印在絲絨上，使之成為印模，標記方位。將MM平皿和CM平皿在標記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復(fù)印于上。

(1)影印法恒溫箱中培養(yǎng)。二平皿相同方位進行比較，可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長出的菌落少于CM平板。MM上未長而相應(yīng)于CM上長出的那幾個菌落就可能是缺陷型。要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應(yīng)有一定間隔。

(2)點種法任意法。用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩平板上接種，依次在相應(yīng)位置點種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況。結(jié)果明確，但工作量大。

(3)夾層法先在培養(yǎng)皿上倒一層MM，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標記，然后倒上一層CM，再培養(yǎng)。第二批長出的菌落可能是缺陷型。缺點:結(jié)果有時不明確，將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。營養(yǎng)缺陷型生長譜的確定

驗證確定是缺陷型后，需確定其缺陷的因子，即生長譜測定。生長譜測定的方法將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細胞懸液，與MM瓊脂培養(yǎng)基混合并傾注平皿。凝固后，分別在平皿的5～6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或其濾紙圓片。培養(yǎng)后會在某組合區(qū)長出菌落，就可測得所需營養(yǎng)。缺陷型的濃縮：①抗生素法原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生長著的微生物細胞，對休止態(tài)細胞無作用。方法：將菌培養(yǎng)在含抗生素的MM基中②菌絲過濾法適用于：絲狀（放線菌、霉菌）原理：基本培養(yǎng)基上只有發(fā)育成菌絲；auxo孢子可通過濾膜，野生型菌絲不能通過。①逐個檢出法：（3）檢出營養(yǎng)缺陷型：②影印實驗（replicaplating）JoshuaLederbergandEstherLederberg（1952）③夾層培養(yǎng)法①生長譜法方法簡便；回變和污染不影響結(jié)果測定物質(zhì)可為粉末或紙片（4）鑒定營養(yǎng)缺陷型：測定一般應(yīng)分兩階段：第一階段：測定是哪類物質(zhì)的缺陷型；第二節(jié)段：根據(jù)第一階段確定的范圍，進一步確定是哪種具體化合物的缺陷型；（四）基因育種基因重組育種：是運用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細菌質(zhì)粒或其他載體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細胞并使其在新的宿主細胞系統(tǒng)內(nèi)進行復(fù)制和表達，或者通過細胞間的相互作用，使一個細胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另一個細胞的方法。一個完整的基因克隆過程包括以下步驟１、獲得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因與載體在體外連接；３、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞；４、篩選、鑒定陽性重組子；５、重組子的擴增與／或表達。基因重組（五）原生質(zhì)體育種

1.原生質(zhì)體融合育種的特點(1)雜交頻率較高：(2)受接合型或致育型的限制較?。?3)遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：

(4)存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性。（5）有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株。

(6)提高菌株產(chǎn)量的潛力較大。

(7)有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。2、原生質(zhì)體融合育種步驟（1）．標記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證。（2）．原生質(zhì)體制備。（3）．等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進融合。（4）．涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。（5）．選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證，挑取融合子進一步試驗、保藏。（6）．生產(chǎn)性能篩選。

3、原生質(zhì)體融合育種的要點（1）標記菌種的選擇采用常規(guī)誘變育種，篩選出營養(yǎng)缺陷型或／和抗藥性菌株。

(2)原生質(zhì)體的制備

在高滲壓溶液中加入細胞壁分解酶，將細胞壁分離剝離，剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細胞，它保持原細胞的一切活性。放線菌和細菌——溶菌酶；酵母和霉菌——蝸牛酶或纖維素酶。

影響原生質(zhì)體制備的因素菌體的前處理使酶作用的效果好一些。如細菌加入亞抑制劑量的青霉素。菌體的培養(yǎng)時間選擇增殖期的菌體。酶濃度

酶處理溫度滲透壓滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機物和KCl和NaCl等無機物。（3）原生質(zhì)體融合加入表面活性劑聚乙二醇，鈣、鎂離子等。（4）再生培養(yǎng)。（5）挑取融合子進一步試驗、保藏。（6）生產(chǎn)性能篩選。（六）雜交育種1.概念：是指兩個基因型不同的菌株通過接合或吻合使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選具有新性狀的菌株。2.雜交育種的目的：獲得新的具有優(yōu)良性狀的菌株3.雜交育種的程序（1）菌種準備原始親本：用來進行雜交的野生型菌株，遺傳基礎(chǔ)差別要大。直接親本菌株：直接用于進行配對的菌株，一般是原始親本經(jīng)誘變劑處理后得到的，常用的是營養(yǎng)缺陷型。（2）雜交育種方法（略）2.2菌種保藏與復(fù)壯理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件(1)

經(jīng)長期保藏后菌種存活健在；(2)

保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力。(3)菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)

(1)冷凍干燥或真空干燥保藏；

(2)超低溫或在液氮中冷凍保藏；(3)

轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?/p>

(4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。一、

冷凍保藏

冷凍，使微生物代謝活動停止。通常在培養(yǎng)物中加入冷凍保護劑。溫度-20℃以下。缺點：培養(yǎng)物運輸較困難。冷凍保藏種類

1、普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)2、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60~-80℃)3、液氮冷凍保藏技術(shù)（一）普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)貯藏于溫度范圍在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。維持微生物活力1—2年。注意：一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏；注意控制保藏溫度；密封。（二）.超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60—-80℃)長期保藏。具體方法：

(1)離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞；

(2)用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞；

(3)加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；

(4)分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。若干細菌和真菌菌種。保藏5年。（三）、液氮冷凍保藏技術(shù)

冷凍保護劑

二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。甘油一般高壓蒸汽滅菌，二甲亞砜過濾除菌。

復(fù)蘇1.迅速將安瓿置于37-40℃水浴中，并輕輕搖動以加速解；2.用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有無菌液體培養(yǎng)基的試管中，反復(fù)抽吸數(shù)次，取0.1-0.2ml轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。二

凍干保藏

原理：通過在減壓條件下使凍結(jié)的細胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。須使用冷凍保護劑：脫脂乳和蔗糖動物血清等。保藏10年之久。無需進行冷凍保藏，便于運輸。密封。培養(yǎng)物的凍干過程凍干菌種的保藏與再生1．保藏：低于5℃下保藏。較低的保藏溫度(-20～-70℃)對于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好。2．復(fù)蘇：啟用時，拿出安瓿瓶，酒精表面消毒，無菌條件打開，加入0.3—0.5mL新鮮液體培養(yǎng)基溶解，移至斜面或液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。三、其他保藏方法傳代保藏

礦物油中浸沒保藏

(一)、傳代保藏將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代，然后在一定的生長溫度下生長和保存的傳代保藏方法?？捎糜趯嶒炇抑腥舾删N的保藏。此法最為簡單和經(jīng)濟，且不要求任何特殊的設(shè)備。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變。因此要求在基本培養(yǎng)基上傳代為好，目的是能淘汰突變株；同時轉(zhuǎn)接菌量應(yīng)保持較低水平。斜面培養(yǎng)物應(yīng)在密閉容器中于5℃保藏，以防止培養(yǎng)基脫水并能降低代謝活性。此方法一般不適宜作工業(yè)生產(chǎn)菌種的長期保藏方法。(二）