哺乳動(dòng)物RNA提取

脯乳動(dòng)物RNA提取主講：劉玉潔AAAAAAtRNAmRNArRNARNase不同豐度組織名稱樣品量總RNA含量高豐度肝臟1mg2-4μg脾臟1mg心臟1mg中豐度大腦1mg0.05-2μg胚胎1mg腎臟1mg肺1mg低豐度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高豐度成纖細(xì)胞1050.5-1μg人白細(xì)胞105中豐度酵母1050.5-1.5μg擬南芥葉片1mg0.2-0.5μg低豐度煙草葉片1mg0.05-0.1μg玉米葉片1mgAAAAAA關(guān)于RNA的分布

總RNA

真核細(xì)胞的RNA主要分為：

1、mRNA:1-5%

起始密碼：AUG終止密碼：UAA,UAG,UGA。

5`鳥嘌呤7位甲基化—CH3修飾。

1）免受核酸酶破壞，

2）起始、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。

3`poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)20--200個(gè)A.翻譯所必需。

2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%

大亞基60S:28S=4718nt5S=120nt5.8S=160nt

小亞基40S:18S=1874nt方法1.異硫氰酸胍/苯酚法（TRIZOL）2.胍鹽/β-巰基乙醇法適用于大部分動(dòng)植物材料，但對(duì)于次生代謝產(chǎn)物較多的植物材料提取RNA效果較差適用于各種不同動(dòng)物材料和次生代謝物少的植物材料3.沉淀法4.介質(zhì)吸附：硅介質(zhì)·陰離子交換樹脂·磁珠原理1RNase抑制

因RNA分子較小，不易被機(jī)械張力拉斷，但極易被RNase降解，故而在提取過(guò)程中對(duì)RNase的抑制尤為重要。故過(guò)程中必須添加RNase抑制劑。如DEPC，異硫氰酸胍等。(RNase:核糖核酸酶)ABC破碎組織提取純化

鑒定分析破碎組織使用高濃度變性劑TRIZOL，可溶解蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與核酸分離，失活RNA酶得到RNA,DNA,蛋白質(zhì)，細(xì)胞碎片TRIZOL的組成※苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放?！?.1%的8－羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用?！惲蚯杷犭覍儆诮馀紕?，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離?！?巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。提取純化苯酚氯仿異丙醇乙醇DNA，蛋白質(zhì)沉淀到有機(jī)相RNA留在水相釋放出來(lái)的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而得以分離提取核酸沉淀RNA洗滌RNA鑒定分析1·瓊脂糖電泳檢測(cè)：觀察到RNA帶2·核酸濃度儀檢測(cè)（紫外光吸收法）：濃度=稀釋倍數(shù)×讀數(shù)純度：OD260／OD280=1.8~2.01.電泳：溶液中帶點(diǎn)顆粒在電場(chǎng)中朝著與其自身所帶電荷相反的方向移動(dòng)的現(xiàn)象。利用各RNA分子（帶負(fù)電荷）在電場(chǎng)中移動(dòng)速率的差異對(duì)其進(jìn)行鑒定。其速率與帶電量成正比，與分子大小成反比。2.核酸、核苷酸及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健系統(tǒng)(－C＝C一C＝C一)，能夠強(qiáng)烈吸收250~280nm波長(zhǎng)的紫外光。核酸的最大紫外吸收值在260nm處。遵照Lambert-Beer定律，可以從紫外光吸收值的變化來(lái)測(cè)定核酸物質(zhì)的含量。OD260=1,RNA=40μg／mlOD260／OD280小于1.75有蛋白質(zhì)或酚污染大于2.0有DNA污染提取方法2（一）準(zhǔn)備工作RNase酶非常穩(wěn)定，是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。它在一些極端的條件可以暫時(shí)失活，但限制因素去除后有迅速?gòu)?fù)性。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上。因此，在進(jìn)行與RNA有關(guān)的實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須戴手套。RNase的另一污染源是取液器，一般情況下用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部即可。料制品的處理：盡可能使用無(wú)菌、一次性的塑料制品玻璃和金屬物品的處理：250°C烘烤3小時(shí)以上（二）試劑準(zhǔn)備

1．TRIzol試劑2．氯仿3．異丙醇4．75%乙醇（0.1%DEPC配制）5．無(wú)RNase的水或0.5℅SDS（0.5%SDS溶液必須用由DEPC預(yù)處理、高壓滅菌的水）6.取新鮮小鼠肝臟組織，組織塊不宜過(guò)大,放在玻片上立即研磨,研磨要徹底。研磨后的組織（小米粒大小）（三）操作步驟1.細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞，每5~10×10?動(dòng)物細(xì)胞要加入1mlTRIzol，反復(fù)吸打。加入TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。2.將勻漿樣品在室溫（15~30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。3.加入0.2ml氯仿，輕微振蕩15秒（避免蛋白質(zhì)和DNA脫離導(dǎo)致DNA釋放到水相中），室溫靜置3分鐘。4.于2~8℃，12000r/min離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。

RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。5.把水相轉(zhuǎn)移到新管中（如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相），用異丙醇沉淀水相中的RNA。加入0.5ml(1mlTRIzol)異丙醇，室溫靜置10分鐘。6.于2~8℃，12000r/min離心10分鐘。離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，去上清。7）加1ml75%乙醇洗滌。8）7500rpm，4C離心1min，棄上清再離心幾秒鐘，將管壁液體完全移凈。在用TriZol試劑提取總RNA時(shí)，全程均在室溫進(jìn)行，當(dāng)RNA沉淀用水溶解后，應(yīng)該注意在冰上操作，而且盡可能快地進(jìn)入下一個(gè)環(huán)節(jié)。注意：75%乙醇的作用：不起沉淀作用，只是為了清洗管壁加入方法一定是貼管壁在沉淀的對(duì)側(cè)緩慢加入，不要攪動(dòng)沉淀瓊脂糖電泳檢測(cè)凝膠的制備：用1×TAE電泳緩沖液制作瓊脂糖凝膠，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠。樣品的制備與加樣：在超凈工作臺(tái)上，用移液器吸取總RNA樣品4μl于封口膜上。在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上再加入5μl1×TAE電泳緩沖液及1μl的10X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。電泳，染色及觀察：打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至100V，使RNA由負(fù)極向正極電泳，約30min后將凝膠放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射檢測(cè)儀上觀察RNA電泳結(jié)果。核酸濃度儀檢測(cè)取潔凈離心管甲乙兩支，分別準(zhǔn)確加入1.0mLRNA樣液，然后向甲管加入1.0mL蒸餾水，向乙管加入1.0ml過(guò)氯酸-鉬酸銨沉淀劑，搖勻后置冰箱內(nèi)30min，使沉淀完全。3000r/min離心10min，各吸取上清液0.5mL轉(zhuǎn)入相應(yīng)的甲乙兩容量瓶?jī)?nèi)，定容至50mL。以蒸餾水作空白對(duì)照，使用紫外光度計(jì)分別測(cè)定上述甲乙兩稀釋A260和A280的值。電泳結(jié)果A電泳時(shí)ladder扭曲BRNA帶缺失結(jié)果分析電泳時(shí)電壓過(guò)高電壓過(guò)高，電泳時(shí)間長(zhǎng)，RNA跑出凝膠電泳時(shí)間短，分子大小相近的DNA段不易分辨（電泳）DRNA帶模糊ERNA帶弱或無(wú)C不規(guī)則RNA帶遷移電泳條件不合適RNA變性RNA變性或降解上樣量過(guò)多蛋白質(zhì)污染緩沖液陳舊上樣量不足RNA降解讀數(shù)A260，A280.利用OD260=1時(shí),RNA=40μg／ml計(jì)算RNA濃度計(jì)算OD260／OD280正常值應(yīng)在1.8~2.0

小于1.75有蛋白質(zhì)污染大于2.0有DNA污染結(jié)果分析（濃度儀）應(yīng)用（mRNA）ART-PCR,Northern雜交，cDNA文庫(kù)構(gòu)建B

mRNA末端快速擴(kuò)增(RACE)，差異表達(dá)(DDRT-PCR)，引物延伸反應(yīng)，體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)記，RNA酶保護(hù)試驗(yàn)，RNA微注射(RNAMicroinjection)A樣品量是否越多越好？問(wèn)題討論A樣品量是否越多越好？問(wèn)題討論答：不是。在試劑盒規(guī)定內(nèi)增加，若過(guò)度增加樣品處理量會(huì)影響RNA得率如增加樣品起始量，則后續(xù)實(shí)驗(yàn)中各溶液量均要相應(yīng)按比例增加。處理樣品量RNA得率實(shí)際得率預(yù)期得率最大量B如何保證研磨過(guò)程和勻漿中RNA不被降解？問(wèn)題討論A如何保證研磨過(guò)程和勻漿中RNA不被降解？問(wèn)題討論答：研磨過(guò)程要迅速，同時(shí)盡量避免外源RNA酶污染；勻漿過(guò)程中一定要保證組織和裂解液充分接觸，盡量在勻漿前將組織低溫切割成小塊加入裂解液中，可確保RNA不被降解。C如何保存提取出的RNA？問(wèn)題討論C如何保存提取出的RNA？問(wèn)題討論答：①RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存;②長(zhǎng)期保存可以沉淀形式貯于乙醇中;③在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧釩核糖核苷復(fù)合物)凍貯于-70℃,可保存數(shù)年。DcDNA