免疫化學(xué)法測定生物化學(xué)物質(zhì)

第二十九章

免疫化學(xué)法測定生物化學(xué)物質(zhì)掌握激素、載脂蛋白及脂蛋白（a）、糖尿病相關(guān)激素及抗體等臨床常用項目，免疫化學(xué)法測定的原理以及其方法的優(yōu)缺點。熟悉腫瘤標(biāo)志物、治療藥物等其他項目測定的方法原理與評價。了解免疫化學(xué)法測定生物化學(xué)物質(zhì)的方法概述與進(jìn)展。教學(xué)目標(biāo)與要求

簡介免疫化學(xué)技術(shù)ICS發(fā)光免疫測定技術(shù)熒光免疫法放射免疫測定技術(shù)酶免疫測定技術(shù)免疫比濁測定技術(shù)免疫化學(xué)技術(shù)（immunochemicalsystem,ICS）免疫化學(xué)技術(shù)：利用已知的抗原或抗體，檢測相應(yīng)的抗體或抗原。特點：高度特異性和高靈敏性。廣泛應(yīng)用于激素、蛋白質(zhì)或多肽、腫瘤標(biāo)志物、神經(jīng)遞質(zhì)、核酸、心肌損害標(biāo)志物等生化物質(zhì)的測定。發(fā)光免疫法(luminescentimmunoassay)免疫學(xué)反應(yīng)和發(fā)光技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，可以自動化檢測微量的抗原或特異性抗體。類型：光致發(fā)光、酶促化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光等。熒光免疫法將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進(jìn)行細(xì)胞定位。測定項目：ANA,dsDNA,AMA,ASMA和呼吸道病毒等。放射免疫測定技術(shù)（radioimmunoassay,RIA）以放射性核素作為示蹤物的一種免疫標(biāo)記技術(shù)。特點：高靈敏度、特異性強、重復(fù)性好應(yīng)用：適用于各種抗原和抗體、微量蛋白質(zhì)、激素、核苷酸、多肽等的定量測定。放射免疫分析免疫放射分析酶免疫測定技術(shù)

以酶標(biāo)記的抗原或抗體作為主要試劑的免疫測定方法，在抗原抗體的特異性反應(yīng)后，通過標(biāo)記酶對底物的酶解呈色，根據(jù)呈色的深淺可以對相應(yīng)抗體或抗原進(jìn)行定性或定量的測定。酶放大免疫測定技術(shù)（enzymemultipledimmunoassaytechnique,EMIT）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）雙抗體夾心法、雙位點一步法、競爭法、捕獲法等免疫比濁法利用抗原抗體復(fù)合物在液相中形成的濁度對入射光產(chǎn)生散射特性來測定抗原含量的一門技術(shù)。免疫散射比濁法免疫透射比濁法方法學(xué)評價抗原抗體反應(yīng)特點（特異性、比例性、可逆性）優(yōu)點：方法特異性好，靈敏度高，可達(dá)ng或pg水平。缺點：帶現(xiàn)象：Ag與Ab比例不適而不出現(xiàn)可見反應(yīng)。*前帶(prozone)抗體過量時。*后帶(postzone)

抗原過量時。第一節(jié)糖尿病相關(guān)激素和自身抗體測定一、胰島素（In）和C肽（cp）（一）測定方法1.放射免疫法：原理：InI125+In+anti-In競爭結(jié)合測定結(jié)合部分（B）放射性強度。方法評價：特異性好、靈敏度高、試劑成本較低，但因受同位素半衰期影響，試劑盒壽命短，每次試驗需同時作標(biāo)準(zhǔn)曲線，且自動化程度不高，有放射性污染，臨床應(yīng)用日趨減少。B、F分離2.發(fā)光酶免疫法測定In原理：In+anti-In*+羊抗人In-ALP分離洗滌

+AMPPD光量子強度與In量成正比。*-磁珠方法評價:靈敏，可批量檢測，自動化分析。ALP3.電化學(xué)發(fā)光免疫法測CP原理：（雙抗體夾心）三聯(lián)吡啶釕-CP抗體+CP+生物素化CP抗體

鏈霉親和素包被的磁性微粒吸附到電極

三丙胺（TPA）電化學(xué)反應(yīng)。

磁場電場二、胰島自身抗體

胰島自身抗體主要有：胰島細(xì)胞抗體(isletcellantibody，ICA)，谷氨酸脫羧酶抗體(glutamicaciddecarboxylaseautoantibody，GADA)，胰島素自身抗體(insulinautoantibody，IAA)等。

蛋白酪氨酸磷酸酶抗體（IA-2A）鋅轉(zhuǎn)運體8（ZnT8）方法：間接免疫熒光法、放免法、ELISA、免疫印跡法和蛋白芯片法。臨床意義在1型糖尿病出現(xiàn)臨床表現(xiàn)之前就可以出現(xiàn)GAD抗體，在新診斷的1型糖尿病患者中GAD陽性率為75~90%，有助于1型糖尿病的及早診斷，尤其對LADA早期識別有重要價值。

ICA在新診斷1型糖尿病中陽性率為60~90%，隨著病程延長而逐漸降低，ICA可用于LADA的診斷。IAA是可與胰島素相結(jié)合的自身抗體可出現(xiàn)于未用外源性胰島素和1型糖尿病以及臨床前期患者中，在診斷的1型糖尿病患者中，IAA陽性率為40~50%，在LADA病人中也可檢出IAA。鋅轉(zhuǎn)運體8(ZnT8)是新近發(fā)現(xiàn)的一種1型糖尿病自身抗原,具有高度β細(xì)胞特異性,通過影響鋅離子濃度而在胰島素合成和分泌中發(fā)揮重要作用。ZnT8自身抗體對自身免疫性糖尿病(尤其對其他自身抗體陰性者)有著重要的診斷與預(yù)測價值。1型糖尿病的及早治療對于防止胰腺β細(xì)胞的進(jìn)一步惡化至關(guān)重要。ZnT8Ab可幫助患者得到及時的診斷，并幫助更早的啟動正確治療。檢測以上抗體有助于對糖尿病的正確分型以及指導(dǎo)治療?。ㄒ唬╅g接免疫熒光法測定ICA原理：

評價：陰陽性對照（二）放免法測定胰島素自身抗體血清胰島素水平可產(chǎn)生干擾。（三）ELISA測定胰島素自身抗體免疫捕獲法測定胰島素抗體第二節(jié)血清載脂蛋白一、載脂蛋白AIApoAⅠ是ApoA族最多的一種組分，是HDL中的主要載脂蛋白。

【生物學(xué)變異】1．升高用抗癲癇藥升高約20%、乙醇升高約20%、低血脂癥升高約15%。在女性口服避孕藥升高約10%、絕經(jīng)約升高4%，雌激素約升高3%。2降低用促黃體生成素約降低3%?！静±韺W(xué)變異】動脈粥樣硬化（尤指引起阻塞者）、糖尿病、高脂蛋白血癥、肝功不足均可導(dǎo)致載脂蛋白A的降低?！踞t(yī)學(xué)決定性水平】0.5g/L：低于此值表明存在脂代謝紊亂和用于飲食治療的觀測。

【生物學(xué)變異】

20～60歲的年齡段約升高20%，肥胖（體重過載）升高，在女性用促黃體生成素可使結(jié)果升高19%左右。

運動降低約2%，素食降低約2%，低血脂癥可減低10%左右，在女性雌激素約降低6%（亦有人報道降低30%），許多治療藥物，如：消膽胺（不影響VLDL）、安妥明、煙酸、右旋甲狀腺素、門冬酰胺酶等均可導(dǎo)致載脂蛋白B的降低。

【病理學(xué)改變】

1．增加高脂蛋白血癥、糖尿病、動脈粥樣硬化、心肌梗塞。

2．減少見于心肌局部缺血和肝功不全。

【醫(yī)學(xué)決定性水平】

1.60g/L:高于此限存在脂代謝紊亂并用于飲食治療的觀察。

apoB方法概述：方法有免疫比濁法、ELISA、火箭免疫電泳法和免疫擴(kuò)散法等。ELISA法定量分析的精密度比其他免疫化學(xué)定量法比較差，免疫比濁法是最常用的。

1.測定原理

特異性抗體與載脂蛋白的濁度反應(yīng)

多點校準(zhǔn)，曲線擬合。（采用Logit-Log模式）

免疫透射比濁法測定ApoAI或ApoB2.性能：

抗血清的純度和效價：抗ApoAI>1:16~32；抗ApoB>1:128抗原抗體比例合適性：標(biāo)本1:20預(yù)稀釋，或者效價提高，抗ApoAI=1:32；抗ApoB=1:256.校準(zhǔn)血清定值：現(xiàn)在已有WHO認(rèn)可的由美國西北脂類研究室根據(jù)國際臨床化學(xué)會的計劃研制的ApoAI參考血清（SP1-01）、ApoB參考血清（SP3-07），常規(guī)工作用校準(zhǔn)血清應(yīng)溯源于這兩種參考血清抗原位點的暴露：使用表面活性劑有助于抗原位點的暴露，還能減輕標(biāo)本空白的濁度，如PEG6000主要干擾：血清本身的混濁（如高脂血癥）可作標(biāo)本空白管，或采用兩點法除去空白。

二、LP(a)

Lp(a)既有ApoB100又有特征性載脂蛋白Apo(a)，加之Apo(a)的分子量變異較大故Lp(a)測定方法難度較大。增高：見于動脈粥樣硬化性心腦血管病、急性心肌梗死、家族性高膽固醇血癥、糖尿病、大動脈瘤及某些癌癥等。減低：見于肝臟疾病、酗酒、攝入新霉素等藥物后。免疫比濁法測定原理Lp(a)的單克隆抗體與Lp(a)產(chǎn)生濁度反應(yīng)多點校準(zhǔn)，曲線擬合測定方法評價靈敏度高，能自動化免疫檢測法被臨床廣泛應(yīng)用Apo(a)多態(tài)性，準(zhǔn)確度不好，難以標(biāo)準(zhǔn)化多態(tài)性是指在一個生物群體中，同時和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型（genotype）或等位基因（allele），亦稱遺傳多態(tài)性（geneticpolymorphism）或基因多態(tài)性。從本質(zhì)上來講，多態(tài)性的產(chǎn)生在于基因水平上的變異，一般發(fā)生在基因序列中不編碼蛋白的區(qū)域和沒有重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域。對于一個體而言，基因多態(tài)性堿基順序終生不變，并按孟德爾規(guī)律世代相傳。

生物群體基因多態(tài)性現(xiàn)象十分普遍，其中，人類基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和功能，研究比較深入。人類基因多態(tài)性既來源于基因組中重復(fù)序列拷貝數(shù)的不同，也來源于單拷貝序列的變異，以及雙等位基因的轉(zhuǎn)換或替換。按引起關(guān)注和研究的先后，通常分為3大類：DNA片段長度多態(tài)性、DNA重復(fù)序列多態(tài)性、單核苷酸多態(tài)性。

SNP

第三節(jié)心肌蛋白和利鈉肽測定一、肌紅蛋白（乳膠增強免疫比濁法測定肌紅蛋白）原理：聚苯乙烯乳膠顆粒包被抗體，與肌紅蛋白發(fā)生抗原抗原反應(yīng)，產(chǎn)生交聯(lián)凝集，其濁度深淺與量成正比。肌紅蛋白（Myoglobin,Mb）是一種氧結(jié)合血紅素蛋白，主要分布于心肌和骨骼肌組織。在急性心肌損傷時，Mb最先被釋放入血液中，在癥狀出現(xiàn)約2-3小時后，血中Mb可超出正常上限，9-12小時達(dá)到峰值，24-36小時后恢復(fù)正常。對于懷疑ACS的病人建議連續(xù)采樣測定，因為癥狀出現(xiàn)和蛋白標(biāo)志物釋放到血液之間有一段延遲。在ACS早期診斷和監(jiān)測的臨床效用已有大量文獻(xiàn)報告。Mb陰性有助于排除心梗。

臨床意義：

測定血清肌紅蛋白肌紅蛋白可作為急性心肌梗死(AMI)診斷的早期最靈敏的指標(biāo)。但特異性差,骨骼肌損傷、創(chuàng)傷、腎功能衰竭等疾病,都可導(dǎo)致其升高。Mb陽性雖不能確診AMI,但可用于早期排除AMI診斷的重要指標(biāo),如mb陰性,則基本排除心肌梗死

,還可用于再梗死的診斷,結(jié)合臨床,如Mb重新升高,應(yīng)考慮為再梗死或者梗死延展。

肌紅蛋白二、肌鈣蛋白I

1.膠體金層析法----定性原理：以硝酸纖維素膜作為固相載體、包被抗原或抗體；利用微孔濾膜滲濾特性可使抗原或抗體與膜表面的固相抗體或抗原結(jié)合、聚集，形成紫紅色斑點；微孔濾膜滲濾特性可完成洗滌過程，實現(xiàn)游離標(biāo)記物的分離；技術(shù)原理2.化學(xué)發(fā)光免疫法測定cTnI----定量

原理：雙位點夾心法cTnI抗體-順磁性微粒+cTnI+吖啶酯-cTnI抗體+H2O2+NAOH化學(xué)發(fā)光當(dāng)心肌損傷后，心肌肌鈣蛋白復(fù)合物釋放到血液中，4-6小時后，開始在血液中升高，升高的肌鈣蛋白I能在血液中保持很長時間6-10天。肌鈣蛋白I具有高度心肌特異性和靈敏度，所以肌鈣蛋白T已成為目前最理想的心肌梗死標(biāo)志物。檢查時：不同廠家試劑盒對標(biāo)本的要求也不同，應(yīng)按要求取血。不適宜人群：嚴(yán)重的溶血將影響測定結(jié)果?；加袊?yán)重骨骼肌損傷病人會產(chǎn)生假陽性。三、利納肽（電化學(xué)發(fā)光法測定利鈉肽）原理：（競爭法）血漿利鈉肽銪-利鈉肽抗體競爭性結(jié)合生物素-利鈉肽+鏈霉親和素-磁性微粒電極光信號方法評價：利鈉肽穩(wěn)定性差，快速分離，加抑肽酶防止降解。捕獲電場心鈉肽主要由心房肌細(xì)胞分泌，腦鈉肽主要由心室肌細(xì)胞分泌，C型利鈉肽主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌并在局部發(fā)揮血管擴(kuò)張和抗增殖作用。血漿心鈉肽具有擴(kuò)血管、利尿、拮抗神經(jīng)內(nèi)分泌激素的多種作用。

臨床意義：

由于心房擴(kuò)張是ANP釋放的主要誘因，因此ANP的濃度與左心房壓、肺動脈收縮壓有著密切的關(guān)系。

1.升高：見于原發(fā)性高血壓、冠心病、心力衰竭、室上性心動速、早搏肝硬化、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺病、醛固酮增多癥、腎病。在急性心梗，ANP的升高對左心室功能障礙和AMI的死亡率由獨特的預(yù)報價值，急性心肌梗死患者在亞急性期ANP的濃度升高提示長期預(yù)后差。

2.降低：見于甲狀腺功能亢進(jìn)、心房纖維性顫動。

ANP實際上它主要來源于心室。BNP具有促進(jìn)排鈉、排尿，具較強的舒張血管作用，可對抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的縮血管作用，同ANP一樣是人體抵御容量負(fù)荷過重及高血壓的一個主要內(nèi)分泌系統(tǒng)。心功能障礙能夠極大地激活利鈉肽系統(tǒng)，心室負(fù)荷增加導(dǎo)致BNP釋放。

測定血漿BNP濃度可以為臨床提供許多有用的信息，常用的方法主要有：放射免疫法（IRA）、免疫放射測量法（IRMA）、電化學(xué)發(fā)光法（ECLA）。

意義：

CHF患者血漿BNP濃度較正常升高，且與心衰嚴(yán)重程度呈正比，比較正常組和CHF組之間的心臟及血漿BNP水平，發(fā)現(xiàn)正常人心室BNP含量為心房的7.2%，整個心臟的30%，CHF患者則分別上升為22%、52%腦鈉肽（BNP）第四節(jié)激素測定一、促甲狀腺素（時間分辨熒光免疫法測定促甲狀腺素）原理（雙抗體夾心法）：

TSH+TSH-Ab*抗原抗體復(fù)合物延遲時間檢測熒光強度TSH-Eu3+解離增強液時間分辨熒光免疫分析

（time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA）特點：使用三價鑭系元素作為示蹤劑，其經(jīng)紫外光激發(fā)所發(fā)出的熒光衰變時間長，利用延遲測光時間，可有效消除樣品或試劑中蛋白質(zhì)的非特異熒光的干擾激發(fā)光和熒光的波長移位大，熒光光譜峰窄，可有效消除激發(fā)光的干擾。三碘甲腺原胺酸（3,5,3′-triiodothyronine,T3)甲狀腺素（thyroxine,T4)FT3FT4二、甲狀腺激素三、甲狀腺相關(guān)疾病抗體甲狀腺微粒體抗體（TMAb）甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）甲狀腺球蛋白抗體（TGAb）促甲狀腺素受體抗體（TRAb）甲狀腺球蛋白（Tg）四、性腺激素PRL、FSH、LH、E、T、PROG促甲狀腺激素受體抗受體抗體（TRAb）又稱膜受體抗體，是直接作用于甲狀腺細(xì)胞膜上的TSH受體的抗體，屬免疫球蛋白IgG，根據(jù)其作用可分為以下3類：①甲狀腺刺激性抗體（TSAb），又稱甲狀腺刺激免疫球蛋白（TSI），與甲狀腺濾泡膜上的TSH受體結(jié)合，刺激甲狀腺腫大，增強其功能活性，是導(dǎo)致Graves病的主要病因。②甲狀腺功能抑制性抗體（TFIAb）：又稱甲狀腺功能抑制性免疫球蛋白（TFII），與TSH受體結(jié)合后，可抑制甲狀腺功能，引起甲低。③甲狀腺生長刺激免疫球蛋白（TGI）：可刺激甲狀腺腫大，但不影響其功能。