凝膠電泳及其應(yīng)用教學(xué)內(nèi)容

凝膠電泳及其應(yīng)用(yìngyòng)第一頁，共18頁。主要(zhǔyào)內(nèi)容凝膠電泳相關(guān)(xiāngguān)概念1凝膠電泳的原理(yuánlǐ)2凝膠電泳的應(yīng)用3聚丙烯酰胺凝膠電泳42第二頁，共18頁。

凝膠：凝膠是膠體體系的一種存在形式(xíngshì)，它是由膠體體系中分散相顆粒相互聯(lián)結(jié)，搭成具有三維結(jié)構(gòu)的骨架后形成的，具有空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)體系，膠體體系中原有的分散介質(zhì)（液體）充填在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的空隙之中。電泳：帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳(electrophoresis,EP)。利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達(dá)到分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù)。分類：凝膠電泳相關(guān)(xiāngguān)概念自由電泳（無支持體）區(qū)帶電泳（有支持體）Tise-leas式微量電泳、顯微電泳、等電聚焦電泳、等速電泳及密度梯度電泳。濾紙電泳（常壓及高壓）、薄層電泳（薄膜及薄板）、醋酸纖維薄膜電泳、非凝膠性支持體區(qū)帶電泳（支持體有：淀粉，纖維素粉，玻璃粉，硅膠等)、凝膠支持體區(qū)帶電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）等第三頁，共18頁。凝膠電泳原理(yuánlǐ)當(dāng)一種分子被放置在電場當(dāng)中時,它們就會以一定的速度(sùdù)移向適當(dāng)?shù)碾姌O,這種電泳分子在電場作用下的遷移速度(sùdù),叫做電泳的遷移率。它同電場的強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。也就是說,電場強(qiáng)度越大、電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多,其遷移的速度(sùdù)也就越快,反之則較慢。由于在電泳中使用了一種無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì),如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等,從而降低了對流運(yùn)動,故電泳的遷移率又是同分子的摩擦系數(shù)成反比的。已知摩擦系數(shù)是分子的大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù),因此根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)成或形狀的差異,以及所帶的凈電荷的多少,便可以通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來。第四頁，共18頁。凝膠電泳原理圖電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭(qiántou)，大分子滯后。第五頁，共18頁。凝膠電泳裝置(zhuāngzhì)圖垂直(chuízhí)式電泳裝置水平式電泳裝置第六頁，共18頁。影響(yǐngxiǎng)凝膠電泳的因素影響電泳速度(sùdù)的因素：樣品本身：帶電量，分子大小，形狀電場強(qiáng)度(qiángdù)：電壓緩沖液：成分，pH，離子強(qiáng)度(qiángdù)支持介質(zhì)：電滲作用，吸附作用溫度第七頁，共18頁。凝膠電泳應(yīng)用(yìngyòng)凝膠電泳通常用于分析用途，但也可以作為制備技術(shù)，在采用某些方法（如質(zhì)譜(MS)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(liànshìfǎnyìng)(PCR)、克隆技術(shù)、DNA測序或者免疫印跡）檢測之前部分提純分子。凝膠電泳被廣泛用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué)。大的DNA或者RNA分子通常利用瓊脂糖凝膠電泳（agarosegelelectrophoresis）分離，也可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。蛋白質(zhì)的凝膠電泳通常在加入十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行（SDS），現(xiàn)以其為例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)說明。第八頁，共18頁。聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱(jiǎnchēng)Acr)和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,簡稱(jiǎnchēng)Bis)在加速劑（四甲基乙二胺TEMED）和催化劑（過硫酸胺或核黃素）的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳。（polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱(jiǎnchēng)PAGE）第九頁，共18頁。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置(zhuāngzhì)圖第十頁，共18頁。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳操作過程1.將玻璃板用蒸餾水洗凈(xǐjìnɡ)晾干,準(zhǔn)備2個干凈的小燒杯

2.把玻璃板在灌膠支架上固定好聚丙烯酰胺凝膠電泳確定(quèdìng)蛋白質(zhì)分子量第十一頁，共18頁。

配膠分離膠(10%10ml)濃縮膠(5%10ml)ddH2O4.05ml6.8ml30%Acr3.3ml1.7mlBuffer1.5mol/LpH=8.8Tris-HCl2.5ml0.5mol/LpH=6.8Tris-HCl1.25ml10%SDS100μl100μl10%Ap50μl100μlTEMED10μl10μl第十二頁，共18頁。3.按比例配好分離膠,用移液管快速加入（或直接用小燒杯倒入）,大約5厘米左右,之后加少許蒸餾水,靜置至膠凝

4.倒出水(chūshuǐ)并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入梳子,靜置到膠凝。5.拔出樣梳后,在槽中加入緩沖液6.上樣：（微量注射器）（1）marker5μl（2）樣品10μl+2×上樣buffer10μl共20μl

第十三頁，共18頁。7.電泳槽中加入(jiārù)緩沖液，接通電源，進(jìn)行電泳。

8.凝膠板剝離與染色：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入(jiārù)考馬斯亮藍(lán)染色染色液，染色1小時左右。

9.脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。

10.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析第十四頁，共18頁。按下式計算相對遷移率：

每個蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對數(shù)對它的相對遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分子量，這樣的標(biāo)難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測定(cèdìng)才具有可靠性。=

蛋白樣品距加樣端遷移距離cm溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離cm

相對遷移率第十五頁，共18頁。聚丙烯酰胺凝膠電泳測定(cèdìng)多肽鏈分子量第十六頁，共18頁。謝謝(xièxie)！