蠶豆病實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)課件

臨床十二大班92012級(jí)本科分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)案例患兒，男性，3歲，因面色蒼白伴血尿1天入院。1天前食用新鮮蠶豆后，今日出現(xiàn)惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣色，面色蒼白。據(jù)家長反映，患者的姐姐也曾發(fā)生過類似情況。體格檢查：體溫38℃，脈搏150次/分，呼吸40次/分，血壓80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色蒼白，皮膚及鞏膜黃染，體型較同齡人瘦小。心、肺未及異常，肝、脾未觸及，雙腎區(qū)無叩擊痛，神經(jīng)系統(tǒng)檢查未及異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：紅細(xì)胞1.98×1012/L，血紅蛋白53g/L，血清總膽紅素85.5μmol/L，結(jié)合膽紅素13.7μmol/L，未結(jié)合膽紅素71.8μmol/L，尿蛋白（++），潛血(+)，尿膽紅素(－)，尿膽素原(+)，尿液鏡下未見紅細(xì)胞。案例分析3、血象紅細(xì)胞1.98×1012/L（↓）﹤4.0～5.5﹥×1012/L

血紅蛋白53g/L（↓）（110-150G/L）血清總膽紅素85.5μmol/L（↑）1.71-17.1μmol/L4、尿常規(guī)尿液下未見紅細(xì)胞（紅細(xì)胞膜已不完整）尿膽素原呈陽性輕度蠶豆病并伴溶血性黃疸

根據(jù)以上信息和檢查診斷蠶豆病簡介蠶豆病是一種6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G-6-PD）缺乏所導(dǎo)致的疾病，表現(xiàn)為在遺傳性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）缺陷的情況下，食用新鮮蠶豆后突然發(fā)生的急性血管內(nèi)溶血。多見于兒童，男性患者約占90%以上。紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性測定（紫外法）設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確診斷實(shí)驗(yàn)原理●要檢測G6PD的活性，可以檢測NADPH生成量實(shí)驗(yàn)原理●已知：NADPH在340nm的紫外線照射下產(chǎn)生熒光即可以每隔2分鐘在340nm波長下測定孵育液中NADPH吸光度以10min吸光度值的變化（△A340）計(jì)算NADPH的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)器材和試劑1.實(shí)驗(yàn)器材恒溫水循環(huán)紫外分光光度計(jì)，可見分光光度計(jì)，離心機(jī)。2.試劑（1）0.5mol/LTris-HClMgCl2緩沖溶液（pH8.0）：稱取Tris12.1g,MgCl2·6H2O4.06g,加入160mL蒸餾水溶解，用HCl調(diào)pH至8.0，然后加入蒸餾水至200mL。（2）2mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP＋)：稱取NADP＋

21.3mg，溶于10mL蒸餾水中。4℃可保存20天左右。（3）6mmol/L葡萄糖—6—磷酸二鈉(G6P－Na2)：稱取21.5mgG6P－Na2·2H2O，溶于10mL蒸餾水中。4℃可保存20天左右。（4）溶血?jiǎng)喝€基乙醇0.1mL，10%EDTA2.0mL，6mmol/LNADP＋

0.4mL，加蒸餾水至總體積200mL。（5）血紅蛋白氧化劑（Drabkin試劑）：稱取K3Fe(CN)6

0.2g，KCN0.052g，NaHCO3

1.0g，加蒸餾水至1000mL，置棕色瓶內(nèi)避光保存，可保存20天。（6）0.9%NaCl，ACD抗凝劑。實(shí)驗(yàn)器材和試劑

實(shí)驗(yàn)操作流程1、洗滌紅細(xì)胞取靜脈血2.0mL，放入含0.4mLACD抗凝劑的試管中，混勻。吸取0.2mL抗凝血放入試管中，加入4mL預(yù)冷的生理鹽水，輕輕搖勻，2500r/min離心5min,傾去上清，重復(fù)三次。2、溶血液的制備向紅細(xì)胞沉淀中加入溶血?jiǎng)?.0mL，震蕩1min，4℃放置10min以上。以“空白”調(diào)“0”,1min后開始測340nm吸光度（A340），每2min紀(jì)錄吸光度一次，至10min止，比較每2minA值的變化情況，若相近則表明酶促反應(yīng)平穩(wěn)。以10minA值的變化（△A340）計(jì)算NADPH的產(chǎn)量。4.溶血液中血紅蛋白含量的測定取試管一支，按下表操作：試劑體積Drabkin(mL)溶血液(mL)0.33.0混勻，室溫放置15min，以Drabkin試劑調(diào)零，讀取540nm的吸光度（A540）。注意事項(xiàng)1.洗滌紅細(xì)胞時(shí)禁止劇烈震蕩，避免溶血。2.測定NADPH時(shí)讀取吸光度的時(shí)間要準(zhǔn)確。結(jié)果分析1.NADPH產(chǎn)量的計(jì)算NADPH在340nm處，其每微摩爾的吸光系數(shù)（ε）為6.220，故10min內(nèi)NADPH的產(chǎn)量計(jì)算公式為：NADPH產(chǎn)量（μmol）=2.血紅蛋白含量的計(jì)算血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白以后，在540nm處，其毫摩爾吸光細(xì)數(shù)（ε）為44，故溶血液中血紅蛋白的含量計(jì)算公式為：血紅蛋白含量（mmol）=從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果生化角度實(shí)驗(yàn)室檢查檢查項(xiàng)目檢查值正常值紅細(xì)胞1.98×1012/L4.0—5.0×1012/L血紅蛋白53g/L120—160g/L血清總膽紅素85.5μmol/L3.4—17.1μmol/L結(jié)合膽紅素13.7μmol/L總量的20%未結(jié)合膽紅素71.8μmol/L總量的80%

結(jié)果導(dǎo)致紅細(xì)胞膜的破壞膽色素代謝異常

谷胱甘肽阻止氧化血紅蛋白，從而保護(hù)紅細(xì)胞膜的完整性，如若缺乏，此時(shí)的紅細(xì)胞易于破裂。NADPH—高鐵血紅蛋白還原酶GSHMHbHb紅細(xì)胞膜的破壞膽紅素鐵卟啉類化合物的降解產(chǎn)物80%以上來自衰老紅細(xì)胞破壞所釋放的血紅蛋白的分解自由通過生物膜產(chǎn)生毒性作用具體分析

體溫升高大量溶血，即血紅細(xì)胞大量破壞，大量的無菌性壞死物質(zhì)入血，機(jī)體動(dòng)員白細(xì)胞吞噬吸收壞死物質(zhì)，導(dǎo)致無菌性炎癥，可引起發(fā)熱，亦稱為吸收熱。

呼吸加快及心律升高

由于急性溶血導(dǎo)致循環(huán)血量減少，紅細(xì)胞減少，血紅蛋白減少，氧氣供應(yīng)相對(duì)不足，故機(jī)體通過加快呼吸頻率，以及加快心率維持心輸出量的相對(duì)穩(wěn)定以維持機(jī)體代謝的供氧?；颊唧w型瘦小與該病癥是否有關(guān)，為什么？（選答）患者體型瘦小與該病癥有關(guān)

蠶豆病是因?yàn)轶w內(nèi)缺乏G6PD，

G6PD主要影響體內(nèi)的磷酸戊糖途徑該途徑主要生成兩種重要的物質(zhì)即5-磷酸核糖和NADPH5-磷酸核糖影響：1：核酸的合成2：體內(nèi)己糖和戊糖的代謝3：3—7碳原子糖類物質(zhì)的相互轉(zhuǎn)化G6PDNADPH影響：1：體內(nèi)以NADPH作為供氫體合成多種活性物質(zhì)如膽固醇脂肪酸和一些非必需氨基酸2：

NADPH可作為羥化酶的輔酶，參與體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化作用3：

NADPH參與吞噬細(xì)胞的殺菌作用4：維持GSH的正常水平GSH可以保護(hù)體內(nèi)蛋白質(zhì)或酶免遭氧化使蛋白質(zhì)或酶處于活性狀態(tài)磷酸戊糖途徑中生成多余的核糖轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛進(jìn)入糖酵解途徑，G6PD缺乏使得糖代謝受到影響。脂酸可以合成甘油三酯，其主要功能是儲(chǔ)存和氧化能量，機(jī)體難以合成甘油三酯則消耗原有儲(chǔ)備的甘油三酯，使得機(jī)體消瘦。同時(shí)體內(nèi)的一些生物活性物質(zhì)功能發(fā)生障礙，如膽固醇不能直接氧化但能轉(zhuǎn)化為膽汁酸、類固醇激素、維生素D3，參與物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)，膽汁酸具有促進(jìn)脂類消化和吸收的作用；維生素D3主要參與體內(nèi)血鈣和血磷的調(diào)節(jié)。生物轉(zhuǎn)化作用可以對(duì)體內(nèi)大部分非營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，或使有毒物質(zhì)的毒性減低或消除，增強(qiáng)這些非營養(yǎng)物質(zhì)的水溶性和極性，從而易于從膽汁或尿液中排除。GSH