微生物的實驗室培養(yǎng)用

微生物的實驗室培養(yǎng)用第一頁，共三十八頁，2022年，8月28日原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌單細(xì)胞的動植物如草履蟲、單細(xì)胞藻類等微生物包含了除植物界和動物界以外的所有生物無細(xì)胞結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞細(xì)菌、藍藻、放線菌原核細(xì)胞微生物的類群第二頁，共三十八頁，2022年，8月28日課題1微生物的實驗室培養(yǎng)專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用1.提供營養(yǎng)和條件2.防止污染第三頁，共三十八頁，2022年，8月28日一.培養(yǎng)基：微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)1.基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、無機鹽⑴碳源無機碳源：有機碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無機氮源：有機氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含CHON的有機物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源第四頁，共三十八頁，2022年，8月28日(1)pH值如:培養(yǎng)霉菌需酸性、培養(yǎng)細(xì)菌需中性或微堿性(2)特殊營養(yǎng)物質(zhì)----維生素、堿基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）如：培養(yǎng)乳酸桿菌需要在培養(yǎng)基中添加維生素(3)氧氣的含量如:培養(yǎng)厭氧微生物時需要提供無氧的條件2.培養(yǎng)基內(nèi)所需的其他條件生長因子第五頁，共三十八頁，2022年，8月28日3.種類：固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有無凝固劑瓊脂物理性質(zhì)：菌落第六頁，共三十八頁，2022年，8月28日單個或少數(shù)菌體特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。功能：定義：菌落鑒定菌種的重要依據(jù)固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細(xì)胞群體第七頁，共三十八頁，2022年，8月28日形態(tài)各異的菌落第八頁，共三十八頁，2022年，8月28日其它分類：根據(jù)化學(xué)成分分合成培養(yǎng)基——成分明確天然培養(yǎng)基——成分不明確根據(jù)用途分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基第九頁，共三十八頁，2022年，8月28日選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基

分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基

分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基

分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞第十頁，共三十八頁，2022年，8月28日牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g分析營養(yǎng)構(gòu)成？第十一頁，共三十八頁，2022年，8月28日練習(xí)1（多項選擇）1、下列細(xì)菌中，能利用含碳無機物作碳源的是A光合細(xì)菌B根瘤菌C硝化細(xì)菌D乳酸菌2、培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基中，必需含有的碳源和氮源是A糖、有機酸等B二氧化碳、碳酸鹽C蛋白質(zhì)D無機氮化物3、下列敘述不正確的是A培養(yǎng)基是為微生物的生長繁殖提供營養(yǎng)的基質(zhì)B液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基所含的最基本物質(zhì)不相同C微生物在固體培養(yǎng)基上生長時，可以形成肉眼可見的單個細(xì)菌A.CA.CB.C.第十二頁，共三十八頁，2022年，8月28日1.無菌范圍：實驗操作空間消毒操作者的手、衣著消毒實驗用具、培養(yǎng)基滅菌實驗操作過程酒精燈旁操作超凈工作臺二.無菌技術(shù)：防止外來雜菌的污染第十三頁，共三十八頁，2022年，8月28日耐高溫需保持干燥的物品，160～170℃1～2小時接種環(huán)、接種針等金屬用具70~75℃、30min80℃、15min100℃、5~6min消毒滅菌定義方法較為溫和理化方法，殺死部分有害菌體（不包括芽孢、孢子）強烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑紫外線灼燒滅菌干熱滅菌酒精、氯氣、石炭酸等高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基，100KPa、121℃、15～30min二.無菌技術(shù)：防止外來雜菌的污染2.消毒與滅菌：第十四頁，共三十八頁，2022年，8月28日思考:1)無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？

2)消毒和滅菌有何不同？3)為什么消毒牛奶要用巴氏消毒法?4)請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。①培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿②玻棒、試管、燒瓶和吸管③實驗操作者的雙手消毒滅菌條件溫和強烈作用范圍物體表面或內(nèi)部一部分,不包括芽孢和孢子物體內(nèi)外所有微生物,包括芽孢和孢子無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。滅菌滅菌消毒營養(yǎng)成分不被破壞第十五頁，共三十八頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基培養(yǎng)皿空氣接種環(huán)雙手牛奶②巴氏消毒③化學(xué)消毒⑤紫外線消毒⑥高壓蒸氣滅菌①灼燒滅菌④干熱滅菌常用的消毒方法和滅菌方法第十六頁，共三十八頁，2022年，8月28日1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g三.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計算：培養(yǎng)基用量依配方計算各成分的用量2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙、少量水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂→補水定容4.調(diào)pH、分裝、封口：5.滅菌：6.倒平板：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿分散成單個細(xì)胞,形成單個菌落冷卻至50℃，在酒精燈火焰附近第十七頁，共三十八頁，2022年，8月28日倒平板第十八頁，共三十八頁，2022年，8月28日?思考1溶化時為什么要將牛肉膏連同稱量紙一起加熱?

答:②加瓊脂的目的是什么?答:可保證粘附在稱量紙上的牛肉膏也能溶于水中,減少誤差作為凝固劑第十九頁，共三十八頁，2022年，8月28日思考2在滅菌前,用牛皮紙、舊報紙包緊盛有培養(yǎng)基的錐形瓶的目的是什么？答:

②培養(yǎng)皿能否用高壓蒸汽滅菌？答:?在滅菌時能避免水蒸汽凝結(jié)時浸濕棉塞,在取出培養(yǎng)基錐形瓶時也起到隔絕空氣中雜菌污染的作用不能,因為培養(yǎng)皿要保持干燥,應(yīng)該用干熱滅菌.第二十頁，共三十八頁，2022年，8月28日討論:(1).培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？(2).為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？(3).平板冷凝后，為什么要將平板倒置？(4).在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。第二十一頁，共三十八頁，2022年，8月28日㈡純化大腸桿菌：⑴平板劃線法：菌種劃3個平板1個不劃線1.接種：接種環(huán)防止劃破培養(yǎng)基（重復(fù)實驗）（空白對照）平板劃線法：稀釋涂布平板法第二十二頁，共三十八頁，2022年，8月28日問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。第二十三頁，共三十八頁，2022年，8月28日2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。第二十四頁，共三十八頁，2022年，8月28日6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：菌液微量移液器第二十五頁，共三十八頁，2022年，8月28日⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：b.涂布平板：不超過0.1ml各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照滴灼試涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍第二十六頁，共三十八頁，2022年，8月28日涂布平板操作討論:涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進行無菌操作？

答：應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。第二十七頁，共三十八頁，2022年，8月28日2.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h后，觀察并記錄第二十八頁，共三十八頁，2022年，8月28日

1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則，說明培養(yǎng)基有雜菌，需要重新制備。

2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似？

如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。四.結(jié)果分析與評價第二十九頁，共三十八頁，2022年，8月28日

3.培養(yǎng)12h和24h后，觀察到的實驗結(jié)果相同嗎？如果不同，請分析產(chǎn)生差異的原因？

培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同。隨著時間的延長、菌落的不斷生長，使菌落不斷增大。

4.如果在培養(yǎng)基上觀察到不同形態(tài)的菌落，請分析其可能的原因。

無菌操作未達到要求：可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底；可能是接種時發(fā)生了污染；也可能是在培養(yǎng)的過程中受到了污染。第三十頁，共三十八頁，2022年，8月28日五.菌種的保藏：1.臨時保藏：試管固體斜面培養(yǎng)基上4℃2.長期保存：菌種易被污染、變異甘油管藏1ml甘油＋1ml菌液－20℃第三十一頁，共三十八頁，2022年，8月28日練習(xí)：1、培養(yǎng)細(xì)菌需要根據(jù)某種細(xì)菌的________________配制特定的________________.其中______________培養(yǎng)基應(yīng)用廣泛.2、為使培養(yǎng)基呈固體狀態(tài)，需要在配制好的各營養(yǎng)成分的液體加入___________,溶化冷卻即可.3、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值,用濃度為1mol/L的_________或____________溶液進行調(diào)節(jié).營養(yǎng)需要培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨瓊脂HClNaOH第三十二頁，共三十八頁，2022年，8月28日4、對培養(yǎng)基進行滅菌就是要利用高溫殺死_______________________________.5、擱置斜面時培養(yǎng)基溫度不能_____________否則培養(yǎng)基會變成___________應(yīng)趁熱將試管放置成斜面形培養(yǎng)基中的一切微生物太低固體6、微生物接種時各項操作必須在_________條件下進行.因此必須在___________上操作.接種環(huán)境在___________上用灼燒去滅菌,雙手用_______%的酒精消毒.無菌超凈工作臺酒精燈75第三十三頁，共三十八頁，2022年，8月28日（11年新課標(biāo)卷）39.【生物——選修1：生物技術(shù)實踐】（15分）有些細(xì)菌可分解原油，從而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同學(xué)欲從污染的土壤中篩選出高效降解原油的菌株?；卮饐栴}：⑴在篩選過程中，應(yīng)將土壤樣品稀釋液接種于以

為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上，從功能上講，該培養(yǎng)基屬于————培養(yǎng)基。⑵純化菌種時，為了得到單菌落，常采用的接種方法有兩種，即

和