原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交

第六章原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合

原生質(zhì)體培養(yǎng)

原生質(zhì)體融合第一節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體研究概況原生質(zhì)體分離原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體再生植株遺傳與變異一、原生質(zhì)體研究概況

（protoplast)：指去除細(xì)胞壁的裸露的具有活力的植物細(xì)胞。核質(zhì)體(nuclearplast)：由原生質(zhì)體膜和薄層細(xì)胞質(zhì)形成的小原生質(zhì)體，也稱(chēng)為微小原生質(zhì)體（miniprptoplast）。胞質(zhì)體（cytoplast）：不含細(xì)胞核而只含部分細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體原生質(zhì)體研究中的幾個(gè)重要成就1840年，Hanstein首次起用原生質(zhì)體(protoplast)一詞。1960年，Cocking首次用酶法制備番茄根原生質(zhì)體。1971年，Takebe首次得到煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株.1981年，Vardi等獲得柑橘胚性愈傷組織原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株。1985年，F(xiàn)ujimura等獲得第一例禾谷類(lèi)作物-水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株。1986年，Spangenberg等單個(gè)原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株在甘藍(lán)型油菜上獲得成功。原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義原生質(zhì)體體系器官發(fā)生胚狀體發(fā)生體細(xì)胞遺傳細(xì)胞生理細(xì)胞懸浮培養(yǎng)植物遺傳轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體培養(yǎng)程序預(yù)處理外植體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)與再生活力檢測(cè)酶解純化二、原生質(zhì)體分離1、分離方法原生質(zhì)體的分離方法有機(jī)械法和酶解法，本章主要探討酶解法。酶解方法有一步法和順序法。葉肉原生質(zhì)體煙草原生質(zhì)體菊花原生質(zhì)體2、影響原生質(zhì)體分離的因素①外植體來(lái)源生長(zhǎng)旺盛、生命力強(qiáng)的組織和細(xì)胞是獲得高活力原生質(zhì)體的關(guān)鍵，并影響著原生質(zhì)體的復(fù)壁、分裂、愈傷組織形成乃至植株再生。用于原生質(zhì)體分離的植物外植體有葉片、葉柄、莖尖、根、子葉、莖段、胚、原球莖、花瓣、葉表皮、愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物等。②前處理進(jìn)行表面消毒，除非材料來(lái)源于無(wú)菌條件。為了保證酶液充分進(jìn)入組織，可撕去葉片下表皮，如果葉片的下表皮撕不掉或很難撕掉，可把葉片切成小塊，如果是其他組織可直接切成小塊。為了促進(jìn)酶液的滲入也可結(jié)合真空抽濾。此外，高滲處理、激素處理、低溫處理、激素處理與低溫處理結(jié)合等方法。③分離培養(yǎng)基

分離植物原生質(zhì)體的酶液主要由分離培養(yǎng)基、酶和滲透壓穩(wěn)定劑組成。常用的分離培養(yǎng)基主要是CPW鹽溶液，也有用鈣(CaCl2·2H2O)和磷(KH2PO4)鹽組成的溶液或1/2MS鹽溶液等。半纖維素果膠質(zhì)纖維素④酶的種類(lèi)和濃度常用的酶有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和離析酶，酶解花粉母細(xì)胞和四分體小孢子時(shí)還要加入蝸牛酶。酶的水平應(yīng)根據(jù)不同植物材料而有所變化。常用的纖維素酶濃度是1%～3%，果膠酶為0.1%～0.5%，離析酶為0.5%～1%，半纖維素酶為0.2%～0.5%。

在配制酶液時(shí)通常要加入一些化學(xué)物質(zhì)，以提高酶解效率或增強(qiáng)酶解原生質(zhì)體的活力。酶液中添加適量的CaCl2·2H2O、KH2PO4或葡聚糖硫酸鉀有利于提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和原生質(zhì)體的活力，加入2，N-氮馬啉-乙基磺酸可穩(wěn)定酶液的pH值，加入牛血清蛋白能夠減少酶解過(guò)程中細(xì)胞器的損傷。酶液配好后不能進(jìn)行高溫高壓滅菌，常過(guò)濾滅菌。分離原生質(zhì)體的培養(yǎng)基用量一般為10mg/ml。⑤滲透壓穩(wěn)定劑酶液中滲透壓對(duì)平衡細(xì)胞內(nèi)的滲透壓、維持原生質(zhì)體的完整性和活力有很重要的作用。一般來(lái)說(shuō)，酶液、洗滌液和培養(yǎng)液中的滲透壓應(yīng)高于原生質(zhì)體內(nèi)的滲透壓；較高的滲透壓可防止原生質(zhì)體破裂或出芽，但同時(shí)也使原生質(zhì)體收縮并阻礙原生質(zhì)體再生細(xì)胞分裂。廣泛使用的滲透壓調(diào)節(jié)劑有:甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖和麥芽糖，其濃度約在0.3～0.7mol/L之間，隨不同植物和細(xì)胞類(lèi)型而有所變化。⑥酶解條件和時(shí)間

酶解時(shí)間視材料而定，范圍為2-8h，一般不超過(guò)24h。酶解的溫度一般為23-32℃；酶解的pH值因使用酶的不同而不一樣，一般在5.6～5.8，過(guò)高或過(guò)低均不適于原生質(zhì)體分離。

葉片分離原生質(zhì)體可在靜置條件下進(jìn)行，懸浮細(xì)胞由于壁厚，培養(yǎng)（分離）過(guò)程中間斷低速震蕩有利于酶液的滲透。原生質(zhì)體計(jì)數(shù)三、原生質(zhì)體培養(yǎng)1、原生質(zhì)體培養(yǎng)基2、原生質(zhì)體培養(yǎng)3、愈傷組織的形成與植株再生4、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素1、原生質(zhì)體培養(yǎng)基不同作物的培養(yǎng)基不盡相同，即使同一作物不同基因型用的培養(yǎng)基也可能不同。一般說(shuō)來(lái)，能用于細(xì)胞和組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基通常只需進(jìn)行一定的變化即可用于原生質(zhì)體培養(yǎng)。最常用的培養(yǎng)基是改良MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基和KM8P培養(yǎng)基等，其他培養(yǎng)基均是在這幾種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。常用于木本植物培養(yǎng)的培養(yǎng)基有MS、MT、B5、DCR、KPR、WPM、BH，、K8P和KM8P。2、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)固液雙層培養(yǎng)

液體淺層培養(yǎng)(Liquidthinlayerculture)是目前較常用的培養(yǎng)方法，一般用于易分裂的原生質(zhì)體。方法：將純化后的原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基中，取少許在培養(yǎng)皿底部形成很薄的一層，封口進(jìn)行培養(yǎng)。特點(diǎn)

①操作簡(jiǎn)單，在培養(yǎng)過(guò)程中容易添加新的培養(yǎng)液；②原生質(zhì)體容易發(fā)生粘連，難于定點(diǎn)觀察；③由于經(jīng)常加入新鮮培養(yǎng)基，容易造成污染；④與細(xì)胞培養(yǎng)相似，原生質(zhì)體自身釋放的有毒物質(zhì)會(huì)影響到原生質(zhì)體再生。液體培養(yǎng)液滴培養(yǎng)(Dropletculture)做法:將原生質(zhì)體懸浮在培養(yǎng)基中，即取少許(如0.1ml)置于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放5-7滴，培養(yǎng)方法與淺層培養(yǎng)相似，不同之處在于將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)。特點(diǎn)：①有利于對(duì)原生質(zhì)體的生長(zhǎng)和發(fā)育進(jìn)行觀察；②原生質(zhì)體容易聚集于液滴的中央，并且培養(yǎng)基容易蒸發(fā)，不利于原生質(zhì)體的生長(zhǎng)。固體培養(yǎng)又叫瓊脂糖平板培養(yǎng)法或包埋培養(yǎng)法做法：將原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基后，與凝固劑按1：1混合，在培養(yǎng)皿底部形成一薄層，凝固后封口培養(yǎng)。特點(diǎn)：①它可以定點(diǎn)跟蹤和觀察原生質(zhì)體。②所釋放出的有毒物質(zhì)不易擴(kuò)散。固體培養(yǎng)(Solidculture)

做法:在培養(yǎng)皿底部先鋪一層固體培養(yǎng)基，待凝固后再在其上進(jìn)行液體淺層培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分可以被液體層中的原生質(zhì)體吸收利用，而原生質(zhì)體產(chǎn)生的有毒物質(zhì)可以被固體培養(yǎng)基吸收。

固液雙層培養(yǎng)

(Solidoverliquidculture)做法：方法將原生質(zhì)體與經(jīng)射線照射處理不能分裂的同種或不同種原生質(zhì)體混合后進(jìn)行包埋培養(yǎng)，或?qū)⑻幚淼脑|(zhì)體包埋在固體層，待培養(yǎng)的原生質(zhì)體在液體層中培養(yǎng)。飼喂層培養(yǎng)主要用于低密度原生質(zhì)體培養(yǎng)。飼喂層培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)，又叫共培養(yǎng)(Co-culture)做法：將原生質(zhì)體與其同種或不同種的植物細(xì)胞共同培養(yǎng)以提高其培養(yǎng)效率的一種方法。主要用于低密度原生質(zhì)體培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)難再生的植物?？醋o(hù)培養(yǎng)（Nurseculture）研究表明，后兩種方法可以提高原生質(zhì)體培養(yǎng)的植板率(即形成愈傷組織的原生質(zhì)體數(shù)量占所培養(yǎng)原生質(zhì)體總數(shù)的百分比)。其可能的機(jī)制是飼喂層細(xì)胞或看護(hù)細(xì)胞為待培養(yǎng)原生質(zhì)體提供了促進(jìn)生長(zhǎng)的物質(zhì)，或是吸收了待培養(yǎng)原生質(zhì)體釋放的有毒物質(zhì)，減輕了對(duì)它的影響。3、原生質(zhì)體培養(yǎng)與植株再生原生質(zhì)體平板培養(yǎng)的示意圖黑麥原生質(zhì)體培養(yǎng)與植株再生a

胚性愈傷組織

b

懸浮細(xì)胞團(tuán)c從懸浮細(xì)胞團(tuán)剛分離出來(lái)的原生質(zhì)體dFDA染色的原生質(zhì)體

e

原生質(zhì)體形成的細(xì)胞的分裂f

細(xì)胞分裂g

培養(yǎng)在瓊脂糖中的原生質(zhì)體形成愈傷組織

h

芽的形成i

植株再生愈傷組織形成細(xì)胞壁再生細(xì)胞分裂與生長(zhǎng)植株再生細(xì)胞壁的再生

原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后開(kāi)始再生新的細(xì)胞壁，一至數(shù)天內(nèi)便可形成完整的細(xì)胞壁。細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)

一般原生質(zhì)體培養(yǎng)2～7d后開(kāi)始第一次分裂，但開(kāi)始第一次分裂的時(shí)間隨植物的種類(lèi)、分離原生質(zhì)體的材料、原生質(zhì)體的質(zhì)量、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件而異。一般用幼苗的下胚軸、子葉、幼根、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、未成熟種子子葉等為材料分離的原生質(zhì)體，比用葉分離的原生質(zhì)體容易誘導(dǎo)分裂，第一次分裂出現(xiàn)的時(shí)間較快。愈傷組織形成

通常原生質(zhì)體培養(yǎng)2周后，形成多細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，3周后形成肉眼可見(jiàn)的小細(xì)胞團(tuán)，約6周后形成直徑1mm的小愈傷組織。原生質(zhì)體培養(yǎng)7～10d后需及時(shí)添加新鮮培養(yǎng)基，否則形成的細(xì)胞團(tuán)不繼續(xù)生長(zhǎng)。待小愈傷組織長(zhǎng)至約1mm時(shí)應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上使其進(jìn)一步生長(zhǎng)。植株再生原生質(zhì)體形成的愈傷組織可讓其增殖和調(diào)整狀態(tài)，再將其轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化成苗；也可直接轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上可一步成苗。4、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素

基因型外植體來(lái)源培養(yǎng)基

培養(yǎng)條件和培養(yǎng)環(huán)境滲透壓調(diào)節(jié)劑微電流作用

(1)基因型

基因型影響原生質(zhì)體的持續(xù)分裂和植株再生的現(xiàn)象已在甜菜、柑橘和油菜等作物中觀察到。

Hu等采用飼喂層培養(yǎng)蕓薹屬6個(gè)類(lèi)型的36個(gè)基因型的原生質(zhì)體，其中白菜和新疆野生油菜不能再生植株，其他類(lèi)型均能再生出植株。

Olin-Fatih培養(yǎng)白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜原生質(zhì)體，其中白菜再生的植株最少。基因型影響原生質(zhì)體持續(xù)分裂能力的作用可能與其抗逆性強(qiáng)弱和組織培養(yǎng)分化能力有關(guān)?；蛐筒町惖脑?？

(2)原生質(zhì)體來(lái)源分離原生質(zhì)體所用外植體的生理狀態(tài)與原生質(zhì)體的質(zhì)量對(duì)其后的分裂頻率有著密切的關(guān)系。

番茄葉肉原生質(zhì)體再生的愈傷組織比懸浮系原生質(zhì)體再生的愈傷組織分化早2個(gè)星期。黃瓜胚性懸浮培養(yǎng)物分離的原生質(zhì)體在4-5d恢復(fù)第一次分裂，而愈傷組織原生質(zhì)體需要7-8d?；九囵B(yǎng)基激素其他成分

(3)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基對(duì)原生質(zhì)體的分化與植株再生具有重要作用。用MS、V-KM和MS-KM三種培養(yǎng)基培養(yǎng)番茄的原生質(zhì)體，在MS-KM中植板率最高。采用D2、DCR、KM8P和TE四種培養(yǎng)基培養(yǎng)火炬松的原生質(zhì)體，在DCR培養(yǎng)基中植板率最高，體細(xì)胞胚胎發(fā)生反應(yīng)最強(qiáng)，而在D2和TE培養(yǎng)基中不能形成胚狀。用KM8P、MS(1/2NO3-)、NT和改良MS四種培養(yǎng)基培養(yǎng)棗原生質(zhì)體，在第二種培養(yǎng)基中分裂l-2次后即停止，而其他三種培養(yǎng)基則可以培養(yǎng)成功。激素以美味獼猴桃、毛花獼猴桃子葉愈傷組織以及玉米葉片為材料，原生質(zhì)體培養(yǎng)結(jié)果表明，高水平玉米素核苷(ZT)和高ZT／IAA值有利于原生質(zhì)體分裂，但高水平的ABA卻對(duì)原生質(zhì)體的分裂起到抑制作用。在獼猴桃和葡萄原生質(zhì)體培養(yǎng)中，同樣發(fā)現(xiàn)基本培養(yǎng)基中加入NAA和BA能夠提高原生質(zhì)體的分裂頻率。油菜小孢子原生質(zhì)體在無(wú)生長(zhǎng)激素的培養(yǎng)基中，有14．5％的原生質(zhì)體發(fā)生了分裂，但只形成出芽狀的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有在添加了2，4-D和NAA的培養(yǎng)基中，才能形成小愈傷組織。

其他成分檸檬酸能夠促進(jìn)菠菜原生質(zhì)體分裂。硝酸銀可提高蕓薹屬不同類(lèi)型原生質(zhì)體再生頻率。

(4)培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法光質(zhì)光質(zhì)能影響原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生，如在綠豆原生質(zhì)體培養(yǎng)時(shí)，紅光培養(yǎng)下的原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生率最高，其次為白光，在藍(lán)光中最低。并且紅光和白光對(duì)綠豆的第一次分裂有明顯的促進(jìn)作用，藍(lán)光的促進(jìn)作用小甚至沒(méi)有。溫度溫度對(duì)原生質(zhì)體細(xì)胞的分離和植株再生均有重要的影響。Sun等發(fā)現(xiàn)將甘藍(lán)型油菜原生質(zhì)體連續(xù)培養(yǎng)在32℃而不是25℃中有利于細(xì)胞開(kāi)始分裂和細(xì)胞增殖，但不利于植株再生。

(5)滲透壓調(diào)節(jié)劑滲透壓調(diào)節(jié)劑類(lèi)型較多，其作用也不一樣，主要依賴(lài)于所培養(yǎng)的植物類(lèi)型。在構(gòu)樹(shù)、人參、當(dāng)歸、川芎和紫草等藥用植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)基中，以蔗糖和果糖作碳源和滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)，細(xì)胞不能持續(xù)分裂，而用葡萄糖時(shí)，原生質(zhì)體能持續(xù)分裂并形成細(xì)胞團(tuán)。在花椰菜下胚軸原生質(zhì)體培養(yǎng)中，蔗糖作為滲透壓穩(wěn)定劑效果不如葡萄糖。(6)微電流處理已經(jīng)發(fā)現(xiàn)微電流處理能夠促進(jìn)梨屬、李屬和茄屬植物原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生，提高分裂頻率，促進(jìn)細(xì)胞團(tuán)的形成，其原因可能是與植物體自身存在微電流有關(guān)，外加微電流可能加強(qiáng)了植物體自身微電流的作用，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。五、原生質(zhì)體再生植株的遺傳與變異原生質(zhì)體再生植株的變異多表現(xiàn)為染色體倍性變異。

原生質(zhì)體再生植株的變異主要與分離原生質(zhì)體的起始材料有關(guān)。由莖尖、葉肉和胚性組織細(xì)胞分離的原生質(zhì)體能較好地保持原來(lái)的倍性。由懸浮培養(yǎng)細(xì)胞特別是長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)的細(xì)胞系分離的原生質(zhì)體，容易出現(xiàn)染色體倍性及數(shù)目的變化。

Grosser等（1984）報(bào)道由三葉草原生質(zhì)體再生的植株為二倍體（2n=16），而由培養(yǎng)細(xì)胞分離的原生質(zhì)體再生的植株為四倍體(4n=32)。第二節(jié)原生質(zhì)體融合一、概念與研究概況二、原生質(zhì)體融合的方法三、原生質(zhì)體融合的方式四、體細(xì)胞雜種的篩選與鑒定五、體細(xì)胞雜種的核質(zhì)遺傳一、概念與研究概況原生質(zhì)體融合(protoplastfusion)，是指不同親本的原生質(zhì)體不經(jīng)過(guò)有性階段，在一定條件下融合創(chuàng)造雜種的過(guò)程。表示方法：“a(+)b”，其中a和b是兩個(gè)融合親本，(+)表示體細(xì)胞雜交。

幾種表述方式細(xì)胞融合(cellfusion)體細(xì)胞雜交(somatichybridization)超性雜交(parasexualhybridization)超性融合(parasexualfusion)體細(xì)胞雜交與有性雜交的核質(zhì)遺傳特點(diǎn)原生質(zhì)體融合方法原生質(zhì)體融合方式影響原生質(zhì)體融合的因素二、原生質(zhì)體融合

1融合方法

自發(fā)融合誘發(fā)融合

NaNO3法高pH—高鈣法PEG法電融合法

NaNO3法

1909年Kuster觀察到低滲NaNO3溶液能引起發(fā)生質(zhì)壁分離的洋蔥表皮細(xì)胞原生質(zhì)體融合。1970年P(guān)ower采用0.25mol/LNaNO3溶液誘導(dǎo)燕麥與玉米根尖原生質(zhì)體融合，首次得到融合體。1972年Carlson等采用此法獲得了朗氏煙草與粉藍(lán)煙草體細(xì)胞雜種，這是植物中的首例體細(xì)胞雜種。NaNO3的作用：中和質(zhì)膜的負(fù)電荷，使原生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起.不足：誘導(dǎo)頻率不高,大約為1％，并且NaNO3對(duì)原生質(zhì)體有一定的毒害作用.

高pH-高鈣法

1973年Keller和Melchers報(bào)道:采用含高濃度Ca2+的強(qiáng)堿溶液(0.05mol/LCaCI2·2H2O+0.4mol/L甘露醇，pH10.5)處理煙草葉肉原生質(zhì)體，可以使融合頻率較大幅度增加，達(dá)到50％。之后，采用此方法成功地獲得了一批種間和屬間體細(xì)胞雜種。優(yōu)點(diǎn)：雜種產(chǎn)量高。不足：高pH值對(duì)細(xì)胞有毒害作用。PEG法

原理：PEG是一種帶負(fù)電性的高分子化合物，在原生質(zhì)體融合中起到一種橋梁作用，可以使原生質(zhì)體凝聚。在洗脫過(guò)程中，PEG將被洗掉，導(dǎo)致質(zhì)膜表面電荷重排。粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連，電荷的重排隊(duì)導(dǎo)致一個(gè)原生質(zhì)體的負(fù)性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相連而導(dǎo)致融合。-+-+-++--PEG被洗掉++--電荷重排++--原生質(zhì)體膜接觸++-融合PEG融合示意圖PEG法特點(diǎn)融合成本低，無(wú)需特殊設(shè)備；融合頻率高，融合子產(chǎn)生的異核率較高；可重復(fù)性強(qiáng)；誘發(fā)融合無(wú)特異性；毒性較低；植物+植物植物+動(dòng)物動(dòng)物+酵母不同組織原生質(zhì)體的融合

電融合

1、交流電場(chǎng)使原生質(zhì)體表面電荷偶極化，沿著電極排列，形成串珠。+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-

2、施加直流電場(chǎng)后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，開(kāi)始遺傳物質(zhì)的交流。+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-與PEG融合相比，電融合的特點(diǎn)：不存在對(duì)細(xì)胞的毒害問(wèn)題；融合效率高，“神州”四號(hào)飛船上的電融合比地面細(xì)胞的融合率高了幾倍至幾十倍。融合技術(shù)操作簡(jiǎn)便。

對(duì)稱(chēng)融合非對(duì)稱(chēng)融合配子-體細(xì)胞融合亞原生質(zhì)體-原生質(zhì)體融合2、融合方式對(duì)稱(chēng)融合對(duì)稱(chēng)融合有時(shí)也稱(chēng)作標(biāo)準(zhǔn)化融合，是親本原生質(zhì)體在融合前未進(jìn)行任何處理(如輻射、碘乙酰胺等)的一種融合方式。這一融合方式在獲得農(nóng)藝性狀互補(bǔ)的體細(xì)胞雜種方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。抗柑橘速衰病不抗柑橘裂皮病

枳抗柑橘裂皮病不抗柑橘速衰病

紅橘(+)抗柑橘速衰病+抗柑橘裂皮病體細(xì)胞雜種白菜–甘藍(lán)4n雜種細(xì)胞雜種植株原生質(zhì)體正在融合的原生質(zhì)體愈傷組織甘藍(lán)細(xì)胞(2n)白菜細(xì)胞(2n)脫分化再分化“白菜—甘藍(lán)”具有生長(zhǎng)期短，耐熱性強(qiáng)和易于貯存等優(yōu)點(diǎn)

非對(duì)稱(chēng)融合

在融合前，對(duì)一方原生質(zhì)體進(jìn)行射線照射處理，以鈍化其細(xì)胞核，另一方原生質(zhì)體不處理或經(jīng)化學(xué)試劑(如碘乙酰胺、碘乙酸、羅丹明6G等)處理，前者通常稱(chēng)為供體，后者則稱(chēng)為受體，所以也稱(chēng)供—受體融合。由于諸多因素的影響，在原生質(zhì)體對(duì)稱(chēng)融合后的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，也發(fā)現(xiàn)有染色體自發(fā)丟失從而得到非對(duì)稱(chēng)雜種或胞質(zhì)雜種的自發(fā)非對(duì)稱(chēng)現(xiàn)象。因此，對(duì)稱(chēng)融合和非對(duì)稱(chēng)融合再生的體細(xì)胞雜種均能夠獲得對(duì)稱(chēng)雜種、非對(duì)稱(chēng)雜種和胞質(zhì)雜種三種情況。配子—體細(xì)胞融合

花粉原生質(zhì)體具備單倍體和原生質(zhì)體的雙重優(yōu)點(diǎn)，可以為植物細(xì)胞工程提供新的實(shí)驗(yàn)體系。

開(kāi)展配子—體細(xì)胞融合的目的主要是獲得三倍體，以便獲得無(wú)籽的新種質(zhì)材料，如青菜與甘藍(lán)型油菜的三倍體植株的果實(shí)沒(méi)有種子。亞原生質(zhì)體—原生質(zhì)體融合

小原生質(zhì)體：具備完整細(xì)胞核但只含部分細(xì)胞質(zhì)。

胞質(zhì)體：無(wú)細(xì)胞核，只有細(xì)胞質(zhì)。

微小原生質(zhì)體：只有1條或幾條染色體的原生質(zhì)體。

微小原生質(zhì)體與原生質(zhì)體融合可得到高度非對(duì)稱(chēng)雜種，這種融合對(duì)于轉(zhuǎn)移少量核物質(zhì)、降低體細(xì)胞不親和性具有一定的意義。胞質(zhì)體是指去核原生質(zhì)體，它與原生質(zhì)體融合可以得到胞質(zhì)雜種，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器的轉(zhuǎn)移。微原生質(zhì)體微原生質(zhì)體再生的植株影響原生質(zhì)體融合的因素原生質(zhì)體的質(zhì)量

（高質(zhì)量的原生質(zhì)體是細(xì)胞融合的首要條件）融合方法融合參數(shù)（包括各種融合液的選擇）四、體細(xì)胞雜種的選擇與鑒定1、雜種細(xì)胞的發(fā)育動(dòng)態(tài)

核融合核重組細(xì)胞器重組部分核物質(zhì)或細(xì)胞器丟失核分裂的非同步性2、雜種細(xì)胞選擇系統(tǒng)外觀選擇（質(zhì)體、細(xì)胞大?。┗パa(bǔ)選擇（抗生素選擇、營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇）熒光標(biāo)記選擇（親本標(biāo)記不同的熒光）互補(bǔ)選擇法（兩次不同培養(yǎng)條件的培養(yǎng)）第一次培養(yǎng)條件只適合于甲親本而不適合乙親本，一段時(shí)間后，生存下來(lái)的是：1)未經(jīng)融合的甲親本；2)甲甲融合的產(chǎn)物；3)有甲親本基因存在的甲乙融合產(chǎn)物。轉(zhuǎn)入第二個(gè)培養(yǎng)條件，只適合乙親本原生質(zhì)體生長(zhǎng)，甲原生質(zhì)體死亡。兩次培養(yǎng)之后，能存活下來(lái)的只有具甲乙親本基因并得到互補(bǔ)的雜種細(xì)胞。異硫