檢測基因表達(dá)的方法

檢測基因表達(dá)的方法基因表達(dá)檢測是一個(gè)生物學(xué)檢測方法。背景知識(shí)熒光定量PCR技術(shù)是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過程。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，可以得到熒光擴(kuò)增曲線，計(jì)算待測樣品初始模版的量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一次由定性技術(shù)向定量技術(shù)的飛躍，運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)，可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行相對(duì)定量、絕對(duì)定量和定性分析。服務(wù)項(xiàng)目.相對(duì)定量包括RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，采用SYBRGreenl法和TaqMan探針法兩種方式，一般采用2-△△的法進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)樣本重復(fù)三次，一般情況我公司提供內(nèi)參基因引物。.絕對(duì)定量需要制備標(biāo)準(zhǔn)品并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后檢測目的樣本中的基因，比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到基因準(zhǔn)確拷貝數(shù)。送樣要求細(xì)胞（2106）、組織（N300mg）、血液（21ml）、葉片ClOOmg）等樣品材料，基因組DNA或總RNA（體積220g濃度250ng/3）。提供結(jié)果引物和探針及序列，反轉(zhuǎn)錄膠圖，原始數(shù)據(jù)（包括擴(kuò)增曲線和熔解曲線）、數(shù)據(jù)分析結(jié)果及實(shí)驗(yàn)報(bào)告。檢測基因表達(dá)的方法有哪些主要用探針檢測mRNA或用抗體檢測出表達(dá)的蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)特異mRNA的檢測和翻譯水平上對(duì)特異蛋白質(zhì)的檢測）一、外源基因轉(zhuǎn)錄水平的鑒定基因表達(dá)分為轉(zhuǎn)錄及翻譯兩階段，轉(zhuǎn)錄是以DNA（基因）為模板生成mRNA的過程，翻譯是以mRNA為模板生成蛋白質(zhì)的過程，檢測外源基因的表達(dá)就是檢測特異mRNA及特異蛋白質(zhì)的生成。所以基因表達(dá)檢測分為兩個(gè)水平。即轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)特異mRNA的檢測和翻譯水平上對(duì)特異蛋白質(zhì)的檢測。轉(zhuǎn)錄水平上的檢測主要方法是Northern雜交，它是以DNA或RNA為探針，檢測RNA鏈。和Southern雜交相同,Northern雜交包括斑點(diǎn)雜交和印跡雜交。也可用RT-PCR（reversetranscribedPCR）方法檢測外源DNA在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。其原理是以植物總RNA或mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后再經(jīng)PCR擴(kuò)增。如果從細(xì)胞總RNA提取物中得到特異的CDNA擴(kuò)增條帶，則表明外源基因?qū)崿F(xiàn)了轉(zhuǎn)錄。此法簡單、快速，但對(duì)外源基因轉(zhuǎn)錄的最后決定，還需與Northern雜交的實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合。二、外源基因表達(dá)蛋白的檢測表達(dá)蛋白的檢測方法有三種：1、生化反應(yīng)檢測法：主要通過酶反應(yīng)來檢測；2、免疫學(xué)檢測法：通過目的蛋白（抗原）與其抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行檢測，具體方法有Western雜交、能聯(lián)免疫吸附法（ELISA）及免疫沉淀法；3、生物學(xué)活性的檢測。Western雜交是將聚丙烯酰胺凝膠（SDS）電泳分離抗原（Antigen）固定在固體支持物上（如硝酸纖維素膜，NC膜）。不同分子量大小的蛋白質(zhì)在凝膠中遷移率不同，據(jù)此可確定特定的抗原存在與否以及相對(duì)豐度，或者蛋白質(zhì)是否遭到降解等。蛋白質(zhì)電泳后轉(zhuǎn)到NC膜，放在蛋白質(zhì)（如牛血清蛋白BSA）或奶粉溶液中，溫育，以封閉非特異性位點(diǎn)，然后用含有放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記的特定抗體雜交，抗原-抗體結(jié)合，再通過放射性自顯影或顯色觀察。擴(kuò)展資料外顯子與內(nèi)含子表達(dá)過程中的相對(duì)性從內(nèi)含子與外顯子的定義來看，兩者是不能混淆的，但是真核生物的外顯子也并非都〃顯〃（編碼氨基酸），除了tRNA基因和rRNA基因的外顯子完全〃不顯〃之外，幾乎全部的結(jié)構(gòu)基因的首尾兩外顯子都只有部分核甘酸順序編碼氨基酸，還有完全不編碼基酸的外顯子，如人類G6PD基因的第一外顯子核甘酸順序。已發(fā)現(xiàn)一個(gè)基因的外顯子可以是另一基因的內(nèi)含子，所這亦然。以小鼠的淀粉酶基因?yàn)槔?，來源于肝的與來源于唾液腺的是同一基因。淀粉酶基因包括4個(gè)外顯子，肝生成的淀粉酶不保留外顯子1,而唾液腺中的淀粉酶則保留了外顯子1的50bp順序，但把外顯子2與前后兩段內(nèi)含子一起剪切掉，經(jīng)過這樣剪接，外顯子2就變成唾液淀粉前基因中的內(nèi)含子。同一基因在不同組織能生成不同的基因產(chǎn)物來源于不同組織的類似蛋白，可以由同一基因編碼產(chǎn)生，這種現(xiàn)象首先是由于基因中的增強(qiáng)子等有組織特異性，它能與不同組織中的組織特異因子結(jié)合，故在不同組織中同一基因會(huì)產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄物與轉(zhuǎn)錄后加工作用。此外真核生物基因可有一個(gè)以一的poly(A)位點(diǎn)，因此能在不同的細(xì)胞中產(chǎn)生具有不同3,末端的前mRNA,從而會(huì)有不同的剪接方式。由于大多數(shù)真核生物基因的轉(zhuǎn)錄物是先加poly(A)尾巴，然后再行剪接，因此不同組織、細(xì)胞中會(huì)有不同的因子干預(yù)多聚腺甘酸化作用，最后影響剪接模式?；驒z測方法有哪些基因檢查方法是通過測序的辦法進(jìn)行，可以通過一代測序方法RT-PCR或者Sanger。近年來出現(xiàn)二代測序方法，二代測序方法和一代測序方法明顯的不同在于一代是針對(duì)個(gè)別已知的基因進(jìn)行檢查，效率低。二代檢測則是通過高通量，即基因捕獲的辦法進(jìn)行檢查，既可以對(duì)已知的基因進(jìn)行檢查，也可