基因轉(zhuǎn)染技術(shù)及其應(yīng)用簡介演示文稿

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)及其應(yīng)用簡介演示文稿第一頁，共四十八頁?；蜣D(zhuǎn)染技術(shù)及其應(yīng)用簡介第二頁，共四十八頁。

1.基因轉(zhuǎn)染:將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運送到細胞內(nèi)并使核酸在細胞內(nèi)維持其生物功能。2.基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能研究和基因治療研究。一、基因轉(zhuǎn)染簡介第三頁，共四十八頁。二、基因轉(zhuǎn)染的基本方法(一)重組子構(gòu)建(二)基因轉(zhuǎn)染真核細胞的基本方法第四頁，共四十八頁。(一)重組子構(gòu)建1.目的基因的制備和獲取2.哺乳動物細胞表達載體的選擇3.DNA片斷的重組連接4.DNA重組體的鑒定第五頁，共四十八頁。(1)目的基因

是所要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要克隆或表達的基因或基因的一個片段(2)目的基因常用的制備方法

1.目的基因的制備和獲取第六頁，共四十八頁。A.限制酶切除

a.從原核基因組DNA制備－視原核基因組物理圖譜已知或未知，克隆方法不同。

b.從真核基因組DNA制備

c.從已克隆的DNA片段制備第七頁，共四十八頁。B.

PCR或RT/PCR方法制備目的基因a.獲取已知基因

據(jù)已發(fā)表的基因序列（或基因兩側(cè)序列已知）→設(shè)計/合成一對引物→PCR（基因組DNA為模板）/RT-PCR(mRNA為模板)→從組織或細胞制備目的基因b.

構(gòu)建RT/PCR文庫法獲取未知基因

據(jù)mRNA末端如polyA尾設(shè)計共同引物→將所用mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾→采用一對共用引物擴增所有cDNA，插入適當(dāng)載體→構(gòu)成PCR－cDNA文庫篩選第八頁，共四十八頁。C.計算機克?。蠢肎enBank信息，利用不同種屬同源性設(shè)計引物，嘗試獲取未知基因片段，這有賴于各種計算機軟件的應(yīng)用。D.化學(xué)合成法制備基因片段－用DNA合成儀，對目的基因分段合成，連接，可以得到所需的目的基因。第九頁，共四十八頁。2.哺乳動物細胞表達載體的選擇哺乳動物細胞表達載體有2大類：質(zhì)粒型載體和病毒型載體（1）質(zhì)粒型載體

哺乳動物細胞質(zhì)粒型載體大多數(shù)是通過細菌質(zhì)粒而獲得的，主要是在質(zhì)粒的基礎(chǔ)上插入了一些病毒或其他一些物種及人的基因表達調(diào)控序列。A.典型的哺乳動物細胞表達載體需要以下順式作用元件:

a.啟動子b.增強子c.多聚腺苷酸化信號d.藥物選擇標(biāo)記基e.報告基因f.表位標(biāo)簽第十頁，共四十八頁。B.常用的哺乳動物表達質(zhì)粒載體a.pcDNA3.lb.pSIc.pCMV-HAd.pBudCE4.1e.pTRE第十一頁，共四十八頁。（2）病毒型載體

病毒型載體已被廣泛地用于將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎蛱鎿Q哺乳動物細胞中的缺陷基因，這類載體將來在基因治療中將具有非常重要的價值。目前應(yīng)用的病毒類型包括：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、牛痘病毒和桿狀病毒等。

A．逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

逆轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)點是，可以使外源基因整合到基因組中，因而可以被穩(wěn)定傳代和表達。但是，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入位點是隨機的，因而在基因組內(nèi)的整合有可能破壞一些內(nèi)源基因的結(jié)構(gòu)，尤其是當(dāng)插人到一些重要的基因位點時會導(dǎo)致細胞的異常。第十二頁，共四十八頁。B.腺病毒載體

易于培養(yǎng)、純化，在感染過程中復(fù)制與轉(zhuǎn)錄依賴于宿主細胞的聚合酶，可插入較大的外源基因片段，且腺病毒基因不會發(fā)生整合，是研究真核基因的良好模型。第十三頁，共四十八頁。3.DNA片斷的重組連接粘端連接方法要點平端連接方法要點①單酶單切點

防自身環(huán)化，希望定向插入；②雙酶雙切點

定向克隆，構(gòu)建表達載體的最好用此法；③利用同裂解酶產(chǎn)生相同粘端。①平端，平端連接；②Linker連接酶切產(chǎn)生粘端連接；③Adaptor銜接目的基因和載體；④同源同聚尾，克隆cDNA的最好方法⑤T載體，PCR產(chǎn)物T/A克隆法連接。第十四頁，共四十八頁。4.DNA重組體的鑒定

外源DNA片斷是否插入載體構(gòu)成重組DNA分子，而插入片斷大小，是否突變及插入位置，順序及方向則關(guān)系到構(gòu)建載體是否擴增，我們所需要的基因或表達，表達相應(yīng)的產(chǎn)品，所以需要進一步鑒定DNA重組體（1）酶切鑒定是必需的，基于下述:A.限制性圖譜個體特異性，不同的載體或DNA分子物理圖譜不同，酶切后片段大小不一樣，電泳圖譜不一樣。

B.同一載體連接不同的DNA片斷，不同的載體連接同一片段(片段上也有位點）酶切圖譜是不同的。

C.插入法(單酶單切點)或替代法(雙酶雙位點)酶切，一般來說用3種限制酶切：①可鑒定載體及②插入片段的大小,方向,切后并電泳分析,以確定是否得到預(yù)期的rDNA。第十五頁，共四十八頁。（2）若構(gòu)建DNA重組體是為了克隆某個基因，可進行在序列測定。（3）若構(gòu)建表達載體，可進行表達產(chǎn)物鑒定。第十六頁，共四十八頁。

對外源基因轉(zhuǎn)染方法的要求包括：轉(zhuǎn)移效率高，不影響細胞的正常生理活動，低毒性，容易使用，重復(fù)性好，易獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。根據(jù)轉(zhuǎn)染的機制不同可將轉(zhuǎn)染法分為：

1.化學(xué)轉(zhuǎn)染法

2.物理轉(zhuǎn)染法

3.病毒感染法

(二)基因轉(zhuǎn)染真核細胞的基本方法第十七頁，共四十八頁。1.化學(xué)轉(zhuǎn)染法

化學(xué)轉(zhuǎn)染法包括DEAE一葡聚糖法、磷酸鈣法和人工脂質(zhì)體法等。目前應(yīng)用最廣泛的是人工質(zhì)體法。

1.DEAE-葡聚糖是最早應(yīng)用哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染的試劑之一。DEAE-葡聚糖是陽離子多聚體,它與帶負(fù)電的核酸結(jié)合后接近細胞膜而被攝取。DEAE一葡聚糖轉(zhuǎn)染已成功地應(yīng)用于瞬時開始，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不可靠。第十八頁，共四十八頁。2.磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法

由于試劑易得、價格便宜而被廣泛用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定染的研究。方法是，先將DNA和氯化鈣混合，然后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細胞上，通過胞膜的內(nèi)吞作用攝人DNA。3.人工脂質(zhì)體法

脂質(zhì)體還可以介導(dǎo)DNA和RNA轉(zhuǎn)動物和人的體內(nèi)，用于基因治療。人工合成的陽離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后形成合物，當(dāng)復(fù)合物接近細胞膜時被內(nèi)吞成為內(nèi)體進入細胞質(zhì)，隨后DNA復(fù)合物被釋放進入細胞核內(nèi)。第十九頁，共四十八頁。2.物理方法

包括電穿孔、顯微注射及基因槍等方法。（1）電穿孔法利用高壓電脈沖對細胞膜的干擾，使其形成利于核酸進人的微孔。電穿孔技術(shù)可用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可方便地用于懸浮細胞，重現(xiàn)性好，但需要較多的細胞。影響轉(zhuǎn)染效率的主要因素是脈沖強度和持續(xù)時間。必須找到能夠使核酸有效釋放而又不殺死細胞的最佳平衡點。

第二十頁，共四十八頁。（2）顯微注射法該法雖然費力，但卻是非常有效的將核酸導(dǎo)人細胞或細胞核的方法。這種方法常用來制備轉(zhuǎn)基因動物，但不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細胞的研究。（3）基因槍法該法依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)人細胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細胞和在體的細胞。

第二十一頁，共四十八頁。3.病毒感染法

病毒顆粒是一類十分有效的基因釋放系統(tǒng)，因此，它是將外源基因?qū)舜罅考毎钣行У姆椒?。病毒感染具有高效率、可穩(wěn)定遺傳、適用于各種不同來源的細胞及操作簡單等優(yōu)點。但多數(shù)病毒有其潛在的危險性，操作者需要有一定的病毒操作經(jīng)驗和良好的設(shè)施。（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒（2）腺病毒第二十二頁，共四十八頁。三、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用（一）轉(zhuǎn)基因植物（二）轉(zhuǎn)基因動物（三）生物制藥（四）基因治療（五）RNAi技術(shù)第二十三頁，共四十八頁。（一）轉(zhuǎn)基因植物1.轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展簡史2.轉(zhuǎn)基因植物類型第二十四頁，共四十八頁。1.轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展簡史（1）1983年，世界第一例轉(zhuǎn)基因植物——

煙草問世（2）1996~2005年，全世界轉(zhuǎn)基因植物在21個國家種植，面積從1996年的170萬公頃增加到2005年的9000萬公頃（3）全世界轉(zhuǎn)基因作物僅種子銷售額到2005年已達52.5億美元，是1995年的63倍第二十五頁，共四十八頁。2.轉(zhuǎn)基因植物類型（1）抗除草劑基因（2）抗蟲基因（3）抗病基因（4）抗逆境基因（5）改良品質(zhì)基因第二十六頁，共四十八頁。（二）轉(zhuǎn)基因動物1.轉(zhuǎn)基因小鼠2.轉(zhuǎn)基因牛3.轉(zhuǎn)基因豬4.轉(zhuǎn)基因動物疾病模型第二十七頁，共四十八頁。轉(zhuǎn)基因動物疾病模型1.轉(zhuǎn)基因動物與心血管疾病

a.與動脈粥樣硬化和脂質(zhì)代謝有關(guān)的如LDL受體轉(zhuǎn)基因動物可增強LDL的清除；

b.apoE3基因轉(zhuǎn)基因鼠可增強LDL的清除，而突變的apoE則誘發(fā)高脂血癥，apoE4與apoE7轉(zhuǎn)基因鼠還出現(xiàn)學(xué)習(xí)與記憶能力降低、誘發(fā)腫瘤以及脾臟、腎臟腫大等。2.轉(zhuǎn)基因動物與高血壓

與血壓調(diào)控有關(guān)的如renin—angiotensinogen轉(zhuǎn)基因鼠模型出現(xiàn)高血壓，用于研究RAS(renin—angiotensinogensystem)中各成分致高血壓的作用以及相互關(guān)系第二十八頁，共四十八頁。3.轉(zhuǎn)基因動物與乙型肝炎

乙型肝炎是目前流行廣泛、危害嚴(yán)重的病毒性傳染病。由于一般實驗動物對HBV不易感，目前發(fā)現(xiàn)能夠感染HBV的動物只有靈長類，因此使得對HBV致病機理的研究很難用動物實驗的方法來進行。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的建立，為探討HBV的致病機理提供了有價值的動物模型4.轉(zhuǎn)基因動物與腫瘤研究

轉(zhuǎn)基因鼠腫瘤模型能很好地模擬體內(nèi)的生理、病理環(huán)境，與所要研究腫瘤的發(fā)生過程具有較好的一致性，而且可模擬部分癌前病變。第二十九頁，共四十八頁。（三）生物制藥1.細菌細胞2.酵母細胞3.昆蟲細胞4.哺乳動物細胞5.動物乳腺反應(yīng)器第三十頁，共四十八頁。動物乳腺反應(yīng)器

是指利用動物乳腺特異性啟動子調(diào)控元件指導(dǎo)外源基因在乳腺中特異性表達，并能從轉(zhuǎn)基因動物乳汁中獲取重組蛋白的一種生物反應(yīng)器。特點：

1.對轉(zhuǎn)基因動物的影響小

2.產(chǎn)量大，產(chǎn)品易提純，質(zhì)量高

3.表達產(chǎn)物生物活性穩(wěn)定

4.易于擴群，進行規(guī)模化生產(chǎn)

5.縮短新藥上市周期

6.可以獲取巨額經(jīng)濟利潤第三十一頁，共四十八頁。（四）基因治療

1.基因治療(genetherapy)

是指將外源功能性目的基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，通過調(diào)控目的基囚表達，抑制、替代或補償缺陷基囚，從而恢復(fù)細胞、組織或器官的生理功能，達到疾病治療目的的一種方法

2.治療方式：

（1）基因直接注射法(invivo)：

即經(jīng)靜脈或肌肉直接將帶存外源DNA的病毒、脂質(zhì)體或裸露的DNA注入患者有關(guān)組織，使其進入相應(yīng)的細胞并表達。

（2）體外基因轉(zhuǎn)移再回輸體內(nèi)的方法(exvivo)：

即將患者的體細胞(如T淋巴細胞)取出在體外培養(yǎng)并導(dǎo)入外源目的基因后重新輸回患者體內(nèi)。第三十二頁，共四十八頁。3.基因治療的策略（1）基因置換（2）基因補償（3）基因失活（4）免疫基因治療（5）活化前體藥物基因治療（6）耐藥基因治療第三十三頁，共四十八頁。（五）RNAi技術(shù)TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2006第三十四頁，共四十八頁。RNAi一、RNAi早期研究和理論形成二、參與RNAi的重要分子三、RNAi作用機制第三十五頁，共四十八頁。

一、RNAi早期研究和理論形成

(一)、RNAi早期研究

1、牽牛花實驗

1990年，Arizona大學(xué)的Rich教授在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炇覍⒆仙鼗驅(qū)胫涟珷颗；ㄖ参?，目的是想通過增加紫色素基因拷貝獲得具有更多的紫紅色的矮牽牛。結(jié)果出乎意外，增加花瓣紫色的著色失敗，一些轉(zhuǎn)基因的花出現(xiàn)全白或部分白花，色素合成不是增加了，而是減少了，事實上，不僅導(dǎo)入的基因未被表達，反而植物本身的基因也失活或受到某種程度的限制。這種現(xiàn)象稱為共抑制（cosuppression)現(xiàn)象。

第三十六頁，共四十八頁。2.秀麗線蟲實驗

1995年，Cornell大學(xué)SuGuo和Kemphues試圖以反義RNA技術(shù)特異性地阻斷秀麗線蟲par-1基因的表達以研究其功能。發(fā)現(xiàn)，給線蟲注射par-1的反義RNA時，如預(yù)期那樣阻斷了該基因的表達；但當(dāng)給對照組注射正義RNA以期觀察到該基因表達增強時，卻發(fā)現(xiàn)par-1基因同樣也被抑制了。第三十七頁，共四十八頁。3.粗糙脈孢菌實驗

1997年，意大利Cogoni等，將外源類胡蘿卜素基因?qū)胝婢植诿}孢菌（結(jié)果引起30%被轉(zhuǎn)化的脈孢自身基因失活，轉(zhuǎn)化細胞中內(nèi)源性胡蘿卜素基因也受到了抑制，這種基因失活形式稱之為抑制（quelling,基因壓制）。第三十八頁，共四十八頁。

早期的三個實驗，牽?；▽嶒灪痛植诿}孢菌實驗已經(jīng)做出了有意義的結(jié)果，但都沒有繼續(xù)研究。其中以秀麗線蟲實驗有最有意義，因為在這個實驗中給線蟲注射了正義RNA和反義RNA，但就是沒有注射二者結(jié)合起來的雙連RNA。而RNAi理論形成的形成正是基于后者。第三十九頁，共四十八頁。（二）RNAi理論形成1.RNAi理論2.RNAi概念第四十頁，共四十八頁。DiscoveryofRNAiDouble-strandedRNAinjectC.elegansNeg.controlUninjectedAntisenseRNAdsRNAsenseantisenseNature1998,391:806-811Mex-3mRNAdetectioninembryosbyinsituhybridization第四十一頁，共四十八頁。

1.RNAi理論

1998年，F(xiàn)ire和Mello運用asRNA、sRNA及dsRNA進行研究，結(jié)果非常令人吃驚，在使相應(yīng)的C.elegans基因沉默上，dsRNA的抑制效能比單一的有義或反義均有效，誘導(dǎo)基因沉默的效率高10倍。少量的dsRNA處理線蟲就能呈現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象，該抑制現(xiàn)象還可傳給第二代。第四十二頁，共四十八頁。2.RNAi概念

RNAi是指一些小的雙鏈RNA序列導(dǎo)入機體或細胞中，機體或細胞中與之有同源序列的基因的表達將會受到高效特異的抑制或阻斷