染色體微陣列的原理與臨床應用

染色體微陣列的原理與臨床應用第一頁，共七十二頁，2022年，8月28日一.出生缺陷概念及概況二.遺傳病常見診斷方法及比較三.染色體微陣列技術臨床應用四.病例分享五.染色體微陣列技術局限性、結果判讀及帶來的挑戰(zhàn)第二頁，共七十二頁，2022年，8月28日一.出生缺陷概念及概況第三頁，共七十二頁，2022年，8月28日出生缺陷也稱先天異常，是指由于遺傳因素、環(huán)境因素或兩者共同作用于孕前或孕期，引起胚胎或胎兒在發(fā)育過程中發(fā)生解剖學結構和/或功能上的異常。2012年衛(wèi)生部統(tǒng)計我國出生缺陷率達5.6%，每年新增出生缺陷患兒90-120萬例。隨著二胎政策的全面放開，孕婦年齡增加及環(huán)境因素影響，估計出生缺陷數(shù)量還會增加。保守估計，我國有上千萬的罕見病群體，幾乎無法得到有效診斷和治療，甚至遭到嚴重歧視。第四頁，共七十二頁，2022年，8月28日出生缺陷出生缺陷遺傳因素環(huán)境因素（理、化、生物因素、生活方式）遺傳+環(huán)境因素染色體異常（所有新生兒中，染色體異常占0.92%，多為新發(fā)而非遺傳）單基因突變（多為孟德爾遺傳，少數(shù)為新發(fā)）第五頁，共七十二頁，2022年，8月28日基因組：細胞核DNA成分和線粒體DNA分子的總和基因:基因組內一個個具體的結構和功能單位染色體：基因的載體細胞核DNA:46條染色體，30億個堿基，編碼21000個基因。線粒體DNA:雙鏈閉合環(huán)狀分子，16569個堿基，編碼37個基因，編碼2種rRNA、22種tRNA和13種氧化磷酸化相關蛋白。第六頁，共七十二頁，2022年，8月28日第七頁，共七十二頁，2022年，8月28日第八頁，共七十二頁，2022年，8月28日第九頁，共七十二頁，2022年，8月28日Progeriasyndrome

ApointmutationoftheLMNAgenelongevityMorethan150genespreventscholesterolbuildup第十頁，共七十二頁，2022年，8月28日

精確控制胚胎發(fā)育和分化的每一個步驟;決定了個體的所有生命特征;決定了個體患各種疾病的可能性.第十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日遺傳病：遺傳物質發(fā)生突變所引起的疾病。種類：確定的遺傳疾病超過7000種。1、單基因病--涉及一對基因，AR、AD、XR、XD、Y連鎖遺傳病。隱性遺傳4000，顯性遺傳3000。

2、多基因病--多對基因和環(huán)境共同作用所導致的疾病。

3、染色體病--數(shù)目異常及結構異常引起的疾病。4、體細胞遺傳病--體細胞突變如腫瘤。5、線粒體病--線粒體功能異常為主要起因的一大類疾病。特征：垂直傳遞、終生性、發(fā)病率低、危害嚴重、家族性發(fā)病、多無有效治療。成為危害人類健康的主要疾病。遺傳病第十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日Genetic/GenomicDisordersGenomicdisorders(number)Trisomy21Trisomy18Trisomy13MosaictrisomiesofotherchromosomesGenomicdisorders(structure)Morethan400knowndisordersMonogenicdisordersDominant(4,000)Recessive(3,000)MultigenicdisordersGenes+Environments第十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日二.遺傳病常見診斷方法及比較第十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日遺傳病的診斷染色體核型分析Karyotyping熒光原位雜交

FluorescenceInSituHybridization(FISH)染色體微陣列技術Chromosomalmicroarrayanalysis(CMA)

測序技術First-generation-SangermethodNovelsequencingtechniques第十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日傳統(tǒng)核型分析技術除了染色體非整倍體，染色體微缺失和微重復等基因組失衡是導致胎兒發(fā)育遲緩、畸形和其他先天性疾病的主要原因。Structuralvariationinthehumangenomeanditsroleindisease[J].AnnuRevMed.2010,61:437-55第十六頁，共七十二頁，2022年，8月28日第十七頁，共七十二頁，2022年，8月28日是目前較為成熟的遺傳性疾病診斷技術傳統(tǒng)核型分析技術絨毛活檢取材孕中期羊膜腔穿刺羊水細胞培養(yǎng)染色體核型分析染色體數(shù)量變化、平衡、不平衡易位、轉位和顯微鏡下可見的大片段缺失和重復。

第十八頁，共七十二頁，2022年，8月28日核型分析局限性材料受限，需要新鮮的組織、血樣進行活細胞培養(yǎng)不能分辨長度在10Mb以下染色體片斷的缺失、重復或易位染色體亞端粒區(qū)域異常診斷率較低不能檢測LOH和UPD單細胞分析

高分辨率分析第十九頁，共七十二頁，2022年，8月28日熒光原位雜交技術（fluorescentin-situhybridization，F(xiàn)ISH)可對相應位點的缺失、重復、易位及多倍體等染色體異常作出診斷提高了染色體異常的診斷精度FISH探針能同時與分裂期染色體或間期核染色絲特異雜交----無需細胞培養(yǎng)，可用于單細胞分析Chromosome13q13-14熒光標記的DNA探針中期分裂相間期細胞核Chromosome21q21第二十頁，共七十二頁，2022年，8月28日FISH局限性只能檢測已知突變的疾病，對背景未知的基因引發(fā)的疾病無法檢測。不能分辨LOH和UPD一次最多只能檢測5-8個位點，無法進行整個基因組的檢測，增加探針又會面臨準確性下降的問題。對植入前胚胎的檢測，缺乏覆蓋全基因組檢測的能力第二十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日染色體微陣列技術（chromosomalmicroarrayanalysis）微陣列比較基因組雜交(arraycomparativegenomichybridization,aCGH)SNParray第二十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日微陣列比較基因組雜交技術

(arraycomparativegenomichybridization,aCGH)

aCGH技術圖示：正常對照樣品和患者樣品基因組DNA用兩種不同的熒光染料進行標記（正常樣品用Cy3標記呈現(xiàn)綠色，患者樣品用Cy5標記呈現(xiàn)紅色）。綠色峰（Cy3）表明紅色信號缺失，與對照樣品相比患者DNA樣品發(fā)生缺失。相反如果Cy5信號增強顯示為紅色峰（紅色箭頭），表明患者DNA樣品特定基因組區(qū)域發(fā)生獲得。aCGH芯片能夠定位DNA拷貝數(shù)量變化在基因組的位置。第二十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日SNP芯片含有大量寡核苷酸探針，起初設計被用于檢測SNP等位基因。SNP芯片不僅能夠研究拷貝數(shù)變異（CNV），而且還能夠對SNP基因型進行分析SNParray第二十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日染色體微陣列(chromosomalmicroarrayanalysis,CMA)技術優(yōu)勢全基因組范圍內同時檢測染色體數(shù)目異常和結構異常如染色體微缺失(deletion)和微重復(duplication)，并能較準確的測定其大小，并精確定位。不需要細胞培養(yǎng)，可直接檢測血液、羊水(amnioticfluid,AF)和絨毛膜絨毛(chorionicvillussampling,CVS)樣本，出報告速度更快，結果更加準確可靠。檢測≥10%水平的嵌合體鑒定雜合子缺失LOH和單親二倍體(uniparentaldisomy，UPD)，親緣關系的分析。分辨率高：30Kb結合全基因擴增技術，可以進行胚胎全染色體組的檢測------PGS/PGD第二十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日自身局限性：不能檢測染色體平衡易位(相互易位、羅伯遜易位、倒位、平衡插入）不能檢測點突變及串聯(lián)重復序列擴增導致的遺傳病(如脆性X染色體綜合征）不能檢測到低于本平臺檢測下限的基因組不平衡現(xiàn)象不能檢測三倍體以上的多倍體會檢測出臨床意義不明拷貝數(shù)變異(copynumbervariants,CNVs)。第二十六頁，共七十二頁，2022年，8月28日CMA基因芯片染色體核型分析FISH檢測范圍整套染色體數(shù)目異常和微缺失、微重復結構異常整套染色體數(shù)目異常，大片段缺失、重復，平衡及不平衡易位，倒位靶向檢測細胞培養(yǎng)不需要需要兩者均可單親二倍體YesNoNo近親結婚YesNoNo分辨率30Kb5-10Mb100Kb嵌合體YesYesYes染色體芯片與傳統(tǒng)細胞遺傳學技術比較第二十七頁，共七十二頁，2022年，8月28日染色體微缺失和微重復綜合征概念：染色體微陣列技術（chromosomalmicroarrayanalysis，CMA）和熒光原位雜交技術（florescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）的應用，使許多用傳統(tǒng)染色體核型分析難以識別的染色體綜合征得以發(fā)現(xiàn)。這些綜合征缺失和重復的大小多在幾百Kb到幾兆堿基對。與單基因病不同，其癥狀受多基因影響，因而又稱連續(xù)性基因缺失或重復綜合征(contiguousgenedeletionorduplicationsyndrome）。大部分綜合征不能被染色體核型分析所識別，因而成為微缺失和微重復綜合征(microdeletionandmicroduplicationsyndrome）。

第二十八頁，共七十二頁，2022年，8月28日拷貝數(shù)變異(copynumbervariants,CNVs)：

指大于1kb染色體變異(基因組變異)，包括核型分析檢測不到的基因組微缺失和微重復，被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于人類基因組中。已有大量研究證實CNVs與許多疾病相關，包括數(shù)百種染色體微缺失、微重復綜合征，是先天畸形和神經發(fā)育障礙的主要遺傳病因，包括智力低下(mentalretardation,MR)，自閉癥(autism),精神分裂癥(Schizophrenia)等。第二十九頁，共七十二頁，2022年，8月28日三、染色體微陣列技術

臨床應用第三十頁，共七十二頁，2022年，8月28日出生缺陷干預----關注生殖全程染色體異常產前診斷孕前診斷精子產后先天性疾病診斷卵子+胚胎胎兒新生兒、兒童早期診斷早期干預改善預后夫妻雙方檢測正常再次生育再發(fā)風險低致病片段攜帶再次生育再發(fā)風險高第三十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日染色體微陣列技術臨床應用植入前遺傳病篩查和植入前遺傳病診斷(PGD/PGS)產前診斷產后遺傳病診斷反復習慣性自然流產病因分析第三十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日對植入前胚胎或卵裂球作染色體和/或基因學檢測，將無疾病胚胎植入子宮妊娠，并出生正常子代的技術輔助生殖與遺傳學技術相結合的一種產前診斷方法關鍵點是建立單細胞遺傳診斷技術孕前診斷-----植入前遺傳學診斷技術

(preimplantationGeneticDiagnosis,PGD)第三十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日高齡產婦反復體外受精失敗反復流產嚴重的男性不育癥父母為平衡易位、倒位攜帶者非整倍體是輔助生殖低妊娠率和高流產率的主要因素，PGS的目的是識別整倍體的正常胚胎轉移，以實現(xiàn)增加懷孕的機會CMA植入前胚胎遺傳學篩查/診斷適應人群1in10couples第三十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日第三十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日CMA產前診斷適應人群父母為平衡易位攜帶者胎兒B超檢查發(fā)現(xiàn)異常羊水染色體核型分析已發(fā)現(xiàn)異常，但無法確定異常染色體的確切位置或來源胎兒發(fā)現(xiàn)新發(fā)的染色體相互易位，需進一步排除微缺失和微重復希望更全面、更準確的了解胎兒染色體情況，以排除出生缺陷的可能性（生長發(fā)育遲緩，智力低下、自閉癥等原因）產前診斷第三十六頁，共七十二頁，2022年，8月28日產前診斷第三十七頁，共七十二頁，2022年，8月28日用于檢測CNV的染色體芯片（CMA)在下列情況應作為一線檢測手段非已知綜合癥的多發(fā)畸形非綜合癥型的發(fā)育遲緩/智力低下孤獨癥譜系疾病進一步明確發(fā)育遲緩、語言發(fā)育落后和其他尚不明確遺傳學病因的癥狀對于一些CMA檢出不平衡的病例，建議用細胞遺傳/FISH進行確認，同時對父母進行臨床遺傳評估和咨詢產后出生缺陷患兒遺傳病診斷第三十八頁，共七十二頁，2022年，8月28日TheAmericanJournalofHumanGenetics86,749–764,May14,2010發(fā)育障礙和智力低下等先天缺陷疾病首選CMA產后出生缺陷患兒遺傳病診斷21698例不明原因發(fā)育遲緩、低智，孤獨癥，多發(fā)畸形芯片（CMA)檢測：診斷率15%-20%核型分析：診斷率僅3%

第三十九頁，共七十二頁，2022年，8月28日金域檢驗（2013-2016）：4750例，26.3%截止2016年5月，金域檢驗已采用CMA檢測出生缺陷/遺傳病病例4750例，其中陽性病例1249例，檢出陽性率達26.3%患者臨床表型智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形、自閉癥第四十頁，共七十二頁，2022年，8月28日第四十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日患者臨床表型解析臨床表型例數(shù)陽性率智力低下16916.0%發(fā)育遲緩29625.0%多發(fā)畸形11626.7%自閉癥1237.3%癲癇1277.9%兩個系統(tǒng)的異常52329.1%三個或以上系統(tǒng)的異常64633.9%智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形等為CMA主要適應癥；合并不同臨床表型病例，CMA診斷陽性率較高；第四十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日CMA檢出CNV類型分析CMA可檢出微缺失/微重復、單親二倍體、非整倍體、嵌合體等多種CNV類型CNV片段大于5MB（核型分析檢測下限）:理想情況下核型檢出率為4.95%，遠低于CMA26.1%的檢出率。第四十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日檢出微缺失/微重復綜合征舉例第四十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日微缺失/微重復類型檢測出最常見染色體522例陽性樣本中所檢測出的UPD類型及疾病相關性第四十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日患者雙親評估十分必要為降低患者父母再生育風險，對于患者父母進行相關檢測，可有效指導其再次生育。由于CMA不能檢測染色體平衡易位，故核型分析和FISH技術在某些特定情況下仍具有優(yōu)勢。部分染色體微缺失/微重復陽性樣本按其遺傳方式分類第四十六頁，共七十二頁，2022年，8月28日小結CMA對于智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形等多種臨床異?？捎行г\斷，明顯優(yōu)于染色體核型分析，可取代其作為遺傳病診斷的一線檢測手段；對于患者雙親后續(xù)遺傳學檢測及分析，要選擇合適的方法學，做好遺傳咨詢工作，對再次生育做指導。第四十七頁，共七十二頁，2022年，8月28日第四十八頁，共七十二頁，2022年，8月28日染色體異常是導致流產的重要病因

約10%~15%妊娠會發(fā)生自然流產，其中絕大多數(shù)發(fā)生在孕早期，且50%左右是由于染色體異常所致。包括染色體數(shù)目異常占86%(包括非整倍體和多倍體)，結構異常(染色體缺失和/或重復)占6%，嵌合體占8%。（以往文獻報道）染色體芯片對流產物檢測第四十九頁，共七十二頁，2022年，8月28日目前流產物檢測常用手段為核型分析與熒光原位雜交(fluorescentinsituhybridization,FISH)。核型分析：5Mb以上遺傳物質改變，無法對許多具有致病性的染色體亞顯微結構的變異--染色體微缺失/微重復做出檢測。此外需對絨毛組織進行細胞培養(yǎng)，耗時較長，且容易污染。一些活性差的細胞生長受到抑制，或者母體細胞過度生長，這都會導致得不到準確核型。而臨床上部分流產物已不具有細胞活性，導致培養(yǎng)失敗。FISH檢測：可避免細胞培養(yǎng)，然而僅能對特異染色體數(shù)目異常進行篩查，常用探針為13、16、18、21、22、X、Y探針，無法對與特異探針結合的其它染色體數(shù)目異常進行檢測，因此存在假陰性的可能。CMA：可在全基因組范圍內同時檢測染色體數(shù)目異常和染色體微缺失、微重復等結構異常、嵌合體和ROHs等，無需細胞培養(yǎng)，實驗周期短，結果更加準確可靠第五十頁，共七十二頁，2022年，8月28日第五十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日非整倍體中16三體所占比例最高(20.5%)，且均在孕早期流產。其次為Turner綜合征(14.5%)，流產可發(fā)生孕期各階段。絕大多數(shù)染色體非整倍體為新生突變，而D組(13,14,15)和G組(21,22)有發(fā)生羅伯遜易位的可能，建議夫妻雙方做核型分析，排除羅伯遜易位的可能性。孕婦年齡為發(fā)生染色體數(shù)目異常高危因素，而本文小于35歲發(fā)生染色體數(shù)目異常導致流產占24.6%由于染色體結構異常導致流產81.25%為反復習慣性流產，提示

夫妻雙方是平衡易位(75%)，建議再次生育做PGD。染色體內部微缺失/微重復例如DiGeorge、Williams、Beckwith-Wiedemann等綜合征流產發(fā)生在孕晚期，核型分析

無法檢測。UPD第五十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日小結CMA能夠提供快速、準確的流產物全基因組分析，能夠檢測染色體數(shù)目異常、結構異常、嵌合體和ROHs等，且無需標本培養(yǎng)，能提供比傳統(tǒng)的細胞遺傳學檢測更多的遺傳信息，可為流產病因分析和對夫妻雙方再次生育指導提供更有價值的信息。指導下一次妊娠減輕患者不必要的心理負擔。第五十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日檢測標本活檢的單個卵裂球絨毛引產胎兒組織羊水臍血外周血第五十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日四.病例分享第五十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日第五十六頁，共七十二頁，2022年，8月28日AssociationofCNVwithobesity第五十七頁，共七十二頁，2022年，8月28日AssociationofCNVwithobesity第五十八頁，共七十二頁，2022年，8月28日AssociationofCNVwithepilepsy第五十九頁，共七十二頁，2022年，8月28日第六十頁，共七十二頁，2022年，8月28日癲癇神經、精神系統(tǒng)疾病，例如ADHD,精神分裂癥肥胖、矮小先天性心臟病過度生長綜合征CMA出生缺陷檢測適應癥智力低下生長、運動、語言發(fā)育遲緩多發(fā)畸形自閉癥譜系疾病主要適應癥拓展適應癥第六十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日出生缺陷患兒檢測流程第六十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日GenotypefirstvsPhenotypefirstWholegenomescreeningvsCandidateapproachGrafWD,LePichonJB,BittelDC,AbdelmoityAT,andYuS.Practiceparameter:evaluationofthechildwithmicrocephaly(anevidence-basedreview):reportofthequalitystandardssubcommitteeoftheAmericanAcademyofNeurologyandthePracticeCommitteeoftheChildNeurologySociety.Neurology.2010;74(13):1080-1.LedbetterDH.Cytogenetictechnology--genotypeandphenotype.NEnglJMed.2008;359(16):1728-30.BejjaniBAandShafferLG.Clinicalutilityofcontemporarymolecularcytogenetics.AnnuRevGenomicsHumGenet.2008;9:71-86.第六十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日63五.染色體微陣列技術局限性、結果判讀及帶來的挑戰(zhàn)第六十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日自身局限性：不能檢測染色體平衡易位(相互易位、羅伯遜易位、倒位、平衡插入）不能檢測點突變及串聯(lián)重復序列擴增導致的遺傳病(如脆性X染色體綜合征）不能檢測到低于本平臺檢測下限的基因組不平衡現(xiàn)象不能檢測三倍體以上的多倍體會檢測出臨床意義不明CNV。第六十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日由于CMA不能檢測染色體平衡易位，故染色體核型分析和FISH技術在某些特定情況下