第四章工業(yè)微生物育種誘變劑

第四章工業(yè)微生物育種誘變劑第一頁，共三十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)、物理誘變劑包括紫外線、X射線、r射線、快中子、微波、超聲波、電磁波、激光射線和宇宙線等。其中對微生物誘變效果較好,應用較廣泛的是紫外線、X射線、r射線和快中子。物理輻射可分為電離輻射和非電離輻射。一、物理誘變劑的生物學效應1、物理誘變劑對微生物的誘變作用主要是由高能輻射導致生物系統(tǒng)損傷，繼而發(fā)生遺傳變異的一系列復雜的連鎖反應過程。第二頁，共三十二頁，2022年，8月28日2、輻射引起的生物效應，根據(jù)輻射種類和微生物種類不同有所差異。3、同一種輻射線對不同微生物的效應不一樣，這與每種微生物修復系統(tǒng)的強弱有關。二、輻射引起生物效應的影響因素1．微生物的遺傳背景：G+C%2．微生物的生理狀態(tài)3．可見光4．細胞水分5．溫度尤其對于電離輻射，較高溫度能促進氧與自由基之間的相互作用、加速與DNA發(fā)生的化學反應。在氧氣充足的條件下要比在缺氧條件下的電離輻射的生物學效應顯著。第三頁，共三十二頁，2022年，8月28日三、非電離輻射——紫外線（一）紫外線的誘變機制和DNA損傷修復

1．紫外線的誘變機制有的是DNA與蛋白質的交聯(lián)．有的是胞嘧啶與尿嘧啶之間的水合作用，有的是DNA鏈的斷裂，還有的是形成嘧啶二聚體。形成嘧啶二聚體是產(chǎn)生突變的主要原因。

2．DNA損傷修復光復活切除修復第四頁，共三十二頁，2022年，8月28日（二）紫外線誘變1．紫外線有效光譜最有效的波長為253.7nm，而15w紫外燈管放射出來的紫外線大約有80％波長集中在253.7nm。

2．紫外線的輻射劑量分絕對劑量erg-1/mm2和相對劑量照射時間或者殺菌率表示。一般認為殺菌率以90％-99.9％效果較好。但也有報道，認為較低的殺菌率70—80%有利于正突變菌株的產(chǎn)生。第五頁，共三十二頁，2022年，8月28日（三）紫外線誘變的步驟與方法：（1）出發(fā)菌株細菌斜面培養(yǎng)到對數(shù)期，霉菌或放線菌則培養(yǎng)到孢子剛成熟。（2）前培養(yǎng)對細菌類以肉湯為主，適量加人核酸類物質或酵母膏等制成營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，還可加人抑制修復的物質，如咖啡堿或異煙肼等。（3）制備菌懸液

單細胞：細菌約108ml-1；放線菌約107～108ml-1，霉菌約106ml-1。（4）紫外線照射3-5ml，攪拌；避光，提前20min預熱紫外燈。結束時冰浴1-2h。第六頁，共三十二頁，2022年，8月28日（5）后培養(yǎng)冰浴后的菌懸液加人到適合于正突變體增殖的培養(yǎng)基中，在適宜溫度下培養(yǎng)1.5～2h。有些在增殖培養(yǎng)基中加人適量的酪素水解物、色氨酸或異煙肼等物質，可以抑制修復，有利于突變體繁殖和減少細胞懸液在貯存過程中的死亡。第七頁，共三十二頁，2022年，8月28日3．電離輻射的照射方法菌懸液較好，不宜過多。照射后冰浴2-3h低溫可降低或抑制修復酶的活性。四、電離輻射1．常用于誘發(fā)突變：快中子、X射線線和r射線等。2．電離輻射劑量拉德（rad）也可以轉成倫琴（R）；不同種類菌種最適的劑量范圍不同；對不同的射線的敏感度也不同；不宜反復照射。殺菌率90％-99.9％為宜。第八頁，共三十二頁，2022年，8月28日五、近年的新型誘變劑1．微波2．紅外射線3．激光4．高能電子流5．離子注入第九頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)化學誘變劑化學誘變劑的劑量主要決定于其濃度和處理時間?；瘜W誘變劑都具毒性，其中90%以上是致癌物質或極毒藥品，使用時要格外小心，不能直接用口吸，避免與皮膚直接接觸，不僅要注意自身安全，也要防上污染環(huán)境，造成公害?；瘜W誘變劑是一類能對DNA起作用、改變其結構、并能引起遺傳變異的化學物質。第十頁，共三十二頁，2022年，8月28日一、堿基類似物

用于誘發(fā)突變的堿基類似物有5-BU、5-FU、BUdr、5－IU等他們是胸腺嘧啶的結構類似物，AP、6-MP是腺嘌呤的結構類似物。最常用是5－BU和AP。

當將這類物質加人到培養(yǎng)基中，在繁殖過程中可以摻人到細菌DNA分子中，不影響DNA的復制。它們的誘變作用是取代核酸分子中堿基的位置，再通過DNA的復制，引起突變，因此，也叫摻人誘變劑。顯然這一類誘變劑要求微生物細胞必需處在代謝的旺盛期，才能獲得最佳的誘變效果。第十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日（一）堿基類似物的誘變機制

正常的堿基存在著同分異構體，互變異構現(xiàn)象在嘧啶分子中以酮式和烯醇式的形式出現(xiàn)，而嘌呤分子中以氨基和亞氨基互為變構的形式出現(xiàn)、一般互變異構現(xiàn)象在堿基類似物中比正常DNA堿基中頻率更高。5-BU導致AT堿基對轉換為GC堿基

2-氨基嘌呤也可以誘發(fā)DNA分子中AT－GC或GC－AT的轉換。第十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日（二）堿基類似物的誘變處理方法（以5-BU為例）1．單獨處理

將微生物液體培養(yǎng)到對數(shù)期，離心除去培養(yǎng)液，加入生理鹽水或緩沖液，饑餓培養(yǎng)8-10h，消耗其體內的貯存物質，將5-BU加入到經(jīng)饑餓培養(yǎng)的培養(yǎng)液中，處理濃度為25-40ug／ml，混合均勻．取0.1-0.2ml菌懸液加人到瓊脂培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)。在適宜溫度下，使之在生長過程中誘變處理。培養(yǎng)后挑取單菌落，進行篩選。如果是處理真菌、放線菌孢子，則要提高5-BU的濃度，常處理濃度為0.1mg／ml。第十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日2．與輻射線復合處理

據(jù)報道，如果菌體先用5-BU等堿基類似物進行處理，使它們首先滲人到DNA分子中，然后用輻射線照射，誘變效果會比單獨使用射線要好。因此堿基類似物也是一種輻射誘變的增敏劑，從而提高突變率。第十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日二、烷化劑（一）烷化劑的作用機制

烷化劑分單功能烷化劑和雙功能或多功能烷化劑兩大類。前者僅一個烷化基團，對生物毒性小，誘變效應大。后者具有兩個或多個烷化基團，毒性大，致死率高，誘變效應較差。主要原因是雙功能烷化劑有硫芥、氮芥。第十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日

烷化劑主要是通過烷化基團使DNA分子上的堿基及磷酸部分烷化，DNA復制時導致堿基配對錯誤而引起突變，堿基中容易發(fā)生烷化作用的是嘌呤類。其中鳥嘌呤N7是最易起反應的位點，幾乎可以和所有烷化劑起烷化作用；此外，DNA分子中比較多的烷化位點是鳥嘌呤O6和胸腺嘧啶O4，這些可能都是引起突變的主要位點。其次引起烷化的位點是鳥嘌呤N3、腺嘌呤N2，腺嘌呤N7和胞嘧啶N3。這些位點引起堿基置換的僅占烷化作用的10％左右。因此，由這些位點改變所引起的突變僅是少數(shù)。烷化劑也能造成磷酸和核糖之間的共價鍵斷裂，而造成突變。第十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日（二）烷化劑的性質

溶液烷化劑的性質比較活潑，不太穩(wěn)定，在水溶液中容易發(fā)生分解。它們大部分半衰期很短，其長短與溫度、溶液PH關系很大。因此，化學誘變劑要現(xiàn)用現(xiàn)配還要避光。配制烷化劑時，要采用合適的緩沖液。有毒?。。?！第十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日（三）常用的烷化劑1、亞硝基胍（NTG）黃色晶體物質，性質不穩(wěn)定，容易光解，黃色變?yōu)榫G色時，誘變效應際低。有超誘變劑之稱，常用緩沖溶液有磷酸緩沖液和Tri緩沖液。第十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日

誘變處理方法：①用一定值的磷酸緩沖液或Tri緩沖液洗制成菌懸液。②NTG母液：配制需加助溶劑甲酰胺或丙酮少許，然后加緩沖液，其比例為緩沖液9ml：NTG丙酮溶液lml，濃度為NTG1mg/ml；使用時取母液0.2ml+菌懸液1.8ml，NTG終濃度為100ug/ml。一般隨菌種不同而異，細菌一般為100-1000ug/ml，放線菌、真菌為l000-3000ug/ml。③放線菌在生長適宜的溫度下培養(yǎng)，（細菌30-35℃、真菌25-28℃、放線菌30-32℃）處理若干時間，一般細菌20-60min,孢子90-120min④終止反應。冷的生理鹽水50倍稀釋處理，或經(jīng)過離心洗滌處理，作一定稀釋度分離于平皿。如果是細菌，把培養(yǎng)基按一定濃度加入到菌體沉淀物中，振蕩培養(yǎng)1.5-2h，經(jīng)2-3次細胞分裂，再涂平皿。第十九頁，共三十二頁，2022年，8月28日處理完畢后，馬上把接觸過NTG的器皿用NaOH浸泡處理。NTG除以上直接以溶液處理外，還可以按以下方法誘變處理，搖瓶振蕩處理：在接菌后的培養(yǎng)基中加人5-10ug/mlNTG．并加幾滴吐溫60或吐溫80，使成乳化狀（注意吐溫對該菌生長是否有影響）；在平皿上生長過程處理：如果將NTG、瓊脂和菌體混合制成平板，NTG濃度為10-50ug/ml。或將瓊脂培養(yǎng)基制成平板．然后將NTG和菌體混合涂抹平板，此時NTG濃度為10-20ug/ml。第二十頁，共三十二頁，2022年，8月28日

經(jīng)后培養(yǎng)的培養(yǎng)液．除部分進行平皿分離外。剩余的培養(yǎng)液可以加人適量的藥物，保存于冰箱內數(shù)天。如日本有人把經(jīng)過NTG處理后的大腸桿菌培養(yǎng)液，用50％甘油（最終濃度為12.5％）于-40℃、-80℃保存。在以后數(shù)天內隨時可取出融化，稀釋分離，突變體死亡很少。據(jù)報道，無論是用輻射處理，還是用化學誘變劑處理后的菌懸液或培養(yǎng)液，浸在冰浴中2-3h，試驗的重復性很好。認為在大腸桿菌、枯草桿菌和放線菌等可以采取這一措施來提高誘變效果。NTG是一種強烈致癌物質，操作時要帶橡皮手套，穿工作服，帶口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風櫥中進行。凡接觸過NTG的器皿必須及時、單獨處理，利用自來水大量沖洗或用1-2N的NaOH浸泡過夜，洗凈。第二十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日2．甲基磺酸乙酯（簡稱EMS）甲基磺酸乙酯是磺酸酯類中誘變效果較好的一種烷基化合物，外觀呈粉末狀或無色液體，難溶于水，不穩(wěn)定，易水解成無活性物質。EMS的誘變處理方法：①EMS母液的配制：為了安全和防上失效，配制前將需用的器皿，置冰箱內預冷，然后在冰浴中進行配制。取0.5mlEMS原液，加人到10mlpH7.2磷酸緩沖液中，加蓋，并輕輕轉動試管。由于在水溶液中易失效，故盡可能低溫保藏，并要現(xiàn)用現(xiàn)配。第二十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日②取新鮮的菌體，經(jīng)前培養(yǎng)至對數(shù)期．離心洗滌，用緩沖液制成8ml菌懸液（107-108ml-1）。對于絲狀菌孢子，則前培養(yǎng)至萌動期，懸液含106ml-1。③取EMS母液2ml，加人到以8ml的菌懸液中。在適宜溫度下處理一定時間（根據(jù)預實驗結mol／L。④EMS處理一定時間后，用50倍生理鹽水稀釋或加入一定量的2%NaS2O3溶液或多次離心、洗滌，以終止反應。EMS是劇毒的誘變劑，在整個誘變過程，包括配制藥品、操作處理、保存等都要嚴守安全，不能接觸皮膚，所有接觸過EMS的器皿，單獨用大量水沖洗洗滌，或用10％NaS2O3溶液浸泡過夜，再用清水沖洗干凈。第二十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日三、脫氨劑亞硝酸是一稀常用的誘變劑，毒性?。环€(wěn)定，易揮發(fā)．其鈉鹽易在酸性緩沖液中產(chǎn)生NO和NO2（一）亞硝酸的誘變機制脫去堿基中的氨基變成酮基，引起轉換而發(fā)生變異。A→H，C→U，G→X。A：T→G：C和G：C→A：T。亞硝酸的誘變也可以發(fā)坐回復突變。亞硝酸除了脫氨基作用外，還可引起DNA交聯(lián)作用，DNA復制，從而導致奕變。第二十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日（二）亞硝酸的處理方法1．試劑的配制（1）1mol／LpH4.5醋酸緩沖液（2）0.1mol／L亞硝酸鈉溶液（3）0.07mol／LpH8.6磷酸氫二鈉溶液以上試劑用前均要滅菌。第二十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日2．處理方法

取孢子懸液1ml，pH4.5醋酸緩沖液2ml及硝酸鈉溶液lml，最后處理濃度為0.025mol／L；25-26℃保溫10-20min，加入的磷酸氫二鈉溶液20ml，使pH下降至pH6.8左右，以終止反應。稀釋分離于平板。如果是處理細菌，亞硝酸最后濃度以0.05mol／L。在亞硝酸處理菌體或孢子時要嚴格控制好溫度，否則會影響誘變效果。第二十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日四、移碼誘變劑移碼誘變劑與DNA相互結合引起堿基增添或缺失而造成突變。它們主要包括吖啶黃、吖啶橙、ICR－171、ICR-191等。移碼誘變劑對噬菌體有強烈的誘變作用，誘發(fā)細菌、放線菌的質粒脫落比其他誘變劑效果更為顯著。如某些產(chǎn)生抗生素的放線菌。用處理后，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量明顯下降，主要就是由于控制抗生素合成的質粒脫落造成的。第二十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日吖啶黃的性質和使用方法：淡黃色晶體，微溶于熱水，溶于乙醇和乙醚，不穩(wěn)定，見光易分解。使用時，先用少許乙醇溶解，配成一定濃度的母液。通常處理方法是特將它們加入培養(yǎng)基中，使最后濃度為10-50ug/ml，混合后制成平板，適溫培養(yǎng)，在生長過程中處理。另外還可將吖啶黃加人到培養(yǎng)液中，濃度為10-20ug/ml，在適溫條件下，振蕩培養(yǎng)過程中處理。第二十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日五、羥化劑【以羥胺為例】羥胺的簡稱HA，常以鹽酸羥胺形式存在，為白色晶體，溶于水，不穩(wěn)定易分解，具腐蝕性。1.羥胺的誘變機制當羥胺濃度為0.1-1.0mol／LpH6.0時，主要與胞嘧啶反應，使羥化的C與A配對，在0.1-1.0mol／LpH9.0，羥胺可以與鳥嘧啶反應，10-3mol／L時，羥胺可以與胸腺嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶