ET-1對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞增殖與分泌的作用,生理學(xué)論文

ET-1對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞增殖與分泌的作用,生理學(xué)論文腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞移植對(duì)治療各種原因引起的腎上腺皮質(zhì)功能不全具有廣闊的應(yīng)用前景，但研究中發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)細(xì)胞再生不完全，產(chǎn)生的皮質(zhì)激素也不能完全知足生理需要。內(nèi)皮素(ET)-1是最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)之一，具有促進(jìn)多種組織細(xì)胞增殖與分泌的作用，在體內(nèi)可增加大鼠腎上腺自體移植物的增殖和分泌。本文通過研究ET-1對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞增殖與分泌的影響，進(jìn)一步討論大鼠腎上腺細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)的生長特性，以期優(yōu)化腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)方案，為腎上腺細(xì)胞移植提供最適宜的條件。

1、材料與方式方法

1.1材料

2周齡SD大鼠(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)30只，膠原酶I型(Sigma公司，美國)，DNA酶I型(LABEST公司，北京)，DMEM∕F-12培養(yǎng)基、胎牛血清，原代消化液(DMEMF-12培養(yǎng)基配制，內(nèi)含1mg/mL膠原酶I型、5g/mLDNA酶I型)，培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、手術(shù)器械，ET-1(Enzo公司，美國)，鼠抗人PCNA單克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司，中國)，SP-9002免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋公司，中國)，皮質(zhì)酮放免法試劑盒(中國原子能研究院同位素研究所，中國)。

1.2原代培養(yǎng)大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞

取大鼠腎上腺，剪碎后置于消化液(1g/L膠原酶I型，5mg/LDNA酶I型)中消化，并接種于培養(yǎng)皿中原代培養(yǎng)，12d后傳代。取傳代培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長期大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，等濃度接種于96、12孔板，分別進(jìn)行MTT法及免疫組化實(shí)驗(yàn)。

1.3ET-1對(duì)細(xì)胞增殖與分泌的影響

MTT法：取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5104/mL，每孔100L接種于96孔板中，共接種88孔，分11組(10個(gè)實(shí)驗(yàn)組，1個(gè)對(duì)照組〕，每組8孔。過夜后棄上清液，10個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別參加含10倍濃度(10-6~-15mol/L)梯度的ET-1培養(yǎng)基，對(duì)照組8孔換不含ET-1培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)36h后以MTT法檢測各孔吸光度值。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，計(jì)算各組平均吸光度值。免疫組化及放射免疫法：等細(xì)胞濃度傳代培養(yǎng)于12孔板中，培養(yǎng)板各孔預(yù)先放置無菌玻片。一次接種2個(gè)培養(yǎng)板，共24孔，分6組(5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，1個(gè)對(duì)照組〕，每組4孔。培養(yǎng)箱中過夜后棄上清液，5個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別參加含10倍濃度(10-8~-12mol/L)梯度ET-1培養(yǎng)基，對(duì)照組4孔換不含ET-1培養(yǎng)基。完成后天天顯微鏡觀察各孔細(xì)胞生長狀況，或有無明顯生長速度差異不同。于第5d終止培養(yǎng)，汲取各孔培養(yǎng)液留EP管，以放射免疫法檢測各孔皮質(zhì)酮濃度，計(jì)算各組均值。吸出培養(yǎng)液后取出各孔玻片，以細(xì)胞爬片免疫組化檢測細(xì)胞增殖因子(PCNA)的表示出，圖像軟件分析染色的陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，以平均光密度值來表示細(xì)胞染色的陽性率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xs表示。各組間吸光度值以及皮質(zhì)酮濃度比擬采用方差分析及兩兩比擬的SNK檢驗(yàn)，細(xì)胞PCNA陽性率采用卡方檢驗(yàn)。

2、結(jié)果

2.1大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)

兩組腎上腺細(xì)胞原代培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)類似，胞體呈圓形或多角形，胞體大，細(xì)胞質(zhì)透亮，內(nèi)有很多大小較為規(guī)則的顆粒。實(shí)驗(yàn)觀察在同批次等細(xì)胞濃度接種條件下，ET-1濃度10-10~-12mol/L組比對(duì)照組增殖速度更快，傳代時(shí)間更短(圖1，封1)。

2.2MTT法檢測ET-1對(duì)細(xì)胞增殖的影響

隨著培養(yǎng)液中ET-1濃度的升高，接種于96孔板中的10組細(xì)胞，吸光度值呈一單峰波形。在第6組(10-10mol/LET-1)處獲得最高值，單因素方差分析結(jié)果顯示各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。采用SPSS軟件行SNK各組均數(shù)間的多重比擬，發(fā)現(xiàn)處于波峰的6、7組(10-10~-11mol/L組)吸光度值與1~4，8~10組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(圖2)。

2.3PCNA的表示出及培養(yǎng)液中皮質(zhì)酮濃度

接種于24孔板的6組細(xì)胞，免疫組化檢測的PCNA表示出率與放射免疫法檢測的皮質(zhì)酮濃度呈大體一致的升降趨勢(表1)，在10-10~-11處獲得最高峰值，單因素方差分析結(jié)果顯示各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。采用SPSS軟件行SNK各組均數(shù)間的多重比擬，發(fā)現(xiàn)10-10~-11組與各組比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。細(xì)胞免疫組化圖像見圖3(封1)。

3、討論

腎上腺細(xì)胞體外培養(yǎng)是研究腎上腺細(xì)胞移植的第一步。在體外培養(yǎng)條件下可觀察細(xì)胞生長、增殖及分泌的特性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠腎上腺細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)經(jīng)過中觀察到加或不加ET-1，細(xì)胞增殖及生長速度呈一定差異。進(jìn)一步研究不同濃度ET-1對(duì)細(xì)胞的影響，分組檢測細(xì)胞增殖因子PCNA的表示出，及培養(yǎng)液中皮質(zhì)激素的濃度，發(fā)如今10-10~-11mol/L時(shí)，細(xì)胞增殖與分泌最旺盛，而且僅在這里適宜濃度下才具刺激細(xì)胞增殖的作用，在較高或較低濃度下均對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響。

在體外培養(yǎng)條件下，ET-1能促進(jìn)在正常情況下分裂增殖能力極弱的黑素細(xì)胞的增殖?？梢源龠M(jìn)大鼠骨髓內(nèi)皮前體細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞向s期和G期轉(zhuǎn)化。在體內(nèi)試驗(yàn)中，VENDEIRA等發(fā)現(xiàn)ET-1可使腎上腺自體移植大鼠的血漿醛固酮和皮質(zhì)酮濃度在短時(shí)間內(nèi)顯著增加，結(jié)締組織被膜下分泌醛固酮的細(xì)胞顯著增生，提示其可能具有促進(jìn)皮質(zhì)細(xì)胞增生的作用。ROSSI等研究發(fā)現(xiàn)，人體腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞表示出ET-1的兩種受體(ETA、B)。ET-1通過作用于這兩種受體，可明顯促進(jìn)糖、鹽皮質(zhì)激素的分泌，通過ETA受體可促進(jìn)球狀帶細(xì)胞的增殖。而人體腎上腺能以自、旁分泌的形式產(chǎn)生少量ET-1，對(duì)腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。在體外培養(yǎng)條件下，ET-1只要在接近皮質(zhì)細(xì)胞體內(nèi)正常生理濃度時(shí)，才能發(fā)揮作用。

這與其他多肽類激素在受體飽和前濃度越高效果越顯著的特點(diǎn)不一樣。這也解釋了這次實(shí)驗(yàn)為什么ET-1只要在適宜濃度(10-10~-12mol/L)時(shí)才具促進(jìn)皮質(zhì)細(xì)胞增殖與分泌的作用。因而，能夠以為ET-1是腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞生長代謝的重要調(diào)節(jié)激素，參加接近體內(nèi)條件下的ET-1，可有效促進(jìn)體外培養(yǎng)時(shí)皮質(zhì)細(xì)胞的增殖及分泌功能，增加皮質(zhì)細(xì)胞的活力，更有利于后期腎上腺細(xì)胞移植的進(jìn)行。同時(shí)其促進(jìn)球狀帶細(xì)胞增殖的作用，有望改善移植后球狀帶細(xì)胞缺乏、鹽皮質(zhì)激素水平低下的情況。

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