人源抗狂犬病毒特免血漿篩查方法的建立

人源抗狂犬病毒特免血漿篩查方法的建立【摘要】

目的

用ELISA法對(duì)人源抗狂犬病毒抗體血漿進(jìn)行篩查。辦法

采用國(guó)內(nèi)幾家狂犬病毒IgG抗體診斷試劑盒〔ELISA法〕，結(jié)合小鼠中和試驗(yàn)測(cè)定法，對(duì)經(jīng)0、3、7、14、28日程序免疫的供漿員之血樣進(jìn)行抗狂犬病毒抗體效價(jià)檢測(cè)。結(jié)果

與小鼠腦內(nèi)中和法比擬，使用不同廠家ELISA試劑盒，檢測(cè)結(jié)果存在一定差別，其中C、D廠家試劑盒檢測(cè)結(jié)果比擬接近，線性關(guān)系較好〔分別為：r＝0.997；r＝0.996〕，可以替代小鼠腦內(nèi)中和法作為采漿站血漿初篩的辦法。結(jié)論

經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選與比擬，為大規(guī)模篩查抗狂犬病毒特免血漿提供了技術(shù)條件?！娟P(guān)鍵詞】抗狂犬病毒抗體；狂犬病疫苗；ELISA；檢測(cè)；中和試驗(yàn)

Establishmentofmethodtoscreeninghumananti-rabiesviruspositiveplasma

【Abstract】Objective

ThepositivehumanplasmacontainingantibodyagainstrabiesviruswasscreenedwithELISAkit.Methods

TheIgGantibodydiagnostickits(ELISAmethod)obtainingfromseveralmanufacturesinourcountrywereadoptedtoscreentheantirabiesviruspositiveplasmacombiningwiththemiceneutralizationtest.Thelevelofantibodyagainstrabiesviruswasdeterminedinbloodsamplesofdonorsthatwereimmunizedwithrabiesvaccineondays0,3,7,14and28inschedule.Results

ItshowedthattestresultsofELISAkitproducedinmanufactureCandDissimilar,theirlinearcorrelationisbetter(rc=0.997,ra=0.996respectively).Conclusion

ThemiceneutralizationtestcanbereplacedbyELISAkitmethods.

【Keywords】antibodyagainstrabiesvirus；rabiesvaccine；ELISA；neutralizationtest；screening

狂犬病是一種嚴(yán)重危害人類生命的人畜共患疾病，主要通過(guò)帶狂犬病毒的動(dòng)物傳播給人類，發(fā)病后致死率為100％。據(jù)衛(wèi)生部2022年10月頒布的數(shù)字說(shuō)明，病死率仍居我國(guó)法定傳染病的第2位，據(jù)調(diào)查，近年來(lái)狂犬病發(fā)病呈回升趨勢(shì)，目前尚無(wú)治療狂犬病的有效藥物。雖然狂犬病抗血清對(duì)預(yù)防狂犬病起著重要作用，但其來(lái)源因系異源性蛋白而副反饋較大，使用中易發(fā)生變態(tài)反饋和血清病，其發(fā)生率為15％～45％［1］，而且對(duì)某些疫苗的抗體反饋有抑制作用［2］，使用人源狂犬病免疫球蛋白〔HRIG〕那么克服了上述缺點(diǎn)，與異源抗體相比，具有在血液中維持時(shí)間較長(zhǎng)、愛護(hù)效果好的優(yōu)點(diǎn)，這使得HRIG的需求量越來(lái)越大［3］，為此，我們于2022年末開始進(jìn)行人源抗狂犬病抗體血漿的篩查工作，目的是早日開發(fā)出平安有效的HRIG制品。但由于辦法學(xué)的限制，?中華人民共和國(guó)藥典2022年版三部〔附錄ⅪJ〕》規(guī)定的小鼠效力中和試驗(yàn)〔NIH〕［4］辦法難于做大規(guī)模的檢測(cè)。為尋找適合的辦法，筆者曾建立了間接ELISA法測(cè)定狂犬病毒抗體的辦法，并進(jìn)一步證實(shí)了該辦法與小鼠中和法有良好的相關(guān)性，但現(xiàn)有ELISA法在實(shí)際應(yīng)用中有靈敏度不高、且存在漏檢的問題。為解決上述問題，筆者結(jié)合小鼠中和法對(duì)國(guó)內(nèi)4個(gè)ELISA廠家的狂犬病毒抗體ELISA診斷試劑盒進(jìn)行篩選和比擬，獲得了較稱心的結(jié)果。

1材料與辦法

1.1

材料

1.1.1

狂犬病毒抗原

狂犬病毒北京固定毒AG株適應(yīng)地鼠腎細(xì)胞傳代培養(yǎng)的病毒懸液經(jīng)滅活初步純化后的疫苗原液，由蘭州生物制品研究所疫苗四室提供。

1.1.2

ELISA檢測(cè)試劑

ELISA定量檢測(cè)人抗狂犬病抗體診斷試劑〔批號(hào)分別為：20220703、20220301、20220302、20220801〕分別由蘭州生物制品研究所、寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司、武漢生物制品研究所、珠海海泰生物制藥有限公司提供〕，抗狂犬病參考血清由中國(guó)藥品生物制品檢定所惠贈(zèng)。

1.1.3

人用狂犬病疫苗和工作對(duì)照品

人用濃縮狂犬病疫苗〔≥2.5IU/瓶〕，批號(hào)20220401、20220403、20221101。工作對(duì)照品〔HRIG〕批號(hào)9008。以上制品均由蘭州生物制品研究所生產(chǎn)。

1.1.4

實(shí)驗(yàn)樣本

狂犬病毒抗體陽(yáng)性血漿20份〔SNT效價(jià)≥10IU/ml〕，陰性血漿100份，均由蘭州生物制品研究所血液制劑室提供。

1.2

辦法

首先對(duì)供漿者進(jìn)行0、3、7、14、28日程序狂犬疫苗注射，于最后一針1個(gè)月后采集血樣，用ELISA試劑盒檢測(cè)其相對(duì)效價(jià)，將此血樣與規(guī)范品進(jìn)行系列稀釋，分別與狂犬病毒懸液結(jié)合，小鼠腦內(nèi)注射，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)，察看小鼠存活和死亡情況，測(cè)定出供試品效價(jià)，之后再用小鼠中和法試驗(yàn)SNT效價(jià)進(jìn)行比擬。將中和法測(cè)得SNT效價(jià)結(jié)果≥10IU/ml的樣品，再用其他三家ELISA［4］試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。最終篩選出與小鼠中和法試驗(yàn)結(jié)果相接近的試劑盒作為大規(guī)模篩查狂犬病抗體陽(yáng)性血漿初篩試劑盒，設(shè)計(jì)出能滿足單采漿站特異性免疫血漿篩選的需要和可靠的收漿計(jì)劃。

2

結(jié)果

2.1

初免后兩種檢測(cè)辦法的比擬

按0、3、7、14、28日程序免疫后1個(gè)月采集的血樣用兩種辦法檢測(cè)的結(jié)果比擬，見表1。表1

初免后兩種檢測(cè)辦法的比擬〔略〕注：蘭生所試劑〔批號(hào)為20220703〕

從表1可以看出，小鼠中和法與A廠家ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果存在很大差別，從而導(dǎo)致了大量的特免血漿漏檢。

[1]

[2]

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2.2

不同廠家ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果比擬

經(jīng)小鼠中和法測(cè)得SNT效價(jià)〔≥10IU/ml〕樣品與其他三個(gè)生產(chǎn)廠家試劑盒檢測(cè)結(jié)果比擬，見表2。表2

不同廠家ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果比擬(略)注：樣品1～7號(hào)為同一供漿者不同次血漿樣，8～9號(hào)為同一供漿者。不同次血漿樣中，小鼠中的樣品作過(guò)一次。海泰批號(hào)為202201

從表2可以看出，采用B、C、D廠家ELISA試劑盒經(jīng)中和法測(cè)得SNA≥10IU/ml的9份血樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，B、D廠家ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果與中和法SNT值接近。

2.3不同ELISA試劑盒規(guī)范曲線比照

以9008批HRIG為工作參考品，用不同ELISA試劑盒測(cè)得的線性關(guān)系比擬，見表3。表3

不同ELISA試劑盒規(guī)范曲線比照〔略〕注：工作參考品為98008HRIG凍干品經(jīng)小鼠中和法測(cè)得效價(jià)為60IU/ml

從表3可以看出，以HRIG〔批號(hào)：98008〕為工作參考品的檢測(cè)結(jié)果可以看出，B、DELISA生產(chǎn)廠家的試劑盒線性關(guān)系較好〔分別為：r＝0.997，r＝0.996〕，可以作為初篩狂犬免疫血漿的首選試劑。

3討論

ELISA檢測(cè)辦法與小鼠中和法的比擬：早在20世紀(jì)末國(guó)內(nèi)就有人［4］將ELISA與小鼠中和試驗(yàn)進(jìn)行了比擬，兩者已經(jīng)有了很好的一致性。蘇軍英等［5］在vero細(xì)胞狂犬病疫苗免疫人的效果察看中，用ELISA與MNT、RFFIT三種辦法進(jìn)行比擬，也有相似的結(jié)果［6，7］。在實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的結(jié)果也證實(shí)上述兩種辦法具有良好的正相關(guān)性。同時(shí)通過(guò)在ELISA實(shí)驗(yàn)中同步設(shè)立了已知的SNT效價(jià)的陽(yáng)性對(duì)照作為工作參考規(guī)范，最大限度地減少其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。針對(duì)大規(guī)模人源性狂犬病毒特異性免疫血漿的采集工作的需要，實(shí)驗(yàn)中根據(jù)稀釋陽(yáng)性對(duì)照規(guī)范的ELISA測(cè)定結(jié)果繪制規(guī)范曲線作為參照，建立了有效的收漿計(jì)劃［8］，從而克服了小鼠中和法諸如檢測(cè)周期長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)條件復(fù)雜、費(fèi)用高、其檢測(cè)樣品受到限制等不利于采漿站大規(guī)模初篩特異性免疫血漿的要求。為加快HRIG制品的研制、開發(fā)提供了技術(shù)條件。

【參考文獻(xiàn)】

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7MebatsionT,Sillero-zc,GottelliD.DetectionofrabiesantibodybyELISAandRF