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血紅蛋白液制備
血紅蛋白電泳
,血紅蛋白電泳
HemoglobinElectrophoresis原理pH8.6血紅蛋白的等電點(diǎn)小于緩沖液的pH值時(shí),血紅蛋白帶負(fù)電,在電場(chǎng)中,從負(fù)極向正極泳動(dòng)由于不同血紅蛋白所帶電荷不同,分子量不同,其泳動(dòng)的速度不同,可以分離出各自的區(qū)帶操作血紅蛋白液的制備√浸膜√pH8.5TEB緩沖液中浸透,用濾紙吸干點(diǎn)樣:用加樣器在膜的粗糙面加Hb液(10uL),點(diǎn)樣距邊緣1.5cm,注意區(qū)分毛面,光面(示教)電泳:點(diǎn)樣線在負(fù)極一側(cè),毛面向下,平衡10min后接電源調(diào)節(jié)電壓至220V電泳20min染色:用麗春紅S染色1分鐘,用酸洗液1分鐘,共漂洗3次,漂洗至底板顯白色后自然干燥結(jié)果觀察HJKAGDEAFA2CA異常正常-+慢速帶快速帶注意事項(xiàng)醋纖膜在加樣前應(yīng)把水分吸干,否則影響區(qū)帶分離的清晰度。電泳時(shí)間不宜太長(zhǎng),應(yīng)靈活掌握。以HbA和HbA2兩區(qū)帶分離清晰為電泳終止的時(shí)間。電流不能過(guò)大,否則會(huì)導(dǎo)致區(qū)帶過(guò)于集中,達(dá)不到分離效果。正常對(duì)照和已知異常Hb對(duì)照(質(zhì)控)。臨床意義與正常比較,發(fā)現(xiàn)異常血紅蛋白區(qū)帶。如HbH,HbE,Hb
Barts,HbS,HbD,HbC等。HbA2增多見于β-地貧,輕度增加亦可見于肝病、腫瘤和某些血液病。HbE病也在HbA2區(qū)帶位置增加,但含量很大(>10%)。HbA2HbA1快速帶制備血紅蛋白液:109mmol/L枸櫞酸鹽抗凝血1ml置于5ml離心管內(nèi)3000r/min離心10分鐘,棄血漿和白細(xì)胞層。以8倍RBC體積的生理鹽水洗滌RBC3次,每次3000r/min離心10分鐘,最后一次3000r/min離心15分鐘,棄上清。壓積RBC中沿管壁加入兩倍蒸餾水,棄上清,重復(fù)2次壓積RBC中沿管壁加入等量蒸餾水,置于振蕩器上震蕩5分鐘,使完全溶血,隨后加入RBC壓積1/2量四氯化碳,置于振蕩器上震蕩5
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