農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化

第六章病毒純化利用各種物理、化學方法，以不使病毒受損傷和失活為前提，去除宿主細胞組分等非病毒雜質，提取出高純度濃縮病毒樣品。病毒微細結構研究病毒抗原蛋白分離純化病毒化學成份及其遺傳物質研究病毒感染分子細節(jié)研究農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第1頁一、病毒純化標準保持感染性含有均一性：結晶形成檢測病毒制備物均一性方法：電鏡觀察：大小、形態(tài)均一超速離心：沉降速率和密度一致，只出現一條沉降帶電泳：顆粒大小及表面電荷均一，只形成一條電泳帶免疫學方法：只與特異性抗體發(fā)生反應大小、形態(tài)、密度、化學組成、分子量、抗原性農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第2頁二、病毒純化理論依據病毒體外表面主要化學組成是蛋白質，可利用蛋白質提純方法純化病毒病毒體含有一定大小、形狀和密度，可利用超速離心技術提純病毒農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第3頁三、病毒純化前預處理1、病毒感染組織、臟器或細胞研磨勻漿超聲波處理重復凍融低速離心去掉細胞碎片2、細胞培養(yǎng)液、雞胚尿囊液低速離心去掉可能含有雜質或直接用于病毒分離純化農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第4頁沉淀法超速離心法超濾法層析法兩相溶劑間分配系數法吸附法電泳法四、病毒純化方法農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第5頁（一）沉淀法主要從稀病毒懸浮液中濃縮病毒。中性鹽沉淀法（鹽析）聚乙二醇沉淀法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法皂土法魚精蛋白沉淀法農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第6頁1、中性鹽沉淀法（鹽析）先用其它方法去除材料中大量雜質，再以高濃度中性鹽溶液鹽析，析出沉淀用緩沖液懸浮后再進行鹽析，重復幾次后，懸浮沉淀，用透析法或其它方法脫鹽。病毒普通在45%以上飽和度硫酸銨溶液中沉淀，且保持感染性。農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第7頁2、聚乙二醇（PEG）沉淀法用于病毒沉淀分子量：-6000將PEG配成50%左右溶液，或直接將固體PEG加于病毒懸液中，使其到達所需濃度，在4℃攪拌過夜，然后離心使病毒沉淀。農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第8頁3、有機溶劑沉淀法乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物原理：A、降低溶液介電常數，從而增加病毒顆粒表面不一樣電荷之間引力，造成其溶解度降低。B、與水作用，破壞蛋白質分子水化膜。優(yōu)點：分辨力高，易除去缺點：易使表面蛋白質變性，溶解脂質農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第9頁4、等電點沉淀法（分辨力不高）原理：病毒粒子在等電點時，所攜帶正電荷與負電荷相互中和，因而失去相互排斥作用而發(fā)生沉淀（分辨力不高）。多數病毒等電點在pH4.０~5.5之間。農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第10頁5、皂土法輪狀病毒皂土在酸性條件下（pH4~4.5)可吸附輪狀病毒，在堿性條件下(pH8.5)，又使其洗脫下來。農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第11頁6、魚精蛋白沉淀法（沉淀直徑大于50nm病毒）魚精蛋白為堿性蛋白，含有攜帶其它蛋白質（直徑大于50nm）共沉淀作用，當向這種沉淀物加入1mol/LNaCl時，其它蛋白質又重新釋放到懸液中，而魚精蛋白依然沉淀。農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第12頁（二）層析法葡聚糖柱層析法凝膠層析法離子交換柱層析法親和層析法農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第13頁（三）兩相溶劑間分配系數法原理：溶質在兩個互不相溶溶劑中分配系數不一樣而選擇性地分配于其中一方。慣用溶劑：葡聚糖硫酸鹽（dextransulphate,Ds)聚乙二醇（PEG）甲基纖維素（MC）聚乙烯醇（PVA）分配體系：Ds-PEG系、Ds-PVA系、Ds-MC系農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第14頁（四）吸附法原理：利用對病毒或對雜質有選擇吸附能力固體吸附劑吸附病毒或吸附雜質，再用一定鹽溶液把它們洗脫下來。

作為吸附劑必須具備特點：有較大表面積和吸附能力較高吸附選擇性便于洗脫性質穩(wěn)定農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第15頁慣用吸附劑：白土磷酸鈣硅藻土紅細胞離子交換樹脂羧甲基纖維素農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第16頁（六）超濾法利用超濾膜將水、鹽及小分子濾過，將一定大小大分子或病毒等顆粒截住從而使后者得到濃縮。優(yōu)點：可用于大容量樣品濃縮能夠在室溫或低溫下操作對被濃縮產物損害小濃縮同時可到達部分純化回收率高可預防外來污染（五）電泳法農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第17頁（七）離心法差速離心速度區(qū)帶離心法密度梯度離心農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第18頁1.差速離心法原理：不一樣大小和比重粒子沉降速度不一樣。用途：從組織培養(yǎng)液、雞胚尿囊液或經過紅細胞吸附釋放病毒懸液中提純病毒。優(yōu)點：可快速處理大量樣品步驟：低速（-3000r/min,20-30min)、中速（10000min,20-30min)去除較大宿主細胞碎片、污染細菌及其它較大雜質。再選擇較高速度離心1-2h使病毒沉淀。農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第19頁速度梯度離心法密度梯度離心法原理沉降與顆粒質量成正比，以物質沉降速度不一樣進行分離沉降與顆粒密度成正比，以物質浮密度不一樣進行分離介質密度小，1-1.3286，預制梯度，不連續(xù)密度大，1-1.9025，連續(xù)梯度離心力場強，離心速度高，使被分離物質易沉降稍強，速度相對低，使CsCl形成梯度，建立沉降擴散平衡離心過程樣品向離心管底沉降樣品停留于介質等密度部位離心時間較短，幾小時到幾十小時較長，十幾小時到數天2.速度梯度離心法與密度梯度離心法農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第20頁速度梯度離心密度梯度離心…………AB農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第21頁五、病毒純化應注意問題1、保持病毒感染性嚴格控制溫度、pH及試劑選擇。2、選取適宜純化試驗起始材料無其它病毒或毒株污染病毒體含量高雜質含量少并易于處理農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第22頁3、依據詳細情況選擇提純方法依據需要純化病毒性質、起始材料特點、研究目標以及試驗室條件等，選擇適宜純化方法。4、建立靈敏病毒判定和測定方法農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第23頁六、偽狂犬病毒濃縮提純1、病毒材料將偽狂犬病病毒接種于PK-15細胞，病變后搜集細胞培養(yǎng)物，重復凍融3次，即為樣品材料。農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第24頁2．病毒提純濃縮去細胞碎片及雜質：將細胞培養(yǎng)物4℃3000r/min離心30min，搜集上清液。硫酸銨沉淀：按100ml病毒液42.5g硫酸銨量加入硫酸銨，攪勻后置4℃冰箱攪拌沉淀過夜，4℃5000r/min離心40min，去上清，沉淀用適量滅菌ddH2O懸浮。透析：將懸浮病毒液裝于透析袋中，于ddH2O或PBS中攪拌透析，每半個小時換一次液，共換5次，第5次透析過夜。農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第25頁濃縮：透析完成后，取出，用聚乙二醇或蔗糖將病毒濃縮至適當體積。超離純化：在離心管中加入不一樣濃度甘油墊層，即先加入45%甘油，再加入5%甘油。加入病毒懸液（應不超出離心管總容積10%）。0-25000r/min離心2h。棄上層液體，沉淀用適量TEN重懸（渦旋或超聲波處理，使沉淀分散）。速度區(qū)帶離心農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第26頁密度梯度離心在離心管中加入不一樣濃度CsCl或蔗糖墊層，再加入病毒懸液，超高速離心。蔗糖密度梯度離心：在離心管中加入20%～60%不連續(xù)蔗糖密度梯度,0-25000r/min離心2h～3h，搜集蔗糖濃度為35%處病毒帶，加入適量緩沖液稀釋后，再次0-25000r/min離心2h，沉淀用適量TEN重懸。

PrV鄂A株電鏡觀察左圖：上帶中PrV粒子右圖：下帶中PrV粒子農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第27頁濃縮（方法二）將經低速離心去掉細胞碎片及雜質病毒懸液直接0-25000r/min離心2h。棄上層液體，沉淀用適量TEN重懸。將重懸病毒液再經梯度離心純化。農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第28頁怎樣利用純化病毒進行下一步研究研究病毒結構研究病毒感染分子細節(jié)病毒粒子標識研究與受體結合研究病毒侵入研究病毒在體內移行農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第29頁病毒純化質譜分析靶蛋白驗證純化病毒是不是只含有病毒蛋白？農業(yè)大學病毒學實驗技術之病毒純化第30頁