分子發(fā)光分析法課件

第六章

分子發(fā)光分析法一、分子熒光與磷光產(chǎn)生過程Luminescenceprocessofmolecularfluorescencephosphorescence二、激發(fā)光譜與熒光光譜Excitationspectrumandfluore-scencespectrum三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)關(guān)系

Relationbetween

fluorescenceandmolecularstructure四、影響熒光強度的因素Factorinfluenced

fluorescence第一節(jié)

分子熒光與磷光Molecularlumine

-scenceanalysis

Molecularfluorescenceandphosphorescence2023/3/14

分子發(fā)光包括熒光，磷光，化學(xué)發(fā)光，生物發(fā)光。

室溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動能級，處于基態(tài)的分子吸收能量（光能、化學(xué)能、電能或熱能）后被激發(fā)為激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)，若返回到基態(tài)時伴隨著光子的輻射，這種現(xiàn)象稱為“發(fā)光”。2023/3/14

概論

室溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動能級，處于基態(tài)的分子吸收能量（光能、化學(xué)能、電能或熱能）后被激發(fā)為激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)，若返回到基態(tài)時伴隨著光子的輻射，這種現(xiàn)象稱為“發(fā)光”。

分子發(fā)光：分子吸收外來能量時，分子的外層電子可能被激發(fā)而躍遷到更高的電子能級，這種處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，它將經(jīng)多種衰變途徑而躍遷回基態(tài)。包括輻射躍遷和非輻射躍遷，在輻射躍遷中伴隨發(fā)光現(xiàn)象，稱為分子發(fā)光。2023/3/14一、熒光與磷光的產(chǎn)生過程由分子結(jié)構(gòu)理論，主要討論熒光及磷光的產(chǎn)生機理。1.分子能級與躍遷分子能級比原子能級復(fù)雜；在每個電子能級上，都存在一系列的振動、轉(zhuǎn)動能級；

用S0表示基態(tài)；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…

表示；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2

…

表示；V=0,1,2,3表示振動能級。

第一節(jié)分子熒光與磷光Molecularfluorescencephosphorescence2023/3/142023/3/142.電子激發(fā)態(tài)的多重度

電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能級低；大多數(shù)有機分子的基態(tài)處于單重態(tài)；

S0→T1

禁阻躍遷，通過其他途徑進入(見能級圖)；。2023/3/14S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫2023/3/143.1非輻射能量傳遞過程振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10-12

s。系間竄越：不同多重態(tài)，有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。改變電子的自旋狀態(tài)。如S1—T1S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫2023/3/14內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重度電子能級間的無輻射躍遷過程。如S2—S1，T2—T1。在10-13～10-11s內(nèi)完成。外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫2023/3/14（2）磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（T1→S0躍遷）。電子由S0進入T1的可能過程：（S0→T1禁阻躍遷）

S0→激發(fā)→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動弛豫→T1發(fā)光速度很慢：10-4～10s。光照停止后，可持續(xù)一段時間S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光磷光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫2023/3/14二、激發(fā)光譜與發(fā)射光譜

Excitationspectrumandfluore-scencespectrum

熒光(磷光)：光致發(fā)光，照射光波長如何選擇？1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線

固定測量波長(選最大發(fā)射波長)，化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與照射光波長的關(guān)系曲線（圖中曲線I）。

激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大。2023/3/142.熒光發(fā)射光譜(或磷光發(fā)射光譜)固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),

化合物發(fā)射的熒光(或磷光強度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。2023/3/14（2）發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量（如能級圖2,1），產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光（如‘2

）。

S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫2023/3/14（3）鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與激發(fā)光譜成鏡像對稱關(guān)系。200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜2023/3/14三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

Relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率（f）：表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力2023/3/14（1）躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生。與躍遷相比，躍遷的大100~1000倍，壽命較短，通過系間竄躍至三重態(tài)的速率也較小，因此躍遷的熒光效率較高。激發(fā)發(fā)射2.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光2023/3/14化合物λ/nm苯0.07283萘0.29321蒽0.46400一般而言，π電子共軛體系越大，熒光效率越高，且熒光光譜紅移。（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移。含→*躍遷能級的芳香族化合物的熒光最強。化合物（在環(huán)己烷中）φf

λ/nm

苯

0.07283

聯(lián)苯

0.18316對-聯(lián)三苯0.933422023/3/14（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強的熒光，酚酞卻沒有。強熒光無熒光2023/3/142023/3/14四、影響熒光強度的環(huán)境因素

Relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure

影響熒光強度的外部因素：1.溶劑的影響

由于溶質(zhì)分子與溶劑分子間的作用，使同一種熒光物質(zhì)在不同的溶劑中的熒光光譜的位置和強度都會有顯著的不同。（1）溶劑的極性:對許多共軛芳族化合物，激發(fā)時發(fā)生了→

*躍遷，其激發(fā)態(tài)比基態(tài)具有更大的極性，隨著溶劑極性的增大，激發(fā)態(tài)比基態(tài)能量下降的更多---熒光光譜向長波移動。（2）氫鍵：溶劑形成氫鍵的能力增大，熒光光譜向短波移動。2023/3/144.內(nèi)濾光作用和自吸收現(xiàn)象

自吸收現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。

內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光的物質(zhì)，就會使熒光減弱，這種現(xiàn)象稱為“內(nèi)濾光作用”，如色胺酸中的重鉻酸鉀。2023/3/145.溶液熒光的猝滅

熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。能引起熒光強度降低的物質(zhì)稱為猝滅劑。（1）碰撞猝滅（動態(tài)淬滅）

M+hγ—M*,M*+Q—M+熱淬滅劑與發(fā)光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子互相碰撞，以能量轉(zhuǎn)移或電荷轉(zhuǎn)移使發(fā)光分子失去激發(fā)能而不能返回基態(tài)。（2）靜態(tài)猝滅

M+Q—MQ非熒光淬滅劑與發(fā)光物質(zhì)的基態(tài)分子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，所產(chǎn)生的絡(luò)合物在實際檢測區(qū)內(nèi)不發(fā)光。（3）轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅三重態(tài)O2（4）發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的猝滅M+Q—發(fā)生電子轉(zhuǎn)移（5）熒光物質(zhì)的自猝滅熒光物質(zhì)濃度較高2023/3/14一、儀器與結(jié)構(gòu)流程Instrumentandgeneral

process

二、熒光分析法和應(yīng)用Fluorescenceanalysisandapplication三、磷光分析法及應(yīng)用Phosphorescenceanalysisandapplication第二節(jié)

分子熒光與磷光

分析法Molecularfluorescenceandphosphorescenceanalysis2023/3/14一、儀器結(jié)構(gòu)流程

測量熒光的儀器主要由四個部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。

特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。基本流程如圖：單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器；光源：氙燈和高壓汞燈樣品池：石英檢測器：光電倍增管。2023/3/141、光源：氙燈和高壓汞燈2、單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器3、樣品池：石英4、檢測器：光電倍增管光源第一單色器第二單色器激發(fā)熒光樣品池檢測系統(tǒng)2023/3/14熒光檢測器有兩個單色器，光源與檢測器呈90度角，以避開激發(fā)光、雜散光的干擾，增加檢測靈敏度。I0IfIt紫外－可見檢測器分光系統(tǒng)(雙單色器)第一單色器作用：選擇激發(fā)波長第二單色器作用：分離出熒光發(fā)射波長樣品池四面透光2023/3/14儀

器

光

路

圖2023/3/14該型儀器可進行熒光、磷光和發(fā)光分析。2023/3/14二、熒光分析方法與應(yīng)用1.特點（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～4個數(shù)量級；檢測下限：0.1～0.001g/cm-3（2）選擇性強既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征激發(fā)光譜；（3）試樣量少

缺點：應(yīng)用范圍小。2023/3/142.定量依據(jù)與方法（1）定量依據(jù)當熒光物質(zhì)濃度很小時，熒光強度If與熒光物質(zhì)濃度c之間的關(guān)系式為：

If=2.3φfI0εbc式中：φf為熒光效率，I0為激發(fā)光的強度，ε熒光物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)，b為試樣池的光程，c為熒光物質(zhì)的濃度。

在一定條件下，φf、I0、ε、b均為常數(shù)，所以上式可寫成：

If=Kc即熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度c成正比。熒光強度和溶液濃度呈線性關(guān)系，只限于極稀的溶液。對于較濃溶液，會產(chǎn)生濃度猝滅現(xiàn)象。2023/3/14（2）定量方法標準曲線法：

配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度，繪制標準曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標準曲線上求出未知試樣的濃度；比較法：在線性范圍內(nèi)，測定標樣和試樣的熒光強度，比較。2023/3/143.熒光分析法的應(yīng)用目前熒光分析大多用于定量分析，由于自身發(fā)射熒光的化合物不多，因此往往利用有機試劑與熒光較弱或不顯熒光的物質(zhì)結(jié)合形成發(fā)熒光的配合物來進行測定。（1）無機化合物的分析

與有機試劑形成配合物后測量；可測量約60多種元素。（2）有機化合物的分析

芳香族化合物具有共軛的不飽和結(jié)構(gòu)，多能發(fā)生熒光，可以直接進行熒光測定；而脂肪族化合物的分子結(jié)構(gòu)較簡單，本身能發(fā)熒光的很少，須與某些試劑反應(yīng)后才能進行分析。2023/3/142023/3/142023/3/14三、磷光分析法及應(yīng)用

與熒光相比，磷光具有兩個特點：（1）磷光輻射的波長比熒光長（2）磷光的壽命比熒光長1.磷光強度與磷光物質(zhì)濃度的關(guān)系

當磷光物質(zhì)濃度很小時，磷光強度Ip與磷光物質(zhì)濃度c之間的關(guān)系式為：

Ip=2.3φpI0εbc

式中：φp為磷光效率，I0為激發(fā)光的強度，ε磷光物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)，b為試樣池的光程。

在一定條件下，φp、I0、ε、b均為常數(shù)，所以上式可寫成：

Ip=Kc

即磷光強度與磷光物質(zhì)的濃度c成正比。2023/3/142.溫度對磷光強度的影響隨著溫度的降低，磷光逐漸增強。3.重原子效應(yīng)使用含有重原子的溶劑或在磷光物質(zhì)中引入重原子取代基，都可以提高磷光物質(zhì)的磷光強度，這種效應(yīng)稱作重原子效應(yīng)。4.低溫磷光用液氮作冷卻劑（77K）2023/3/145.室溫磷光由于低溫磷光需要低溫實驗裝置、溶劑選擇的限制，發(fā)展了以下幾種室溫磷光法：（1）固體表面室溫磷光法此法基于測量室溫下吸附于固體基質(zhì)（載體）上的有機化合物所發(fā)射的磷光。理想的載體是既能將分析物質(zhì)牢固地束縛在表面或基質(zhì)中以增加剛性，并減小三重態(tài)的碰撞猝滅等非輻射去活化過程，而本身又不產(chǎn)生磷光背景。（2）膠束增穩(wěn)的溶液室溫磷光法當向溶液中加入適量的表面活性劑，形成膠束，由于膠束的多相性，改變了磷光團的微環(huán)境和定向的約束力，從而強烈影響了磷光團的物理性質(zhì)，減小了內(nèi)轉(zhuǎn)化和碰撞能量損失等非輻射去活化過程的趨勢，明顯增加了三重態(tài)的穩(wěn)定性，從而可以實現(xiàn)在溶液中測量室溫磷光。2023/3/146.磷光分析儀

和熒光分析儀器基本相似。在熒光分光光度計上配上磷光附件后，即可用于磷光定。（1）試樣室

將試樣放在盛液氮的石英杜瓦瓶內(nèi)，即可用于低溫磷光測定。（2）磷光鏡有些物質(zhì)同時會發(fā)生熒光和磷光，為了能在同時有熒光現(xiàn)象的體系中測定磷光，通常必須在激發(fā)光單色器和液槽之間以及在液槽和發(fā)射光單色器之間各裝一個斬波片，并由一個同步馬達帶動，這種裝置稱作磷光鏡。2023/3/142023/3/147、磷光分析法的應(yīng)用磷光分析法在無機化合物的測定中應(yīng)用較少，它主要用于測定有機化合物。（1）稠環(huán)芳烴分析

采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測定稠環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物（致癌物質(zhì)）；見表（2）農(nóng)藥、生物堿、植物生長激素的分析（3）藥物分析見表2023/3/142023/3/14一、基本原理principle

二裝置與技術(shù)instrumentandtechnology三、化學(xué)發(fā)光分析的特點characteristics第三節(jié)

化學(xué)發(fā)光分析法Chemiluminescence

analysis2023/3/14化學(xué)發(fā)光：

某些物質(zhì)在進行化學(xué)反應(yīng)過程中，由于吸收了反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)能而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，發(fā)射出一定波長的光，這種吸收化學(xué)能使分子發(fā)光的過程稱為化學(xué)發(fā)光。

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)存在于生物體(螢火蟲、海洋發(fā)光生物)中，稱生物發(fā)光(bioluminescence)?；瘜W(xué)發(fā)光分析：

利用某些化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的光發(fā)射現(xiàn)象而建立的一種分析方法。2023/3/14一、基本原理

principle1.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

在化學(xué)反應(yīng)過程中，某些反應(yīng)產(chǎn)物接受化學(xué)能而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，發(fā)射出一定波長的光。

A+B=C+D*D*→D+h（1）能快速地釋放出足夠的能量。能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的物質(zhì)大多為有機化合物，芳香族化合物；化學(xué)發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當，E=170～300kJ/mol；發(fā)光位于可見光區(qū)；（2）反應(yīng)歷程有利于激發(fā)態(tài)產(chǎn)物的形成；（3）激發(fā)態(tài)分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態(tài)；2023/3/142.化學(xué)發(fā)光效率和發(fā)光強度化學(xué)效率：發(fā)光效率：化學(xué)效率主要取決于發(fā)光所依賴的化學(xué)反應(yīng)本身；而發(fā)光效率則取決于發(fā)光體本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，也受環(huán)境的影響。2023/3/14發(fā)光強度

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光強度Icl是以單位時間內(nèi)發(fā)射的光子數(shù)表示，它與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的速率有關(guān)。時刻t的化學(xué)發(fā)光強度(單位時間發(fā)射的光量子數(shù))：

如果反應(yīng)是一級動力學(xué)反應(yīng)，t時刻的化學(xué)發(fā)光強度Icl與該時刻的分析物濃度c成正比，即化學(xué)發(fā)光峰值強度與分析物濃度c成線性關(guān)系。在化學(xué)發(fā)光分析中，常用已知時間內(nèi)的發(fā)光總強度來進行定量分析。2023/3/143.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型（1）氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)主要有O3，NO,S的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可用于監(jiān)測空氣中的O3，NO,NO2，H2S,SO2和CO等.a.一氧化氮與O3的發(fā)光反應(yīng)

NO+O3→NO2*+O2

NO2*→NO2+h發(fā)射的光譜范圍：600～875nm，靈敏度1ng/cm-3。

2023/3/14b.乙烯與O3的發(fā)光反應(yīng)

乙烯與O3反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)甲醛：

CH2O*

→CH2O+h最大發(fā)射波長：435nm；對O3的特效反應(yīng)；線性響應(yīng)范圍1ng/cm-3～1g/cm-3；2023/3/14（2）液相中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機理研究較多，在分析中應(yīng)用最多；可測痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Au、Th等。應(yīng)用最多的發(fā)光試劑：魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）；化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效率：0.15～0.05；魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應(yīng)過程：2023/3/14（1）該發(fā)光反應(yīng)速度慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；利用這一現(xiàn)象可間接測定這些金屬離子。可測痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可檢測低至10-9mol/L的H2O2；（3）間接測定某些生物試樣

氨基酸+O2

酮酸+NH3+H2O2

氨基酸氧化酶

葡萄糖+O2+H2O葡萄糖酸+H2O2

通過測定生成的H2O2，確定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶2