抗豬γ干擾素單克隆抗體的制備及定量抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法的初步建立

報(bào)告內(nèi)容研究背景研究思路與策略試驗(yàn)方法及結(jié)果討論小結(jié)與展望研究成果當(dāng)前1頁(yè)，總共32頁(yè)。研究背景-干擾素（IFN-）是機(jī)體內(nèi)具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能的重要細(xì)胞因子。它主要由激活的T細(xì)胞、激活的NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。豬IFN-全基因編碼166個(gè)氨基酸殘基，包括20aa的信號(hào)肽(Dijkmans,1990)。信號(hào)肽切除后，產(chǎn)生146aa的IFN-單體，分子量為17.3kD，天然活性狀態(tài)的IFN-是由兩個(gè)IFN-單體經(jīng)非共價(jià)交聯(lián)形成的同源二聚體糖蛋白(Boehm,1997)。

-干擾素概述當(dāng)前2頁(yè)，總共32頁(yè)。IFN-γ的細(xì)胞分泌機(jī)制

MHCII+抗原遞呈細(xì)胞將抗原肽遞呈給CD4+T細(xì)胞,使幼稚CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有IFN-γ分泌功能和增殖能力的效應(yīng)Th細(xì)胞。MHCI+抗原遞呈細(xì)胞將抗原肽遞呈給CD8+T細(xì)胞，使后者轉(zhuǎn)化為具有IFN-γ分泌功能和增殖能力、靶細(xì)胞殺傷功能的效應(yīng)CTL細(xì)胞。NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被病原體所攜帶的LPS激活后，亦能分泌IFN-γ。

TCR抗原肽MHCT細(xì)胞抗原遞呈細(xì)胞T細(xì)胞當(dāng)前3頁(yè)，總共32頁(yè)。IFN-檢測(cè)的免疫學(xué)意義機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)藥物的療效評(píng)估細(xì)胞免疫功能分析病原體T細(xì)胞表位鑒定當(dāng)前4頁(yè)，總共32頁(yè)。IFN-γ的免疫學(xué)檢測(cè)方法

抗原捕獲ELISA酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR當(dāng)前5頁(yè)，總共32頁(yè)。ELISPOT原理

YYYYYYYYYYYYYY抗IFN-γ單抗IFN-γPBMC抗原特異性T細(xì)胞酶標(biāo)鏈霉親和素生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體當(dāng)前6頁(yè)，總共32頁(yè)。卵黃抗體的免疫學(xué)特性對(duì)細(xì)菌及哺乳動(dòng)物蛋白抗原具有很高的親和力不與細(xì)菌或哺乳動(dòng)物Fc受體結(jié)合，因而不能激活補(bǔ)體系統(tǒng)不與哺乳動(dòng)物血清中的類風(fēng)濕因子反應(yīng)，與哺乳動(dòng)物IgG和IgM沒有交差反應(yīng)疏水性比IgG強(qiáng)，因而更容易包被于ELISA板和乳膠微球表面穩(wěn)定性好當(dāng)前7頁(yè)，總共32頁(yè)。生物素-親和素系統(tǒng)

生物素-親和素系統(tǒng)是70年代末期發(fā)展起來(lái)的一種新型生物放大系統(tǒng)，其具有以下幾個(gè)顯著特點(diǎn)：

高靈敏度：由于每個(gè)親和素分子可結(jié)合4個(gè)生物素分子，其結(jié)合常數(shù)高達(dá)1015mol/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于抗原抗體的結(jié)合常數(shù)（105-11mol/L），因而該系統(tǒng)具有放大作用，能顯著提高檢測(cè)的靈敏度。

高特異性：親和素和生物素的結(jié)合反應(yīng)很強(qiáng)，并具有高度專一性。加上系統(tǒng)的高靈敏性，因而使試劑經(jīng)得起高倍稀釋，從而大大減少了通常免疫反應(yīng)中出現(xiàn)的非特異性作用。

高穩(wěn)定性：親和素與生物素一旦結(jié)合就很難解離，酸、堿、有機(jī)試劑、蛋白酶等均不影響二者的結(jié)合作用。

當(dāng)前8頁(yè)，總共32頁(yè)。本試驗(yàn)研究目的和意義本研究旨在應(yīng)用生物素-親和素放大系統(tǒng)，以單克隆抗體和卵黃抗體為基礎(chǔ),建立一套檢測(cè)豬IFN-的定量抗原捕獲ELISA方法，為進(jìn)一步建立豬IFN-的ELISPOT檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

當(dāng)前9頁(yè)，總共32頁(yè)。研究思路與策略YY雜交瘤腹水高免卵黃抗體免疫親和層析生物素標(biāo)記卵黃抗體親和純化單克隆抗體sandwichELISA原核表達(dá)IFN-γ

親和層析柱當(dāng)前10頁(yè)，總共32頁(yè)。研究報(bào)告將在大腸埃希氏菌中表達(dá)的重組豬-干擾素（rpIFN-）免疫8周齡BALB/c鼠3次后，取脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按標(biāo)準(zhǔn)程序融合后，用表達(dá)的重組豬-干擾素和豬-干擾素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行交叉篩選，獲得1株能穩(wěn)定分泌抗豬IFN-單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株

。利用Western-blot分析和間接免疫熒光分析對(duì)該株單克隆抗體進(jìn)行特異性鑒定?？关i-干擾素單克隆抗體的制備當(dāng)前11頁(yè)，總共32頁(yè)。單抗的Western-blot鑒定1.預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Fermentas);2.重組豬IFN-γ3.豬IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品（R&Dsystems);4.BSA二聚體?融合標(biāo)簽?CF-IFN-γ本單克隆抗體能夠被豬IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品所識(shí)別當(dāng)前12頁(yè)，總共32頁(yè)。單抗的間接免疫熒光（IFA）分析ABA：PMA刺激PBMC；B：未刺激PBMC本單克隆抗體能夠被天然IFN-所識(shí)別分離豬PBMCPMA誘導(dǎo)單抗孵育熒光二抗當(dāng)前13頁(yè)，總共32頁(yè)。卵黃抗體效價(jià)測(cè)定高滴度抗體出現(xiàn)時(shí)間早，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)當(dāng)前14頁(yè)，總共32頁(yè)?？乖禺愋訧gY的純化

HCLCSDS薄層掃描分析1.預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)2.(NH4)2SO4粗提IgY3.免疫親和純化的IgY卵黃分離氯仿脫脂硫酸氨粗提親和純化抗原特異性IgY的產(chǎn)率為0.26mg/mL卵黃液

當(dāng)前15頁(yè)，總共32頁(yè)。生物素標(biāo)記的卵黃抗體的制備生物素標(biāo)記的卵黃抗體的洗脫曲線抗體透析生物素標(biāo)記抗體脫鹽HABA分析平均每個(gè)IgY分子標(biāo)記4.37個(gè)生物素分子

當(dāng)前16頁(yè)，總共32頁(yè)。生物素標(biāo)記卵黃抗體的效價(jià)注：a.抗體起始濃度為500ng/ml；b.陰性對(duì)照為相同濃度的非標(biāo)記卵黃抗體；c.OD490nm>4.0

生物素標(biāo)記的卵黃抗體具有良好的生物活性和較高的抗體滴度

當(dāng)前17頁(yè)，總共32頁(yè)?？关iIFN-單克隆抗體的純化

HCLC薄層掃描分析1.蛋白Marker；2.小鼠腹水；3.免疫親和純化的單克隆抗體

SDS親和層析法純化的單克隆抗體純度為95.1%,與A/G蛋白層析純化的抗體純度相當(dāng)

當(dāng)前18頁(yè)，總共32頁(yè)。單克隆抗體包被濃度的選擇

通過(guò)單抗抗包被濃度-被檢物濃度方陣試驗(yàn)，確定單克隆抗體的最佳包被濃度為8ug/mL

當(dāng)前19頁(yè)，總共32頁(yè)。生物素標(biāo)記卵黃抗體工作濃度的選擇

固定包被抗體的濃度(8ug/mL),通過(guò)生物素標(biāo)記卵黃抗體濃度--被檢物濃度方陣試驗(yàn)，確定生物素標(biāo)記卵黃抗體的最佳稀釋倍數(shù)為2000,即工作濃度為0.25ug/mL

當(dāng)前20頁(yè)，總共32頁(yè)。封閉劑的選擇

采用捕獲抗體及檢測(cè)抗體的最佳工作濃度，比較不同封閉劑的封閉效果，采用1%Casein-PBS作封閉劑，其背景最低，信噪比最高。

當(dāng)前21頁(yè)，總共32頁(yè)。rpIFN-檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

以本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化好的ELISA反應(yīng)條件，繪制OD450值--rpIFN-抗原濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。被檢抗原濃度在7.8-1000ng/mL范圍內(nèi)能形成一條近似線性曲線。

當(dāng)前22頁(yè)，總共32頁(yè)。靈敏度的確定用稀釋液作為空白對(duì)照，共設(shè)24個(gè)重復(fù)。則檢測(cè)靈敏度為（OD450平均值+2SD）在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所對(duì)應(yīng)的rpIFN-濃度。24個(gè)空白對(duì)照的OD450平均值為0.058，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0041，則（OD450平均值+2SD）值為0.066，其對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線上rpIFN-的濃度為7.8ng/mL

當(dāng)前23頁(yè)，總共32頁(yè)。特異性試驗(yàn)（一）目前只對(duì)商品化人IFN-γ樣品進(jìn)行了特異性試驗(yàn)。應(yīng)用本系統(tǒng)檢測(cè)106IU/mL的該樣品的OD450平均值為0.086，而陰性對(duì)照的平均值為0.059，因而可判定為無(wú)交叉反應(yīng)。當(dāng)前24頁(yè)，總共32頁(yè)。特異性試驗(yàn)（二）

應(yīng)用本試實(shí)驗(yàn)所建立的檢測(cè)系統(tǒng)和商品化的檢測(cè)小鼠IFN-的ELISPOT試劑盒檢測(cè)經(jīng)系列稀釋的ConA樣品。

ConA對(duì)基于辣根過(guò)氧化酶的ELISA檢測(cè)系統(tǒng)具有交叉反應(yīng)當(dāng)前25頁(yè)，總共32頁(yè)。臨床檢測(cè)應(yīng)用本ELISA方法對(duì)四頭接種rPRV-HA豬連續(xù)四周的免疫血清進(jìn)行-干擾素檢測(cè)。

在接種重組病毒后一周，血清中-干擾素水平迅速升高，隨后總體呈下降趨勢(shì)

當(dāng)前26頁(yè)，總共32頁(yè)。討論本實(shí)驗(yàn)以帶有融合標(biāo)簽和信號(hào)肽的rpIFN-為抗原，以rpIFN-和不含任何庸余序列的豬IFN-標(biāo)準(zhǔn)品交叉對(duì)單克隆抗體進(jìn)行篩選和鑒定，既節(jié)省了昂貴的標(biāo)準(zhǔn)抗原，又減少了單克隆抗體篩選過(guò)程中不必要的時(shí)間浪費(fèi)本實(shí)驗(yàn)采用免疫親和層析的方法從小鼠腹水中純化單克隆抗體，從而保證了所得抗體的特異性用雞作宿主,高滴度抗體出現(xiàn)時(shí)間早，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，因而可實(shí)現(xiàn)抗體的大規(guī)模生產(chǎn)ConA能結(jié)合含α-D-呋喃甘露糖和α-D-呋喃葡萄糖糖基的糖蛋白或多糖，而抗體分子，辣根過(guò)氧化酶（HRP）富含甘露糖殘基，這可能就是本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA方法對(duì)ConA產(chǎn)生交叉反應(yīng)的直接原因當(dāng)前27頁(yè)，總共32頁(yè)。結(jié)論成功制備了一株抗豬-干擾素的單抗，該單抗能夠被商品化豬IFN-和體外誘導(dǎo)的IFN-所識(shí)別利用免疫親和層析純化得到豬-干擾素特異性的卵黃抗體，平均每個(gè)抗體分子可標(biāo)記4.37個(gè)生物素分子以親和純化的抗豬-干擾素單抗作為捕獲抗體，生物素標(biāo)記的卵黃抗體作為檢測(cè)抗體，初步建立了豬-干擾素定量抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法，其最小檢出濃度可達(dá)7.8ng/mLConA對(duì)基于辣根過(guò)氧化酶的ELISA檢測(cè)系統(tǒng)具有交叉反應(yīng)當(dāng)前28頁(yè)，總共32頁(yè)。致謝

本實(shí)驗(yàn)是在哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物二室完成的。感謝導(dǎo)師童光志研究員和陳煥春教授三年來(lái)對(duì)我辛勤的培育和無(wú)私的幫助！

當(dāng)前29頁(yè)，總共32頁(yè)。發(fā)表論文1.余斌，張強(qiáng)，閆麗萍，陳煥春，童光志.抗豬γ-干擾素單克